стерильный аутологичный, аллогенный или ксеногенный имплантат и способ его изготовления

Формула изобретения

1. Бесклеточный стерильный практически дегидратированный и, по меньшей мере частично, денатурированный матрикс, полученный из ткани животного и содержащий, преимущественно, коллаген, фибриллы которого имеют такую же структурную организацию, как и в оригинальной ткани, предназначенный для применения в качестве временного имплантата в медицине и ветеринарии, отличающийся тем, что он претерпевает анизотропные изменения своих измерений во время гидратации.

2. Бесклеточный матрикс по п.1, отличающийся тем, что во время анизотропного изменения своих измерений во время гидратации два наибольших измерения остаются практически неизменными или уменьшаются, в то время как наименьшее измерение увеличивается вместе с увеличением объема матрикса.

3. Бесклеточный матрикс по п.2, отличающийся тем, что временный имплантат имеет преимущественно плоскую форму, а его опорная поверхность определяется двумя его наибольшими измерениями, в то время как его толщина определяется наименьшим его измерением.

4. Бесклеточный матрикс по п.1, отличающийся тем, что во время гидратации два наименьших измерения увеличиваются, в то время как наибольшее измерение остается практически неизменным или уменьшается.

5. Бесклеточный матрикс по п.4, отличающийся тем, что временный имплантат имеет преимущественно продолговатую форму, такую как брусок или цилиндр, поперечное сечение которой определяется двумя наименьшими измерениями, такими как, например, диаметр, в то время как ее длина или высота определяется наибольшим измерением.

6. Бесклеточный матрикс по п.1, отличающийся тем, что матрикс в дегидратированном состоянии имеет порозность менее 70 об.%, предпочтительно, менее 60 об.%, и, наиболее предпочтительно, менее 50 об.%.

7. Бесклеточный матрикс по п.1, отличающийся тем, что фибриллы коллагена, по крайней мере, в дегидратированном состоянии, ориентированы, преимущественно, в направлениях, в которых коэффициент линейного расширения при гидратации имеет наименьшее значение, и, в основном, перпендикулярно направлению, в котором коэффициент линейного расширения при гидратации имеет наибольшее значение.

8. Бесклеточный матрикс по п.1, отличающийся тем, что матрикс в дегидратированном состоянии имеет содержание воды менее 20 мас.%, предпочтительно, менее 10 мас.% и, наиболее предпочтительно, менее 5 мас.%.

9. Бесклеточный матрикс по п.1, отличающийся тем, что он также содержит умягчающие, консервирующие или бактерицидные добавки.

10. Бесклеточный матрикс по п.9, отличающийся тем, что бактерицидные добавки содержат серебро, предпочтительно, в коллоидном состоянии, и, наиболее предпочтительно, в форме комплекса серебро-белок.

11. Бесклеточный матрикс по п.9, отличающийся тем, что указанные умягчающие или консервирующие добавки содержат соединения, смешивающиеся с водой, такие как DMSO или полигидроксильные соединения, выбранные из группы гликоля, глицерина или их производных, триэтаноламина и сахаридов.

12. Бесклеточный матрикс по п.1, отличающийся тем, что при контакте с подходящими водными жидкостями матрикс способен к объемному расширению, с коэффициентом объемного расширения более 1,1, предпочтительно, более 1,5.

13. Бесклеточный матрикс по п.1, отличающийся тем, что при контакте с подходящими водными жидкостями матрикс способен гидратироваться до состояния, в котором он содержит более 33 мас.% воды, предпочтительно, более 50 мас.% воды.

14. Бесклеточный матрикс по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что наивысший коэффициент линейного расширения более чем на 10% выше, предпочтительно, более чем на 30% выше наименьшего коэффициента линейного расширения.

15. Бесклеточный матрикс по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что наивысшие коэффициенты линейного расширения имеют величину более 1,2, предпочтительно, более 1,5, в то время как наименьшие коэффициенты линейного расширения имеют величину менее 1,1, предпочтительно, менее 1,05.

16. Бесклеточный матрикс по п.1, отличающийся тем, что его твердый материал (сухое вещество) состоит преимущественно из белков.

17. Бесклеточный матрикс по п.16, отличающийся тем, что белки включают в себя преимущественно коллаген.

18. Бесклеточный матрикс по п.16, отличающийся тем, что его материал (сухое вещество) содержит от 70 мас.% до 95 мас.%, предпочтительно, от 80 мас.% до 90 мас.% белков коллагенового типа.

19. Бесклеточный матрикс по п.16, отличающийся тем, что его материал (сухое вещество) содержит, помимо белков, также незначительную фракцию липидных соединений, включая липопротеины и фосфолипиды.

20. Бесклеточный матрикс по п.16, отличающийся тем, что его белковый компонент является, по меньшей мере частично, денатурированным.

21. Бесклеточный матрикс по п.16, отличающийся тем, что по меньшей мере часть его белкового компонента является поперечно сшитой в результате взаимодействия с альдегидами или поливалентными катионами.

22. Бесклеточный матрикс по п.1, отличающийся тем, что животное представляет собой млекопитающее.

23. Бесклеточный матрикс по п.4, отличающийся тем, что млекопитающее представляет собой свинью.

24. Бесклеточный матрикс по п.1, отличающийся тем, что животная ткань представляет собой кожу, плаценту, перикард, твердую мозговую оболочку, кишку, сухожилие или хрящ.

25. Бесклеточный матрикс по п.2, отличающийся тем, что временный имплантат представляет собой покрытие для области раны, например ожога.

26. Бесклеточный матрикс по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно включает в себя клетки млекопитающего.

27. Бесклеточный матрикс по п.1, отличающийся тем, что по завершении своей функции имплантат саморазрушается посредством биологической деградации.

28. Бесклеточный матрикс по п.25 и/или 26, отличающийся тем, что животное представляет собой свинью, а культивированные клетки млекопитающего представляют собой человеческие аутологичные или аллогенные кератиноциты.

29. Способ изготовления бесклеточного стерильного, практически дегидратированного матрикса и, по меньшей мере частично, денатурированного матрикса, полученного из ткани животного и включающего в себя, преимущественно, коллагеновые структуры, по любому из пп.1-26, отличающийся тем, что ткань животного обрабатывают с использованием способа, включающего следующие этапы:

а) сбор ткани;

b) удаление клеток с использованием воздействия ферментов, поверхностно-активных агентов, кислот, щелочей, гипотонических водных растворов или их комбинаций, во время формирования бесклеточного матрикса;

c) дегидратация бесклеточного матрикса посредством удаления значительной части воды, при механическом натяжении матрикса в одном или более выбранных направлениях;

d) частичная денатурация коллагеновых структур в бесклеточном матриксе посредством воздействия повышенной температуры, органических соединений, поливалентных катионов или их комбинаций, при механическом натяжении матрикса в одном или более выбранных направлениях; или при поддержании измерений матрикса в выбранных направлениях на практически постоянном уровне;

e) стерилизация практически дегидратированного и по меньшей мере частично денатурированного матрикса с использованием ионизирующего излучения.

30. Способ по п.29, отличающийся тем, что частичную денатурацию коллагеновых структур осуществляют с использованием органических соединений, смешивающихся с водой, выбранных из группы, состоящей из алифатических спиртов от С₁ до С₄, алифатических альдегидов, включая формальдегид и глутаровый альдегид, алифатических кетонов, включая ацетон, и эфиров, включая диметиловый эфир, диэтиловый эфир, диоксан и тетрагидрофуран.

31. Способ по п.29, отличающийся тем, что частичную денатурацию коллагеновых структур осуществляют при температурах от 15°С до 90°С, предпочтительно, от 30°С до 70°С.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Изобретение относится к заживлению ран и регенерации тканей. Конкретно оно относится к стерильному, дегидратированному, бесклеточному имплантату (трансплантату), который во время его регидратации водой или жидкостями организма претерпевает анизотропное расширение. Продукт указанного типа можно назвать также имплантатом или трансплантатом в зависимости от контекста и правил, принятых в различных областях экспертизы. В настоящей заявке оба термина используются в соответствии с контекстом; однако важно помнить, что они являются взаимозаменяемыми. Имплантат стерилизуют с использованием облучения, практически в дегидратированном состоянии, предпочтительно, с использованием ускоренных электронов. Имплантат можно получать из тканей различных животных, особенно из тканей млекопитающих, таких как, например, ткани человека или свиньи, таких как, например, кожа, плацента, перикард, брюшина, стенка кишки, сухожилие, кровеносный сосуд и т.д. Имплантат, согласно изобретению, является пригодным для использования в медицине и ветеринарии, например, в качестве временной повязки на раны и ожоги, для восстановления, замещения или регенерации тканей, а также в качестве субстрата для культивирования клеток в лабораторных условиях.

Уровень техники

Ткани и органы давно и широко используются для трансплантации при ряде показаний. Одна из хорошо разработанных методик представляет собой аутотрансплантацию, когда собственную ткань пациента (например, кожу, кость, вену или жировую ткань) перемещают из одного места в другое для замещения ткани. Это не всегда возможно, однако и в ряде случаев пациенту необходим трансплантат (например, сердце, почка, сетчатка и т.п.) от подходящего донора. Главными проблемами указанных так называемых аллотрансплантатов являются отторжения тканей и все чаще нехватка доноров из-за сильно возросшей в них потребности. В силу этого предпринимаются попытки различными способами заменить натуральные аллотрансплантаты. Например, возможно культивирование аутотрансплантатов из клеток пациента с использованием тканевой инженерии. Указанные аутотрансплантаты легко преодолевают иммунный барьер, однако у них есть ряд недостатков: необходимость забора ткани у пациента (биопсия), трудоемкое и дорогостоящее культивирование и большой промежуток времени от взятия биопсии до использования трансплантата. Указанную методику широко используют для замещения кожи при ожогах 3-й степени, в то время как в случае других тканей или органов указанная методика на данный момент времени является экспериментальной. Например, патенты США № 6878383, 6432710, 5858390, 5665372 и 5660850 (Boss, Jr. et al.) описывают методику и средства имплантации аутологичных фибробластов с целью вызвать гиперплазию ткани пациента.

Аутотрансплантацию с использованием искусственно созданного эпидермального слоя кожи используют для лечения пациентов с ожогами в течение ряда лет. В 1979 году Rheinwald и Green (Green H, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979; 76: 5665-8) разработали способ серийного культивирования человеческих кератиноцитов для аутотрансплантации. С 1981 г. аутологичные культивированные эпидермальные трансплантаты используются в США для заживления обширных ожогов (O'Connor NE, et al., Lancet 1981; 1:75-8). Недостатком методики является длительный интервал времени, необходимый для культивирования аутологичных кератиноцитов, непрочность культивата, трудность манипуляций, высокая чувствительность к антибиотикам, инфекции и другим стрессам и трудность оценки ассимиляции трансплантата (Navsaria HA, et al., Trends in Biotechnology 1995; 15: 91-100). Описаны, таким образом, следующие различные улучшения методики.

Патент США № 4299816 (M.G. Eisinger) описывает модифицированное заживление ожогов с использованием трансплантатов из искусственно культивированных эпидермальных клеток. Патент США № 5716411 (Orgill et al.) описывает метод заживления, ведущий к регенерации кожи при ожогах и повреждениях, с использованием биосинтетического покрытия, состоящего из коллагенового матрикса и гликозаминогликанов, которое позволяет осуществлять проникновение клеток и кровеносных сосудов из заживляющейся ткани, с одной стороны, и использование пластин из аутологичных кератиноцитов, с другой стороны. WO 2006/107188 A1 (L. Lurvink et al.) описывает непористую полипептидную пленку, пригодную для культивирования клеток, и последующее ее использование для заживления ран и ожогов. Недавний обзор указанных методик можно найти в TISSUE ENGINEERING Vol. 12, № 9, 2006 Update on Tissue-Engineered Biological Dressings, M. Ehrenreich and Z. Ruszczak.

Не только аутологичные, но также и аллогенные культивированные эпидермальные трансплантаты оказывают мощное заживляющее действие на глубокие ожоги дермы, места взятия биопсий, язвы голени и другие дефекты кожи (Bolivar-Flores J. et al., Burns 1990; 16: 3-8; Matouskova E. Et al., Burns 1993; 19: 118-23.4,5).

Успех процедуры зависит также от выбора донорских клеток. P. Brychta et al. описывают в патенте Чехии № CZ 282711 культивированный эпидермальный аллотрансплантат из эмбриональных или фетальных клеток для заживления дефектов и ран кожи, главным образом, в соответствии с процедурой Rheinwald и Green, но с использованием аллогенных клеток, которые были хорошо восприняты пациентом.

Имеют место также попытки повысить механическую устойчивость и жизнеспособность кератиноцитов (например, посредством культивирования на синтетическом субстрате) и разработать методику, которая сделала бы возможной перманентную ассимиляцию культивированной ткани в ожоги 3-й степени. Одним примером субстрата, используемого для культивирования кератиноцитов, является мембрана на основе гиалуроновой кислоты (Laser skin, FIBIA, Италия), различные типы коллагеновых матриксов, комбинированных с фибробластами, или также различные субстраты, изготовленные из синтетических полимеров (например, экспериментальная pHEMA в клинике ожоговой медицины, FNKV в Праге 10). Для заполнения глубоких ожогов разработаны заместители дермы, такие как Integra (коллаген, комбинированный с гликозаминогликаном хондроитин-6-сульфатом и аллогенными фибробластами; Integra LifeSciences Corporation, Plainsboro, New Jersey, США), Dermagraft (полигалактин с засеянными дермальными аллогенными фибробластами; Adbanced Tissue Sciences, La Jolla, CA, США) или уже упоминавшийся AlloDerm - замороженный аллогенный дермис (LifeCell Corporation, The Woodlands, TX, США). Однако все указанные заместители дермы должны быть покрыты тонким аутологичным дермо-эпидермальным трансплантатом во время второго этапа (после 2-3 недель васкуляризации); покрытие ожогов 3-й степени с использованием аллогенных культиватов до настоящего времени не было успешным.

Другим решением проблем аллотрансплантации является использование ткани или органов от видов, не являющихся человеком, так называемая ксенотрансплантация. В указанном случае также необходимо преодолеть отторжение чужеродной ткани иммунной системой, и также необходимо предотвратить возможность передачи вызывающих заболевания микробов и вирусов от донора пациенту. Большое внимание уделяется предотвращению возможности передачи прионов от животных человеку (например, известного «коровьего бешенства»). С другой стороны, большое преимущество заключается в том, что ткани и органы животных являются значительно более доступными по сравнению с тканями и органами человека.

Хорошо известным примером ксенотрансплантата являются клапаны сердца свиньи, которые используются для замены клапанов сердца человека. Клапаны свиньи подвергаются поперечной сшивке с использованием глутарового альдегида (например, патент США № 4076468, Liotta et al.; патент США № 4247292, W.A. Angell), что приводит к нескольким желательным результатам: подавляется реакция отторжения в организме, повышается гидролитическая и ферментативная стабильность ксенотрансплантата, и, помимо этого, глутаровый альдегид действует как химический стерилизующий агент. Одним из недостатков указанного способа является изменение механических свойств ткани и, в некоторых случаях, даже длительное высвобождение токсичного глутарового альдегида из нерастворимых полиальдегидов, которые могут образовываться в течение процесса и не могут быть удалены простым экстрагированием.

Значительная часть трансплантатов используется в форме так называемых «биологических покрытий» для повязки на рану и получающейся основы для заживления. В зависимости от природы раны и других обстоятельств используют биологические, синтетические и полусинтетические покрытия. Биологические покрытия обычно считаются наиболее эффективными. Типичным биологическим покрытием для заживления, например, ожогов является кожа млекопитающего, но особенно человеческая кожа (аллотрансплантат) или кожа свиньи (ксенотрансплантат) различной толщины, отобранная от трупов и сохраняемая в свежем виде при низких температурах в течение короткого периода времени или даже в течение более продолжительного периода времени, будучи замороженной. Имеется большой опыт применения ксенотрансплантатов из кожи свиньи.

«Живые» повязки на рану (т.е. необработанные аллотрансплантаты или ксенотрансплантаты, содержащие все компоненты живой кожи) являются очень эффективными, однако их недостатком является ограниченный срок хранения и возможность передачи инфекции. Для ряда пациентов были предложены определенные решения, например, продукты AlloDerm и XenoDerm от LifeCell Corp., Техас, США, на основе способа криоконсервации согласно патенту США № 4865871 (S. Livesey et al.). Указанный способ делает возможным получать замороженные и, возможно, лиофилизированные ткани и клетки без повреждения их структуры или функции.

Другим способом является хранение кожи свиньи в глицерине в присутствии нитрата серебра при комнатной температуре, как описано в патентной заявке CN 19951010722 (Kai Cao).

Стерилизация кожи свиньи (после очистки и обработки с использованием углеводородов) в растворе перхлората натрия или пероксида водорода с использованием гамма-излучения из источника Со⁶⁰ описана в патентной заявке TW 199001117733 (Chang Hong Chi et al.).

Другие способы стерилизации кожи свиньи для медицинского использования описаны в патентной заявке CN 19921005926 (Guohui Li et al.), которая описывает стерилизацию во влажном состоянии с использованием источника излучения кобальта, с последующим хранением при низких температурах или лиофильную сушку с последующим хранением в глицерине при комнатной температуре.

Консервация с использованием глицерина также рекомендуется для человеческой плаценты (амниона), используемой для аллотрансплантатов в Deutches Institut fur Zell- und Gewebeersatz gGmbH (Delitzcher St 141, 04128 Leipzig, SRN).

Документ UA 12391U (E.Y. Fistal et al.) описывает заживление некротических ран после глубоких ожогов с использованием лиофилизированной кожи свиньи.

Биологические повязки на раны на основе коллагена для заживления ран, включая ожоги, также описаны в документах RU 2185179 и RU 2124354.

Проблему стерильности и срока хранения можно смягчить удалением клеток из трансплантата, которые, таким образом, становятся частично или полностью бесклеточными. Одну из попыток разрешить указанную проблему можно найти в патентном документе № CN 20031124306 (Hu Jie), описывающем ксенотрансплантат как биологическую повязку для ран и ожогов. Ткань животного, такую как кожа, стенка тонкой кишки или плацента, можно частично избавить от клеток, согласно упомянутому выше изобретению, путем использования воды или раствора детергента, и это осуществляют на поверхности, которая будет в контакте с раной. Клеточная структура других частей, таких как эпидермис, будет сохранена. Затем ткань будет подвергаться поперечной сшивке с использованием подходящего агента, такого как глутаровый альдегид, промываться и храниться во влажном состоянии при температуре ниже 4°С.

Другой документ, CN 20051126108 (Dong Qun Lin), описывает способ удаления клеток из кожи млекопитающего посредством повторного воздействия раствора NaOH с концентрацией от 2 Н до 5 Н, с последующим промыванием в растворе детергента и в воде.

Другой документ, CN 20041022506 (Dai Weihua et al.), описывает способ изготовления биоразлагаемого бесклеточного дермиса с использованием комбинированного воздействия ферментов, щелочей и других химических агентов.

Опубликованная заявка US 20050186286 (Yoshihiro Takami), описывает способ удаления клеток из кожи млекопитающего (например, человека или свиньи) с использованием комбинированного воздействия протеолитических ферментов и детергентов; изготовленная таким образом кожа предназначена для использования в качестве аллотрансплантата или ксенотрансплантата для заживления ожогов. Стерилизацию осуществляют последующим погружением бесклеточного дермиса в раствор азида.

Сходным бесклеточным ксенодермическим матриксом является OASIS, изготовленный AelsLife, который обеспечивает каркас для пространственной миграции клеток. Указанное биологическое покрытие для ран, которое, согласно производителю, содержит важные неклеточные соединения и структуры, присутствующие в живой коже, изготавливают лиофилизацией дермиса свиньи после удаления клеток ферментами и детергентами.

В биосинтетической повязке E*Z DERM от Brennen Medical Inc. используется ксенотрансплантат дермиса свиньи, обработанного поперечной сшивкой коллагена с использованием альдегидов.

Патентный документ JP19900247300 (Koide Mikio) описывает биологическое покрытие, в котором используется матрикс из денатурированного коллагена, полученный из бесклеточного дермиса крупного рогатого скота посредством поперечной сшивки и термической денатурации коллагеновых структур. Указанная структура, согласно процитированному изобретению, является пригодной для засевания аутологичными кератиноцитами для более высокой заживляющей эффективности.

Другие попытки разрешения проблемы представляли собой различные полусинтетические заменители кожи, например, каркас из восстановленного коллагена крупного рогатого скота, засеянный человеческими фибробластами (т.е. упомянутая выше повязка INTEGRA).

Другим примером комбинированного трансплантата является «рекомбинированная кожа» (RK) согласно патенту CZ № 281176. RK изготавливают с использованием культивирования человеческих кератиноцитов в не содержащем клеток дермисе свиньи. (Burns 1993; 19: 118-23). Высушенный дермис используют для культивирования человеческих кератиноцитов и после культивирования дермис со слоем кератиноцитов (или RK) отделяют от чашки Петри и наносят на рану. RK наносят таким образом, чтобы кератиноциты контактировали с раной, а дермис находился снаружи («вверх дном»). По сравнению с простыми эпидермальными трансплантатами RK демонстрирует преимущества более высокой прочности, открепления от чашки Петри без ферментативного воздействия и легкого манипулирования. Преимуществом по сравнению с культурами кератиноцитов на синтетических субстратах и гелях на основе коллагена является то, что консистенция RK аналогичная коже, и это обеспечивает отличную адгезию к ране и гемостатический эффект. Возможно изготавливать RK с использованием как аутологичных, так и аллогенных кератиноцитов. Кератиноциты культивируют на эпидермальной стороне эпидермиса, т.е. там, где базальная мембрана отделяет дермис от эпидермиса. Автор процитированного выше изобретения замечает, что не содержащий клеток дермис можно стерилизовать с использованием гамма-излучения для более длительного хранения при комнатной температуре и большей безопасности. Недостатком стерилизованного с использованием гамма-излучения дермиса является, однако, его частичная деградация и утрата прочности во влажном состоянии.

Сходная комбинированная биологическая повязка на ожоги описана в патентной заявке TW 20000118374 (Yang Mei-Ru et al.), в которой живые человеческие фибробласты на бесклеточном дермисе свиньи комбинируют с человеческими кератиноцитами, культивированными на стороне базальной мембраны бесклеточного матрикса.

Главной проблемой, препятствующей широкому принятию использования указанных биологических материалов, является невозможность использования рутинного и надежного способа стерилизации. Другой специфической проблемой, препятствующей более широкому использованию упомянутых выше материалов, является ограниченный или требующий особых условий срок их хранения и, не в последнюю очередь, затраты на их производство. Сложной проблемой является также то, что дегидратированные материалы набухают изотропно во время регидратации, т.е. (относительно) одинаково увеличиваются по всем измерениям трансплантата после регидратации. Настоящее изобретение решает указанные проблемы.

Сущность изобретения

Заявители установили, что присутствие трансплантированных аллогенных или аутогенных клеток не всегда является необходимым для заживления ран и регенерации тканей, если имеется подходящий материал, который будет стимулировать, поддерживать и направлять размножение, дифференцировку и миграцию собственных клеток пациента. Согласно настоящему изобретению, указанный материал представляет собой особым образом обработанный бесклеточный коллагеновый матрикс, полученный из аутологичного, аллогенного или доже ксеногенного биологического материала. Согласно настоящему изобретению, матрикс состоит, главным образом, из коллагена и родственных белков, таких как эластин, фибрин или кератин. Указанные компоненты матрикса и их концентрации меняются в зависимости от происхождения ткани и способа ее обработки и для простоты будут называться «коллагеном», поскольку во всех случаях коллаген является главным компонентом матрикса. Помимо белков («коллагена») матрикс содержит также некоторое количество жиров и липопротеинов (до 20 мас.%), некоторое количество сахарных компонентов (полисахаридов, гликопротеинов и гликопротеогликанов) и соли. Содержание белков обычно составляет от 70% (мас.) до 95% (мас.), предпочтительно, от 80% до 90% (мас.).

Согласно изобретению, бесклеточный матрикс конкретно характеризуется тем, что он является практически дегидратированным и состоит, главным образом, из коллагена, фибриллы которого демонстрируют структурную организацию, сходную со структурной организацией оригинальной ткани, но, кроме того, они также являются частично денатурированными и, по крайней мере, в дегидратированном состоянии являются предпочтительно ориентированными в определенном выбранном направлении или направлениях. Частичная денатурация является предпочтительной, поскольку она увеличивает устойчивость к биологической деградации, поэтому фибриллы обеспечивают больше времени для миграции и прикрепления клеток хозяина в ходе заживления. Слишком быстрая деградация имплантата может оставить за собой фокус воспаления, который будет плохо заживать и может привести к образованию рубца. Частичная денатурация фибрилл коллагена также повышает механическую прочность во влажном состоянии.

Ориентация фибрилл коллагена также сообщает имплантату более высокую прочность в выбранном направлении, и она направляет скорее миграцию и диссеминацию клеток по поверхности имплантата, чем их проникновение в имплантат. Это подтверждается также тем фактом, что бесклеточный матрикс по настоящему изобретению обладает низкой порозностью в дегидратированном состоянии по сравнению с лиофилизированными биологическими покрытиями на раны, порозность которых обычно выше 75% (по объему). Согласно изобретению порозность имплантата составляет менее 70% (по объему), предпочтительно менее 60% (по объему) и даже более предпочтительно менее 50% (по объему). Низкая порозность и благоприятная ориентация фибрилл являются важными, особенно для имплантатов, используемых в качестве биологических покрытий на раны, например, ожоги, которые, как предполагают, спонтанно отделяются по окончании заживления. Регенерация эпидермального слоя требует миграции кератиноцитов от краев раны в области заживления, которые представляют собой область контакта между раной и поверхностью имплантата. Инфильтрация клеток в структуру имплантата не будет благоприятной, поскольку она может приводить к повторному прикреплению трансплантата к ране. В случае, например, когда трансплантат является подкожным, миграция клеток вдоль его поверхности будет приводить к образованию тонкой фиброзной кисты, что во многих случаях является нежелательным.

Сохранение ориентации коллагена в дегидратированном состоянии также повышает касательную жесткость имплантата (касательную по отношению к ориентации фибрилл), следовательно, даже дегидратированный имплантат легче поддается сгибанию и является менее хрупким, чем сходный анизотропный имплантат. Это имеет значительную практическую важность, поскольку дегидратированный имплантат не нуждается в умягчителях, и в нем не образуются трещины и микроразрывы, которые могут приводить к неконтролируемой инфильтрации имплантата клетками, его разрушению и возможной кальцификации.

Другим важным результатом анизотропной организации фибрилл коллагена является анизотропное набухание имплантата во время регидратации. Согласно изобретению имплантат во время регидратации расширяется с различными скоростями в различных направлениях. Например, если коллагеновые структуры ориентированы, преимущественно, в наиболее длинном направлении (например, при использовании сухожилия), то наибольшее расширение будет наблюдаться в виде увеличения диаметра имплантата, в то время как длина будет изменяться лишь незначительно или может оставаться прежней, слегка увеличиваться или даже уменьшаться в соответствии с взаимоотношениями структурной анизотропии и набухания. В случае поверхностного имплантата, такого как покрытие на рану или ожог, ориентацию фибрилл можно выбрать преимущественно в направлении, перпендикулярной поверхности главной плоскости имплантата. В указанном случае расширение при гидратации будет проявляться в основном или только в плане увеличения толщины, в то время как опорная поверхность останется практически неизменной. Анизотропия набухания, помимо упомянутых выше преимуществ, имеет следующее практическое преимущество: хирург может лучше подобрать форму и размер имплантата для каждого отдельного пациента. Например, если необходимо нанести покрытие на рану определенной формы, имплантат соответствующего размера и формы можно просто выкроить из дегидратированного имплантата, и он останется неизменным после гидратации. В случае изотропных дегидратированных имплантатов измерения в дегидратированном виде должны быть относительно более маленькими, чтобы компенсировать эффект расширения при гидратации. Другим преимуществом также может быть то, каким образом дегидратированный имплантат, прикрепленный к ткани, сохраняет свою форму после гидратации, и, таким образом, окружающая ткань сохраняет то натяжение, которое было выбрано хирургом во время оперативного вмешательства. В случае изотропного имплантата окружающая ткань утратит свое природное натяжение в результате гидратационного расширения имплантата.

Важным является также тот факт, что анизотропия расширения предусматривает простое различение имплантата по настоящему изобретению и других имплантатов сходной природы и назначения.

Анизотропию набухания можно выразить как соотношение между коэффициентами линейного расширения в трех выбранных измерениях. Например, выбранным направлением вдоль оси «z» может быть толщина t, и его коэффициент линейного расширения C_z =(t_{гидрат.})/(t_{дегидрат.} ). Подобно этому можно выбрать длину l в качестве измерения в направлении оси «х» и определить коэффициент линейного расширения как C_x=(l_{гидрат.} )/(l_{дегидрат.u}). И наконец, в качестве измерения в направлении оси «y» можно выбрать ширину w и определить коэффициент линейного расширения как C_y=(w_{гидрат.})/(w _{дегидрат.}), где подпись «гидрат.» означает размер (измерение) после гидратации, а подпись «дегидрат» означает размер (измерение) в оригинальном, дегидратированном состоянии. В случае изотропного дегидратированного материала всегда обнаруживается, что C_z/C_y=С _х/C_z=C_y/C_z=1, независимо от того, чему равны величины C_x, C_y и C _z. Анизотропное расширение во время гидратации отличается тем фактом, что, по меньшей мере,, одно из соотношений C _x, C_y и C_z имеет величину, отличающуюся от 1, и, по меньшей мере, один из коэффициентов линейного расширения C_x, C_y и C_z имеет величину менее других, и его величина может быть даже менее 1. По меньшей мере, один из коэффициентов линейного расширения C_x, C _y и C_z имеет, наоборот, величину значительно более других, обычно, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно более чем на 30%. Например, коэффициенты линейного расширения C_x и C_y могут иметь величину менее 1, в то время как C_z имеет величину более 1,2 и предпочтительно более 1,5.

Согласно настоящему изобретению, коллагеновые фибриллы анизотропных дегидратированных имплантатов ориентированы, предпочтительно в направлении наиболее низкого коэффициента расширения или, в зависимости от обстоятельств, в плоскости, перпендикулярной направлению, в котором величина коэффициента расширения является наибольшей.

Коллагеновые фибриллы могут быть ориентированы, главным образом, в определенном направлении даже в полностью гидратированном состоянии. Указанная ориентация может достигаться частичной денатурацией коллагена в ориентированном состоянии или поперечной сшивкой коллагена (которая также является формой денатурации). Ориентация коллагеновых фибрилл затем остается практически неизменной даже после гидратации имплантата. Указанную ориентацию можно использовать во благо, для направления миграции и пролиферации клеток в определенном направлении, что является благоприятным в особенности для заживления ожогов.

Поперечную сшивку коллагена можно осуществлять с использованием хорошо известных способов, например, воздействием альдегидов, таких как, например, формальдегид или глутаровый альдегид, или поливалентных катионов, таких как, например, Ca²⁺, Mg²⁺, Al²⁺ или Cr³⁺. Поперечная сшивка также уменьшит набухание и увеличит прочность и резистентность к гидролизу коллагенового матрикса. Указанная поперечная сшивка в имплантированном состоянии часто является нестабильной, и постепенное уменьшение поперечно сшивающей плотности впоследствии приведет к постепенному увеличению набухания и к изменению факторов линейного расширения и их взаимных соотношений. Кинетика указанных процессов является контролируемой, и, следовательно, указанные процессы можно использовать, например, для создания направленного давления или натяжения на заживляемых тканях.

Согласно изобретению, бесклеточные матриксы являются в высокой степени гидрофильными, и их объем будет увеличиваться при гидратации. Гидратацию наиболее часто определяют как весовую фракцию воды в гидратированном состоянии или как содержание воды в мас.%. Согласно изобретению содержание воды в полностью гидратированном имплантате превышает 33% (мас.) и предпочтительно превышает 50% (мас.). Коэффициент объемного расширения определяется как:

C_v=C_x×C_y×C _z= (гидратированный объем)/

(дегидратированный объем)>1.

Согласно изобретению, бесклеточные матриксы имеют C_v>1,1, предпочтительно C_v >1,5. Этим они принципиально отличаются от преимущественно гидрофобных пористых структур, которые можно сформировать, например, ковалентной поперечной сшивкой тканей с использованием, например, альдегидов, или их можно сформировать из синтетических полимеров, таких как, например, полиуретаны. В данном случае во время гидратации вода заполняет поры и увеличивает массу имплантата, но его объем существенно не возрастает, а его C_v приближается или практически равняется 1.

Из приведенной выше информации можно сделать вывод о том, что предметом изобретения является, главным образом, бесклеточный, стерильный, практически дегидратированный и, по меньшей мере частично, денатурированный матрикс, полученный из ткани животного и содержащий, главным образом, коллаген, фибриллы которого демонстрируют структурную организацию, присущую оригинальной ткани, предназначенный для использования в качестве временного имплантата в медицине и ветеринарии; указанный матрикс демонстрирует анизотропные изменения своих измерений во время гидратации.

Согласно предпочтительному осуществлению настоящего изобретения во время гидратации бесклеточного матрикса, когда наблюдаются анизотропные изменения измерений матрикса, два наибольших измерения остаются практически неизменными или уменьшаются, в то время как наименьшее измерение увеличивается вместе с увеличением объема матрикса.

Согласно изобретению в другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения временный имплантат имеет практически плоскую форму, а его опорная поверхность определяется двумя наибольшими измерениями, в то время как его толщина определяется наименьшим измерением.

Согласно изобретению в еще одном предпочтительном варианте осуществления бесклеточного матрикса два из наименьших размеров будут увеличиваться, в то время как наибольшее измерение остается практически неизменным или уменьшается.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения временный имплантат имеет, в основном, продолговатую форму, такую как призма или цилиндр, диаметр которой определяется двумя наименьшими измерениями, такими как, например, диаметр, в то время как его длина или высота определяется наибольшим измерением.

Согласно изобретению предпочтительный матрикс в дегидратированном состоянии имеет порозность менее 70% (по объему), предпочтительно менее 60% (по объему) и наиболее предпочтительно менее 50% (по объему).

Согласно изобретению в предпочтительном варианте осуществления бесклеточный матрикс состоит из фибрилл коллагена, которые, по крайней мере, в дегидратированном состоянии ориентированы преимущественно в направлениях, в которых коэффициент линейного расширения при гидратации имеет наименьшее значение, и, в основном, перпендикулярно к направлению, в котором коэффициент линейного расширения при гидратации имеет наибольшее значение.

Согласно изобретению в предпочтительном варианте осуществления бесклеточный матрикс в дегидратированном состоянии имеет содержание воды менее 20% (по массе), предпочтительно менее 10% (по массе) и наиболее предпочтительно менее 5% (по массе).

Согласно изобретению в некоторых предпочтительных вариантах осуществления матрикс может также содержать умягчающие, консервирующие или бактерицидные добавки. Предпочтительные бактерицидные добавки содержат серебро, предпочтительно в коллоидном состоянии и даже более предпочтительно в виде комплекса серебро-белок. Предпочтительные умягчающие или консервирующие добавки содержат соединения, смешивающиеся с водой, такие как DMSO или полигидроксильные соединения, выбранные из семейств гликоля или глицерина или их производных, триэтаноламина и сахаридов.

Согласно изобретению предпочтительный бесклеточный матрикс способен к объемному расширению при контакте с водными жидкостями, с коэффициентом объемного расширения более 1,1, предпочтительно более 1,5. Помимо этого, предпочтительный бесклеточный матрикс после воздействия подходящих водных растворов способен принимать форму, которая содержит более 33% воды (по массе), предпочтительно более 50% воды (по массе).

Согласно изобретению, предпочтительный бесклеточный матрикс имеет наивысший коэффициент линейного расширения на 10% выше, предпочтительно на 30% выше наименьшего коэффициента линейного расширения. Предпочтительными являются бесклеточные матриксы, у которых наивысший коэффициент линейного расширения имеет величину более 1,2, предпочтительно более 1,5, в то время как наименьший коэффициент линейного расширения имеет величину менее 1,1, предпочтительно менее 1,05.

Согласно изобретению, в еще одном предпочтительном варианте осуществления твердые вещества (сухое вещество) бесклеточного матрикса состоят преимущественно из белков, а предпочтительный белок состоит преимущественно из коллагена. Еще более предпочтительно твердые вещества (сухое вещество) бесклеточного матрикса содержат от 70% (по массе) до 95% (по массе), предпочтительно от 80% (по массе) до 90% (по массе) белков коллагенового типа. Предпочтительно, если твердые вещества (сухое вещество) матрикса содержат, помимо белков, более низкую фракцию липидных соединений, включая липопротеины и фосфолипиды.

Согласно изобретению, бесклеточный матрикс является предпочтительным, когда его белковая фракция является, по меньшей мере частично, денатурированной. Согласно изобретению, в еще одном варианте осуществления по меньшей мере белковая фракция бесклеточного матрикса является поперечно сшитой в результате взаимодействия с альдегидами или поливалентными катионами.

Согласно изобретению, предпочтительный бесклеточный матрикс получен от млекопитающего, предпочтительно от свиньи.

Согласно изобретению, предпочтительная ткань животного для бесклеточного матрикса представляет собой кожу, плаценту, перикард, твердую мозговую оболочку, кишку, сухожилие или хрящ.

Временный имплантат, образованный бесклеточным матриксом по настоящему изобретению, предпочтительно используют в качестве покрытия на рану, более предпочтительно в качестве покрытия на ожог.

Согласно изобретению, другой предпочтительный вариант осуществления бесклеточного матрикса представляет собой матрикс, который содержит также культивированные клетки млекопитающего. Предпочтительно млекопитающее представляет собой свинью, а культивированные клетки млекопитающего представляют собой человеческие аутологичные или аллогенные кератиноциты.

Согласно изобретению, другой предпочтительный вариант осуществления бесклеточного матрикса представляет собой матрикс, который будет подвергаться биологической деградации после выполнения своей функции.

Способ изготовления имплантата по настоящему изобретению, как было описано выше, включает несколько основных этапов:

1) Сбор имплантата, такого как кожа свиньи или сухожилие человека. Данный этап осуществляют, в основном, так же, как в случае других, современных способов, но с тем важным преимуществом, что, согласно настоящему изобретению, сбор имплантата не является столь же требовательным к условиям транспортировки и последующей быстрой обработки, как в случае имплантатов, содержащих клетки. Коллагеновые структуры, которые будут представлять собой конечные имплантаты, являются более стабильными, чем клеточные структуры.

2) Удаление клеток. Согласно изобретению, различные способы удаления клеток можно использовать для указанного имплантата, включая способы, описанные в настоящем уровне технологии. Последнее включает в себя удаления клеток с использованием поверхностно-активных агентов, таких как детергенты, химических соединений, таких как кислоты и щелочи, или ферментов, как описано в последующих патентных заявках и документах, которые включены в настоящую заявку: CN 200310124306 (Hu Jie); СТ20051126108 (Dong Qun Lin); CN 20041022506 20040512 (Dai Weihua et al.); US 2005 0186286 A1 (Yoshihiro Takami); JP 19900247300 (Koide Mikio) и патент CZ № 281176 (E. Matouskova).

Согласно изобретению, двухэтапный способ является предпочтительным, в котором на первом этапе собранную ткань подвергают воздействию подходящего протеолитического фермента, такого как трипсин или папаин, а на втором этапе ткань, включающую возможные оставшиеся клетки, подвергают воздействию сильного гипотонического раствора, предпочтительно избытку дистиллированной или деионизированной воды. Деионизированная вода удалит оставшиеся клетки, подвергая из осмотическому шоку, который вызывает разрыв их мембран. Указанный второй этап удаления клеток имеет место вместе с многоэтапной экстракцией оставшегося фермента (такого как трипсин) и других соединений. Вместе с удалением оставшегося фермента удаляются также растворимые пептиды, а также полисахариды, гликопротеины и другие соединения с предполагаемой биологической активностью. Удаление водорастворимых соединений является даже более эффективным, поскольку гипотонический раствор вызывает сильное набухание ткани, улучшая, таким образом, диффузию экстрактов. Заявители установили, однако, что даже тщательная экстракция не удаляет указанные водорастворимые соединения полностью, и новые органические соединения можно обнаружить с использованием УФ-спектроскопии в конце каждого этапа. Это показывает, что новые соединения, такие как полипептиды и гликопротеины, продолжают высвобождаться из коллагеновой структуры; таким образом, определенный уровень биологической активности сохраняется.

3) Дегидратация. Дегидратацию осуществляют удалением по меньшей мере значительной фракции воды с использованием выпаривания воды, присутствующей в бесклеточной структуре, или ее экстракцией с использованием подходящего растворителя, такого как этанол. «Значительная фракция воды» здесь означает так называемую «свободную воду», которая представляет собой фракцию воды, структура и термодинамические свойства которой являются полностью такими же, как у жидкой воды (например, температура плавления, давление насыщенного пара или теплоемкость). Это обычно наибольшая часть воды в ткани, за исключением приблизительно 20 мас.%, которые состоят из воды, более или менее связанной с коллагеновым матриксом или другими гидрофильными компонентами имплантата. Указанная так называемая «связанная вода» имеет термодинамические свойства, отличающиеся от термодинамических свойств свободной воды, и действует как пластификатор коллагена. Полностью удалить связанную воду трудно. Под «дегидратированным имплантатом» подразумевается имплантат, который не содержит свободной воды и имеет содержание оставшейся влаги менее 20% (мас.), предпочтительно менее 10% (мас.). Для увеличения срока хранения продукта особенно предпочтительно поддерживать содержание влаги в продукте менее 5% (мас.). Если осуществляется экстракция с использованием смешивающихся с водой растворителей, указанный этап уже приводит к одновременной частичной денатурации коллагена. Для того чтобы частичная денатурация была эффективной, ближе к концу экстракции воды растворитель должен содержать более 50 мас.% органического соединения, предпочтительно более 70 мас.%. Экстракцию воды можно осуществлять в несколько этапов, с постепенным повышением концентрации органического растворителя. Подходящими растворителями являются низшие алифатические спирты от С₁ до С₄, низшие алифатические кетоны, такие как ацетон, эфиры, такие как диметиловый эфир, диэтиловый эфир, диоксан или тетрагидрофуран, гликоли, такие как этиленгликоль, 1,2-пропиленгликоль, диэтиленгликоль или триэтиленгликоль и т.п. Наиболее подходящим является этиловый спирт, который представляет собой не только эффективный денатурирующий агент для коллагена и других белков, но также и консервирующий и стерилизующий агент, эффективный даже против, например, ретровирусов. Его преимуществом является также относительно низкая токсичность, доступность и возможность полного удаления его остатков выпариванием. Если выбранный растворитель не является летучим, его следует удалять экстракцией с использованием летучего растворителя, такого как метанол, этанол, ацетон или вода.

4) Частичная денатурация коллагена. Денатурацию осуществляют с использованием нагревания или подходящих органических агентов, таких как, например, спирты, альдегиды, кетоны или их подходящие комбинации. Возможно также вызывать денатурацию посредством частичной поперечной сшивки коллагена, например, с использованием поливалентных катионов, таких как Ca²⁺, Mg²⁺, Al³⁺ или Cr³⁺. Поперечная сшивка может улучшить устойчивость к биологической деградации и, таким образом, может продлить эффективное использование имплантата.

Частичная денатурация биологических покрытий тепловой обработкой, поперечной сшивкой или их комбинацией описана в следующих документах, которые включены в настоящую заявку: JP 19900247300 (Koide Mikio) и US 4076468 (Loiotta et al.); US 4247292 (W.A. Angell).

Денатурацию коллагена можно выгодно осуществлять в комбинации с дегидратацией, однако оба этапа можно осуществлять по отдельности, в произвольном порядке. Один предпочтительный способ представляет собой дегидратацию выпариванием воды с последующей денатурацией в дегидратированном состоянии, например, с использованием тепловой обработки. Денатурацию органическим растворителем можно осуществлять даже путем разбрызгивания или распыления подходящего органического агента на дегидратированный имплантат. Денатурацию растворителями можно комбинировать даже с тепловой денатурацией путем контролируемого нагревания имплантата, например, в ходе выпаривания воды или растворителей.

Важно осуществлять дегидратацию и денатурацию бесклеточного матрикса при механическом натяжении в одном или двух выбранных направлениях, обычно в направлении наибольших измерений. Натяжение во время дегидратации и денатурации можно осуществлять с помощью поддержания постоянного измерения в желательных направлениях. Этого можно добиться, например, фиксированием бесклеточного матрикса с использованием крепежа, его растягиванием с использованием эластичных соединений или роликов, закреплением на подходящей рамке, прессованием на клейкий субстрат или использованием отсоса для прикрепления к субстрату с использованием вакуума и т.п. Дегидратация и денатурация в растянутом состоянии будет ориентировать коллагеновые структуры в направлении, в котором бесклеточный коллагеновый матрикс растянут (или в котором его сокращение по крайней мере предотвращается во время дегидратации и денатурации).

Если денатурацию осуществляют в отношении уже дегидратированного анизотропного матрикса, то уже нет необходимости поддерживать его в растянутом состоянии; таким образом, дегидратированный матрикс стабилизируется по своим измерениям до определенной температуры, которые не следует превышать во время изготовления или хранения. Указанный температурный предел зависит, главным образом, от остаточного содержания воды в матриксе, которое не должно превышать 20% (мас.), предпочтительно 10% (мас.) и наиболее предпочтительно 5% (мас.), относительно общей массы матрикса. Денатурацию осуществляют при температуре от +15°С до 90°С, предпочтительно от 30°С до 70°С.

5) Стерилизация ионизирующим излучением. Если денатурацию на этапе 4 осуществляют с использованием подходящих растворителей, таких как этанол, имеют место два уровня стерилизации. Первый уровень стерилизации во время процесса изготовления будет, прежде всего, уменьшать микробную нагрузку для окончательной стерилизации, и, во-вторых, он будет удалять даже те микроорганизмы, против которых второй уровень стерилизации может быть неэффективным (например, ретровирусы).

Окончательный уровень стерилизации осуществляют помещением в упаковку, непроницаемую для микроорганизмов и вирусов, с использованием излучения. Предпочтительно минимальный уровень ионизирующего излучения используют для данной микробной нагрузки, что уменьшает деградацию продукта. Рекомендуется уровень ниже 50 кГрей, предпочтительно ниже 30 кГрей. Это важно особенно в случае гамма-излучения. Предпочтение отдается стерилизации ускоренными электронами (электронным лучам, бета-излучением), которая является более щадящей для материала имплантата и которую можно более точно дозировать. Важно понимать различия в механизме деградации при использовании гамма-излучения и ускоренных электронов. Авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили, что имплантаты, стерилизованные комбинацией ионизирующего излучения, особенно ускоренными электронами, с химическими стерилизующими агентами, которые одновременно вызывают денатурацию, особенно с этанолом, сохраняют свои отличные механические свойства во влажном состоянии и не являются цитотоксичными даже при контакте с клетками пациента или с клетками, культивируемыми на имплантате в лаборатории. Безотносительно к каким бы то ни было теориям авторы предполагают, что благоприятный эффект ионизирующего излучения, такого как ускоренные электроны, вызывается, главным образом, высвобождением водорастворимых фрагментов пептидов и протеогликанов из не растворимого при иных условиях матрикса, что предусматривает его повышенную биологическую активность.

Имплантат можно также комбинировать с известными бактерицидными или бактериостатическими агентами, такими как сульфаниламиды, антибиотики, комплексы белок-серебро или коллоидное серебро, распределяемыми по коллагеновому матриксу. Это выгодно особенно во время имплантации в инфицированные или некротизированные раны. Некоторые добавки одновременно действуют как умягчители, такие как глицерин и его диацетат или формальдегид, 1,2-пропиленгликоль, диэтиленгликоль, глюкоза, триэтаноламин или диметилсульфоксид (DMSO). Они могут действовать как мягкие консерванты, умягчители и слабые денатурирующие агенты. Их содержание может составлять до 50% (мас.), предпочтительно менее 30% (мас.). Указанные умягчающие агенты являются смешивающимися с водой, и предпочтительно будет представлять собой полигидроксильные соединения, наиболее предпочтительно глицерин или его производные. Их можно использовать даже в комбинации с соединениями серебра, как описано, например, в заявке CN 199551010722 (Kai Cao), которая включена в настоящую заявку.

Предметом настоящего изобретения является, таким образом, способ изготовления бесклеточного, стерильного, практически дегидратированного и, по меньшей мере частично, денатурированного матрикса, полученного из ткани животного и содержащего, главным образом, коллагеновые структуры, который уже был определен выше, на основе ткани животного, обработанной с использованием способа, включающего в себя следующие этапы:

а) сбор ткани;

b) удаление клеток с использованием ферментативного воздействия, поверхностно-активных агентов, кислот, щелочей, гипотонических водных растворов или их комбинаций, во время формирования бесклеточного матрикса;

с) дегидратация бесклеточного матрикса посредством удаления основной части воды, при механическом натяжении матрикса в одном или более выбранных направлениях;

d) частичная денатурация коллагеновых структур в бесклеточном матриксе посредством воздействия повышенной температуры, органических соединений, поливалентных катионов или их комбинаций, при механическом натяжении матрикса в одном или более выбранных направлениях; или при поддержании измерений матрикса на практически постоянном уровне;

е) стерилизация практически дегидратированного и по меньшей мере частично денатурированного матрикса с использованием ионизирующего излучения.

Согласно изобретению, предпочтительный способ изготовления стерильного бесклеточного матрикса является способ, при котором осуществляют частичную денатурацию коллагеновых структур с использованием органических соединений, смешивающихся с водой, выбранных из группы, включающей в себя алифатические спирты от С₁ до С₄, алифатические альдегиды, включая формальдегид и глутаровый альдегид, алифатические кетоны, включая ацетон, и эфиры, включая диметиловый эфир, диэтиловый эфир, диоксан и тетрагидрофуран.

Согласно изобретению, предпочтительный способ частичной денатурации коллагеновых структур осуществляют при температурах от 15°С до 90°С, предпочтительно от 30°С до 70°С.

Авторы установили и подтвердили, что имплантат по настоящему изобретению можно выгодно использовать в качестве биологического покрытия для ожогов, язв голени, мест взятия тканей и других дефектов кожи. Дегидратированный имплантат можно помещать непосредственно на кровоточащую или сочащуюся рану, что будет гидратировать имплантат in situ без значительного увеличения площади покрытия раны и вносить свой вклад в уменьшение кровотечения и эксудации из раны. Для данного использования особенно подходящими являются имплантаты, умягченные подходящими добавками, такими как глицерин. Стерильный имплантат также можно перед использованием гидратировать стерильным физиологическим раствором, возможно, с добавлением подходящих бактерицидных агентов (таких как фурантоин, раствор борной кислоты или белковый раствор серебра в воде (комплекс белок-серебро)) и помещать на рану. Его большим преимуществом является способность тесно покрывать все топографические особенности поверхности раны, уменьшать болезненность раны и оказывать гемостатическое действие. Другим большим преимуществом является тот факт, что заживление всей области наблюдается без смены повязок, которая необходима в случае других повязок на раны, часто является дорогостоящей и особенно травматичной для пациента (в случае тяжелых ожогов ее необходимо производить даже под общим наркозом). Другим преимуществом по сравнению с другими биологическими покрытиями является то факт, что не имеет значения, какая сторона контактирует с раной. Бесклеточное дермальное покрытие защищает рану и ускоряет заживление, поддерживая биологическую активность, связанную с заживлением, такую как миграция и пролиферация кератиноцитов пациента. Нативные кератиноциты будут прикрепляться к внутренней поверхности имплантата (возможно, к фибрину, образующемуся на имплантате после контакте с кровью или плазмой пациента) и мигрировать на его поверхность, так, что имплантат становится частью кожи на тот период времени, когда происходит активное заживление. После завершения заживления и обновления эпидермального слоя кожи пациента имплантат будет высыхать и спонтанно открепляться, без хирургического удаления, которое необходимо для некоторых других биологических покрытий и которое также является травматичным для пациента.

Другим преимуществом стерильного бесклеточного имплантата по настоящему изобретению является то, что он отлично подходит в качестве субстрата для культивирования клеток, как аутологичных, так и аллогенных. Его поверхность, таким образом, можно использовать для культивирования подходящих клеток, таких как кератиноциты, которые будут формировать клеточное биологическое покрытие, известное как «рекомбинированная кожа» (RK), которое можно накладывать на ожоги и другие раненые области. Главным преимуществом данного клеточного биологического покрытия является его способность объединять стимулирующий эффект культивированных кератиноцитов со свойствами мембранного субстрата, который представляет собой имплантат по настоящему изобретению. Если предотвращение углубления глубоких ожогов кожи является успешным при использовании RK в течение 10 дней после поражения, трансплантат не является необходимым, заживление будет значительно ускорено, и можно будет обойтись без областей сбора и повторных хирургических вмешательств. RK вместе с трансплантированными аллогенными кератиноцитами будет временно приклеиваться во время заживления, кератиноциты будут инкорпорироваться в регенерирующий эпидермис, будут пролиферировать, мигрировать, закрывать рану и стимулировать заживление, продуцируя различные факторы роста. Ксенодермис будет защищать рану и обеспечивать натуральный субстрат для миграции аутологичных кератиноцитов. В течение одной недели аллогенные кератиноциты замещаются собственными кератиноцитами. Настоящее изобретение далее будет объясняться примерами и прилагающимися фигурами. Указанные примеры служат в качестве демонстрации некоторых предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, и специалист определенно поймет, что объем прилагающейся формулы изобретения не ограничивается указанными примерами.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 представляет собой микрофотографию, показывающую гистологический срез через эпидермис свиньи с папиллярным уровнем кориума.

Фиг. 2 представляет собой микрофотографию гистологического среза имплантата после удаления клеток.

Фиг. 3 представляет собой микрофотографию, показывающую гистологический срез из плоскоориентированного имплантата после дегидратации.

Фиг. 4 представляет собой микрофотографию, показывающую окрашивание коллагеновых структур по Ван-Гизону на гистологическом срезе стерильного регидратированного имплантата по настоящему изобретению, увеличение 400х.

Фиг. 5 показывает регидратированный стерильный имплантат, подготовленный для использования в качестве покрытия на ожог.

Фиг. 6 показывает помещение имплантата по настоящему изобретению на ожог 2-й степени: Фото слева: приспосабливание и адгезия покрытия к ране без наружных бинтов. Фото справа: ожог 2-й степени после заживления и самооткрепления покрытия.

Фиг. 7 представляет собой микрофотографию, показывающую гистологический срез из образцов новообразованной ткани на ожоге 3-й степени без некроза под покрытием, изготовленным из имплантата по настоящему изобретению (9 дней после нанесения).

Фиг. 8 показывает микрофотографии гистологических препаратов рекомбинированной кожи (RK), образованной культивированными в лабораторных условиях кератиноцитами на имплантате по настоящему изобретению. Фото слева: Рекомбинированная кожа с человеческими кератиноцитами, культивированными погружением на свиной бесклеточный матрикс по настоящему изобретению. Фото справа: Рекомбинированная кожа с человеческими кератиноцитами, культивированными на поверхности раздела воздуха и свиного бесклеточного матрикса по настоящему изобретению.

Примеры

Пример 1

Кожа свиньи как ксенотрансплантат

С помощью дерматома отрезали слой бритого и очищенного свиного эпидермиса толщиной 300-400 микрон, включающего в себя папиллярный слой кориума. Гистограмма удаленного слоя представлена на фиг. 1. Удаленную полоску свиной кожи погружали 3 раза на 20 минут при 37°С и на 12 часов при 4°С в 0,25% раствор трипсина, который удалял большую часть кожных клеток и отделял эпидермис. Полученный эпидермис промывали 6 раз в деминерализованной воде (3 раза по 1 часу, 1 раз 12 часов, 2 раза по 0,5 часа) для удаления оставшихся клеток и трипсина. Гистограмма на фиг. 2 показывает, что неклеточная структура сохранялась. Полоску дермиса затем прикрепляли с помощью клея к стеклянной чашке Петри и сушили при комнатной температуре до постоянной массы. В данном состоянии дермис содержал приблизительно 18% воды. Высушенный таким способом бесклеточный дермис имел ту же площадь охвата, как и оригинальный гидратированный дермис, но его толщина составляла менее половины. Растянутый бесклеточный дермис затем погружали в 96% этанол при 15°С на 24 часа. Затем этанол сливали, а дермис открепляли от его стеклянного субстрата, закрепляли сиси крепежа в двух противоположных направлениях и сушили при температуре 50°С в течение 1 часа.

Дегидратированный бесклеточный ксенотрансплантат, содержащий остаточное количество воды 9,5 мас.%, затем помещали в мешочек для стерилизации, подходящий для стерилизации излучением, запечатывали нагреванием и подвергали воздействию дозы 25 кГрей гамма-излучения. Стерильность подтверждали с использованием стандартного теста на стерильность. После регидратации изготавливали гистологический срез. Фиг. 3 показывает, что волокнистая структура соединительной ткани сохранялась, но была более компактной, а волокна были ориентированы в плоскости. Окрашивание по Ван-Гизону на фиг. 4 показывает, что имплантат состоит преимущественно из полимеров коллагенового типа таких, как коллаген и эластин. Анализ показал, что имплантат содержит приблизительно 85% (мас.) смеси, главным образом, коллагена с меньшим количеством эластина и фибрина, а остаток состоит из липидов, полисахаридов и гликопротеинов.

Порозность стерильного имплантата составляла приблизительно 55% по объему, рассчитанная с использованием плотности в дегидратированном состоянии. Имплантат регидратировали при 35°С в изотоническом растворе NaCl. После регидратации до постоянной массы содержание воды составляло 62% (мас.). Повторные измерения размеров в дегидратированном и гидратированном состоянии осуществляли с точностью до 0,1 мм и установили следующие коэффициенты линейного расширения:

Длина: C_x=1,02±0,01

Ширина: C_y=1,03±0,03

Толщина: C_z=1,54±0,29

Коэффициент плоскостного расширения: C_a=1,05±0,03

Коэффициент объемного расширения: C_v=1,63±0,20

Очевидные различия в коэффициентах расширения ясно подтверждают анизотропное расширение во время регидратации имплантата. Указанную анизотропию можно далее продемонстрировать величинами соотношений коэффициентов линейного расширения:

C_x /C_y 0,98

C_z/C_x 1,52

C_z/C_y 1,49

После определенного периода хранения ксенотрансплантат использовали в качестве покрытия для глубокого ожога 2-й степени на лице. Имплантат на короткое время погружали в стерильный физиологический раствор, как показано на фиг. 5, после чего он умягчался и становился гибким без какого бы то ни было изменения опорной поверхности. Затем его помещали на ожог, к которому он хорошо приклеивался, как это видно из левой части фиг. 6. Во время заживления ожога имплантат оставался на своем исходном месте, согласно изобретению он начинал постепенно высыхать и спустя почти неделю он начинал самооткрепляться от зажившей ткани. Через 11 дней рана зажила, а покрытие полностью открепилось, как показано на правой части фиг. 6.

Пример 2

Имплантат, изготовленный согласно примеру 1, использовали на ожоге 3-й степени

Поврежденную ткань тщательно иссекали. Дегидратированный трансплантат извлекали из стерильной упаковки, выкраивали по размерам и форме пораженной области с помощью ножниц, помещали на кровоточащую область раны и распыляли на него стерильный раствор антибиотика. Ксенотрансплантат быстро умягчался и прилипал к пораженной поверхности, что останавливало кровотечение. Имплантат сохранял свою опорную поверхность, которая имела место в дегидратированном состоянии, но его толщина увеличивалась после гидратации. Это обеспечивало идеальное прилегание к ране. Имплантат покрывали защитным слоем марлевой повязки на первые 3 дня. Через 8 дней имплантат высыхал до состояния, подобного струпу, и начинал отделяться от новообразованной кожи под покрытием. Новый эпидермис начинал медленно формироваться под имплантатом, как показано на фиг. 7. По окончании заживления образовывалась здоровая и имеющая натуральную структуру кожа, включая естественную пигментацию и отсутствие рубцов.

Пример 3

Человеческий хрящ как аллотрансплантат

Хрящ, взятый из бедренного сустава умершего донора, избавляли от клеток повторным вымачиванием в растворе трипсина и в дистиллированной воде, затем его прикрепляли, используя вакуум, вогнутой стороной на выпуклую сторону пористого субстрата подходящей формы, изготовленного из фриттованного стекла. На указанном субстрате его помещали в избыточное количество раствора 20 частей (мас.) метанола и 5 частей (мас.) диметилсульфоксида (DMSO) при 35°С на 48 часов. Таким образом бесклеточный имплантат дегидратировали, и в то же время коллаген, содержавшийся в нем, частично денатурировали в плоскостно-ориентированном состоянии. После указанного периода времени бесклеточный аллотрансплантат извлекали из раствора и метанол выпаривали при комнатной температуре с использованием воздушного потока. К концу указанного этапа трансплантат содержал приблизительно 13% (мас.) DMSO, приблизительно 4% (мас.) воды и менее 0,5% (мас.) метанола. После удаления с пористого субстрата трансплантат помещали в водонепроницаемый стерилизационный мешочек и стерилизовали с использованием дозы бета-излучения 45 кГрей из ускорителя электронов. Стерильность подтверждали с использованием стандартного теста на стерильность.

Изготовленный таким образом имплантат является подходящим для экспериментального замещения хряща в бедренном суставе у собак, где его надвигали на поврежденный хрящ и прикрепляли с помощью петли хирургического шовного материала вокруг шейки головки. Имплантат будет гидратироваться in situ без изменения опорной поверхности, поэтому на весь период времени он остается в стабильном положении относительно сустава пациента. Имплантат защищает хрящ от анкилоза и, таким образом, от стойкой утраты подвижности. Помимо этого, имплантат поддерживает и ускоряет заживление хряща. Когда заживление окончено, имплантат постепенно деградирует и резорбируется, пока натуральный хрящ не заживет и функция сустава не восстановится.

Пример 4

Кожа свиньи как матрикс для культивирования кератиноцитов (для изготовления рекомбинированной кожи)

Стерильный бесклеточный матрикс из примера 1 извлекали из стерильной упаковки, помещали на чашку Петри, используемую для культивирования клеточных культур, и осторожно заливали небольшим избытком дистиллированной воды. Бесклеточный ксенодермис гидратировался без изменения опорной поверхности, только его толщина приблизительно удваивалась в результате гидратации. Избыток воды затем осторожно отсасывали для предотвращения любой деформации гидратированного дермиса, а остатку воды позволяли испаряться в вытяжном шкафу с ламинарным потоком при комнатной температуре. Высушенный бесклеточный ксенодермис затем использовали для культивирования человеческих кератиноцитов на облученных смертельной дозой 3Т3 фибробластах (они не размножались, но поддерживали метаболизм и продуцировали важные факторы роста), которые образовывали так называемую рекомбинированную кожу (RK), содержащую аллогенные кератиноциты, культивированные на ксеногенном бесклеточном дермисе по настоящему изобретению. Структура слоя кератиноцитов определялась условиями культивирования, как следует из фиг. 8. Когда культивирование осуществляли на поверхности имплантата под иммерсией, получали гладкий, регулярный слой кератиноцитов. Когда культивирование осуществляли на поверхности раздела имплантат/воздух, слой кератиноцитов структурировался с образованием формы, схожей с натуральным эпидермисом, включая ороговевающий слой stratum corneum и базальную мембрану, stratum basale. Изготовленную таким образом RK можно использовать для заживления ожогов, язв голени и других плохо заживающих дефектов кожи.

RK наносят кератиноцитами на рану и дермисом наружу («вверх дном»). Согласно изобретению, ксенодермис, который служит субстратом для культивирования во время фазы культивирования, служит поддерживающей структурой для перемещения кератиноцитов во время использования трансплантата; он защищает рану от инфекции, высыхания и механического повреждения. Преимуществом по сравнению с простыми культивированными трансплантатами является более высокая прочность, отделение от чашки Петри без воздействия ферментов (с использованием только 2 пинцетов) и легкое манипулирование. Преимуществом по сравнению с культурами кератиноцитов на гелях на основе коллагена является консистенция RK, которая является сходной с консистенцией обычной кожи, а также отличная адгезия к ране и гемостатический эффект. После извлечения из чашки Петри трансплантат не сокращается, кератиноциты на субстрате не подвергаются воздействию во время извлечения, как это было бы в случае использования ферментов. RK с аллогенными кератиноцитами оказывает стимулирующее действие на заживление областей сбора трансплантатов и на заживление глубоких ожогов кожи (2-й степени).

Главным преимуществом указанного клеточного биологического покрытия является комбинация стимулирующих эффектов культивированных кератиноцитов со свойствами биологических мембран. В случаях, когда возможно предотвратить углубление глубоких ожогов кожи применением RK в течение 10 дней после повреждения, нет необходимости в трансплантации, заживление значительно ускоряется, а области сбора будут сокращены, и можно будет обойтись без повторных хирургических вмешательств. RK вместе с трансплантированными аллогенными кератиноцитами будет временно приклеиваться во время заживления, кератиноциты будут инкорпорироваться в регенерирующий эпидермис, будут пролиферировать, мигрировать, закрывать рану и стимулировать заживление, продуцируя различные факторы роста. Ксенодермис будет защищать рану и обеспечивать натуральный субстрат для миграции аутологичных кератиноцитов. В течение одной недели аллогенные кератиноциты замещаются собственными кератиноцитами пациента.

Пример 5

Сухожилие индейки

Из сухожилия, взятого из ноги индейки, удаляли клетки, как описано в способе примера 1, а затем фиксировали в аппарате, помещенном в контейнер, в котором он был расположен на ролике и натянут с помощью шнура с прикрепленным весом 12 кг. Его погружали в 1% раствор хлорида алюминия в указанном состоянии и оставляли на 16 часов при 37°С. Затем раствор 3 раза меняли с использованием апирогенной воды, затем заменяли смесью 20 частей (мас.) ацетона и 10 частей (мас.) глицерина и 0,05 части (мас.) хлорида натрия, и структура оставалась в указанном растворе на 25 часов при натяжении, созданном 12 кг массой и растягивающим аппаратом. Затем структуру высушивали и вместе с растягивающим аппаратом перемещали в камеру для вакуумной сушки, предварительно нагретой для 70°С, где из нее удаляли оставшийся растворитель в течение двух часов, и, помимо этого, имела место частичная денатурация коллагена, вызванная нагреванием. Процесс денатурации завершался нагреванием до 88°С в течение 10 минут, при механическом натяжении в атмосфере азота. Высушенный бесклеточный имплантат с остаточным содержанием воды 3% (мас.) помещали в пластиковую упаковку для стерилизации и стерилизовали бета-излучением в дозе 15 кГрей с использованием ускорителя электронов. Стерильность подтверждали с использованием стандартного теста на стерильность.

Бесклеточный имплантат оставался прочным во время дегидратации, и его диаметр увеличивался, в то время как длина уменьшалась. После имплантации он дополнительно гидратировался благодаря уменьшению поперечносшивающей плотности, которую можно определить, например, как молярную фракцию групп, соединяющих две цепи в полимере. Это также приводило к постепенному сокращению длины и увеличению натяжения окружающих тканей, что можно с выгодой использовать, например, в реконструктивной или ортопедической хирургии.

Пример 6

Тонкий кишечник свиньи

Тонкий кишечник изымали у только что забитого поросенка, промывали его водой, выворачивали наизнанку и повторно замачивали в избытке 3% раствора додецилсульфоната натрия при 45°С. После указанного этапа один конец кишки закрывали зажимом, а другой конец соединяли с источником деминерализованной воды под давление до 30 мм рт.ст. (4 кПа). Избыточное давление поддерживали в бане с деминерализованной водой при 40°С в течение 24 часов. Затем деминерализованную воду заменяли на раствор изопропилового спирта и трет-бутилового спирта (1:1, мас.) и поддерживали температуру 70°С при внутреннем избыточном давлении спиртового раствора в течение еще 6 часов. Наконец, смесь спиртов заменяли на метанол три раза при комнатной температуре. Бесклеточную и дегидратированную ориентированную мембрану затем накачивали азотом и внешнюю поверхность сушили с использованием потока чистого воздуха в вытяжном шкафу с ламинарным потоком, после чего ее плоско расстилали между двумя полипропиленовыми пластинами и запечатывали в водонепроницаемый мешок для стерилизации. Затем ее стерилизовали в два этапа: на первом этапе ее стерилизовали с использованием гамма-излучения в дозе 5 кГрей, затем - ускоренными электронами в дозе 15 кГрей. Стерильная бесклеточная мембрана предназначается для заполнения суспензией аллогенных фибробластов и подкожной имплантации пациенту с целью регенерации подкожной соединительной ткани пациента.