соединения триазола для лечения образования биопленок

Формула изобретения

1. Способ лечения образования биопленок P.aeruginosa у пациента, включающий введение пациенту комбинации, включающей (а) 4-[3,5-бис(2-гидроксифенил)-[1,2,4]триазол-1-ил]бензойную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль и (б) антибиотик, выбранный из группы, включающей гентамицин, амикацин, тобрамицин, ципрофлоксацин, левофлоксацин, цефразидим, цефепим, цефпиром, пиперациллин, тикарциллин, меропенем, имипенем, полимиксин В, колистин и азреонам.

2. Способ по п.1, где антибиотик представляет собой тобрамицин.

3. Способ по п.2, где комбинация в виде фиксированной комбинации.

4. Способ по п.2, где пациентом является пациент с муковисцидозом.

5. Способ по п.3, где пациентом является пациент с муковисцидозом.

6. Способ лечения хронической инфекции P. aeruginosa у пациента, включающий введение пациенту комбинации включающей (а) 4-[3,5-бис(2-гидроксифенил)-[1,2,4]триазол-1-ил]бензойную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль и (б) антибиотик, выбранный из группы, включающей гентамицин, амикацин, тобрамицин, ципрофлоксацин, левофлоксацин, цефразидим, цефепим, цефпиром, пиперациллин, тикарциллин, меропенем, имипенем, полимиксин В, колистин и азреонам.

7. Способ по п.6, где антибиотик представляет собой тобрамицин.

8. Способ по п.7, где комбинация в виде фиксированной комбинации.

9. Способ по п.7, где пациентом является пациент с муковисцидозом.

10. Способ по п.8, где пациентом является пациент с муковисцидозом.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к применению 4-[3,5-бис-(2-гидроксифенил)[1,2,4]-триазол-1-ил]бензойной кислоты (соединения формулы I) для подавления или прерывания пленкообразования бактерией Pseudomonas aeruginosa при воздействии различных факторов окружающей среды в легких пациентов, страдающих от смертельного генетического нарушения - муковисцидоза.

Муковисцидоз (MB) является одним из наиболее распространенных укорачивающих жизнь наследственных детских заболеваний. В США заболеваемость муковисцидозом составляет 1 на 1000. В штате Виктория, в Австралии заболеваемость составляет 1 на 3600. В Северной Италии заболеваемость муковисцидозом составляет 1 на 4300. Наиболее часто заболевание встречается у европейцев и евреев ашкенази, например носителем одного гена MB является один из 22 европейцев, что является причиной наиболее распространенного генетического заболевания.

Муковисцидоз (MB) является наследственным заболеванием, которое поражает весь организм, вызывая прогрессирующую инвалидность и раннюю смерть. Ранее заболевание было известно под названием панкреатический кистозный фиброз, в настоящее время в связи с существенным расширением термина болезнь носит название муковисцидоз. MB вызывается мутацией в гене, который называется трансмембранный регулятор муковисцидоза (CFTR). Продукт этого гена способствует выделению пота, желудочного сока и слизи. Хотя у большинства людей с отсутствием MB имеется две рабочих копии гена CFTR, для предотвращения муковисцидоза необходим только один из них. MB развивается только в том случае, если нормально не работает ни один из генов. Следовательно, MB является аутосомным рецессивным заболеванием. Термин муковисцидоз относится к типичному «фиброзу» (рубцеванию ткани) и образованию кисты в поджелудочной железе, впервые обнаруженному в 1930 г.г. Наиболее распространенными симптомами являются затрудненное дыхание и недостаточное продуцирование ферментов в поджелудочной железе. Продуцирование вязкой слизи, а также снижение функции иммунной системы приводит к частым инфекциям легких, которые при пероральном или внутривенном введении антибиотиков и других лекарственных средств поддаются лечению, но не всегда излечиваются.

Легкие пациентов, пораженных муковисцидозом, заселены и инфицированы бактериями с раннего возраста. Указанные бактерии, которые часто распространяются среди индивидуумов с MB, обильно разрастаются (размножаются) в измененной слизистой, которая накапливается в периферических дыхательных путях легких. Указанная слизистая способствует развитию бактериального микроокружения, например биопленок, что препятствует проникновению иммунных клеток и антибиотиков. При повторном повреждении легких развивается ответная реакция, такая как выделение вязких секретов и хронические инфекции, при этом происходит ремоделирование периферических дыхательных путей, например развивается бронхоэктаз, что еще более затрудняет борьбу с инфекцией. Со временем у пациентов с MB происходит изменение как вида бактерий, так и их индивидуальных характеристик. Сначала легкие заселяют и инфицируют обычные бактерии, такие как Staphylococcus aureus и Hemophilus influenzae. Однако в конечном счете преобладают Pseudomonas aeruginisa и иногда Burkholderia cepacia. Поселившись в легких, указанные бактерии адаптируются к окружающей среде и приобретают устойчивость к используемым стандартным антибиотикам. Pseudomonas приобретает особые свойства, которые позволяют образовывать большие колонии. Такие штаммы известны как "слизеобразующие бактерии" Pseudomonas и редко встречаются у людей, не пораженных муковисцидозом.

Биопленка представляет собой скопление микроорганизмов с определенной структурой. Биопленка напоминает крошечный городок, в котором микробные клетки, каждая величиной всего один или два мкм, образуют башенки, которые могут достигать в высоту сотни мкм. "Улицы" между башенками фактически представляют собой каналы, наполненные жидкостью, которая переносит питательные вещества, кислород и другие компоненты, необходимые для жизнеобеспечения совокупности биопленки.

Биопленки образуются на поверхности катетеров и контактных линз. Они растут на кардиостимуляторах, протезах сердечных клапанов и искусственных суставах и других хирургических имплантатах. По оценкам CDC (Центра по контролю за заболеваниями) более 65% нозокомиальных (внутрибольничных) инфекций вызываются биопленками.

Бактерии, растущие в биопленке, проявляют высокую устойчивость к антибиотикам, например, они до 1000 раз более устойчивы, чем аналогичные бактерии, растущие в обычных условиях. Стандартная терапия антибиотиками часто неэффективна и единственным средством может быть удаление загрязненного имплантата.

Pseudomonas aeruginosa является грамотрицательной, аэробной, палочкообразной бактерией с монополярной подвижностью. Условно-патогенный для человека микроорганизм Р. aeruginosa является также условным патогеном растений.

Р. aeruginosa обычно устойчива к множеству антибиотиков и после неэффективного лечения может проявлять дополнительную резистентность, прежде всего за счет модификации порина. Обычно курс лечения следует выбирать по результатам определения чувствительности к антибиотикам, а не подбирать антибиотики эмпирическим путем. Если антибиотики подбирают эмпирически, то в каждом случае получают культуры и используемый антибиотик выбирают по результатам культивирования.

Антибиотики, которые обладают активностью в отношении Р. aeruginosa, включают аминогликозиды, например гентамицин, амикацин, тобрамицин, хинолоны, например ципрофлоксацин и левофлоксацин, цефалоспорины, например цефтазидим, цефепим, цефпиром, уреидопенициллины, такие как пиперациллин, тикарциллин, карбапенемы, такие как меропенем, имипенем, полимиксины, такие как полимиксин В, колистин, и монобактамы, такие, например, как азтреонам.

Бактерия Pseudomonas aeruginosa является изменчивым и проблематичным патогеном при заболевании человека. В дыхательных путях эта инфекция вызывает как небольничную, так и нозокомиальную пневмонию, причем последняя ассоциируется с высокой смертностью пациентов с бронхоэктазом и является преобладающим патогеном у пациентов, страдающих от связанного с генетическим нарушением муковисцидоза (MB). Кроме того, патоген инфицирует ожоги и ишемические травмы и часто загрязняет медицинское оборудование. Многие инфекции Р.aeruginosa устойчивы к стандартной терапии, т.е. к лечению антибиотиками, поскольку организм может приспособиться к существованию в биопленке. Например, при MB P. aeruginosa растет в слизистой легких в виде микроколоний, включенных в экзополисахарид. В этих условиях под воздействием ряда факторов, таких как пониженное локальное давление кислорода за счет медленной диффузии через биопленку, возрастает устойчивость к антибиотикам. Благодаря указанным факторам инфекция Р.aeruginosa, ассоциированная с хронической биопленкой, практически не поддается лечению.

Следовательно, существует необходимость в разработке новых подходов к лечению хронических инфекций Р.aeruginosa и удалению биопленок, например, Р.aeruginosa, например, у пациентов с MB.

Соединения формулы I, например соединение I, можно использовать для удаления биопленок, например, образования биопленок Р. aeruginosa, например, у пациентов с муковисцидозом и/или для лечения образования биопленок Р. aeruginosa, например, у пациентов с MB.

Соединения формулы I, описанные ниже, и соединение I, т.е. 4-[3,5-бис-(2-гидроксифенил)-[1,2,4]-триазол-1-ил]бензойная кислота формулы

в форме кислоты, ее соли и ее кристаллических форм описаны в US 6465504 B1.

Таким образом, одним объектом настоящего изобретения является применение комплексона железа общей формулы I

(I)

где

R₁ и R ₅ одновременно или независимо друг от друга обозначают водород, галоген, гидроксил, (низш.)алкил, галоген(низш.)алкил, (низш.)алкоксигруппу, галоген(низш.)алкоксигруппу, карбоксил, карбамоил, N-(низш.)алкилкарбамоил, N,N-ди(низш.)алкилкарбамоил или нитрил,

R₂ и R₄ одновременно или независимо друг от друга обозначают водород, незамещенный или замещенный (низш.)алканоил или ароил, или радикал, который может быть удален в физиологических условиях, например, защитную группу,

R₃ обозначает водород, (низш.)алкил, гидрокси(низш.)алкил, галоген(низш.)алкил, карбокси(низш.)алкил, (низш.)алкоксикарбонил(низш.)алкил, R₆R₇ N-C(O)-(низш.)алкил, незамещенный или замещенный арил или арил(низш.)алкил или незамещенный или замещенный гетероарил или гетероаралкил,

R₆ и R₇ одновременно или независимо друг от друга обозначают водород, (низш.)алкил, гидрокси(низш.)алкил, алкокси(низш.)алкил, гидроксиалкокси(низш.)алкил, амино(низш.)алкил, N-(низш.)алкиламино(низш.)алкил, N,N-ди(низш.)алкиламино(низш.)алкил, N-(гидрокси(низш.)алкил)амино(низш.)алкил, N,N-ди(гидрокси(низш.)алкил)амино(низш.)алкил или вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют азаалициклический цикл,

или его фармацевтически приемлемой соли для лечения биопленок Р.aeruginosa.

Предпочтительно, изобретение относится к вышеописанному применению, включающему по меньшей мере одно соединение формулы (I), в котором R₁ и R₅ одновременно и независимо друг от друга обозначают водород, галоген, гидроксил, (низш.)алкил, галоген(низш.)алкил, (низш.)алкоксигруппу или галоген(низш.)алкоксигруппу, R₂ и R₄ одновременно и независимо друг от друга обозначают водород или радикал, который можно удалить в физиологических условиях, R₃ обозначает (низш.)алкил, гидрокси(низш.)алкил, карбокси(низш.)алкил, (низш.)алкоксикарбонил(низш.)алкил, R₆R₇N-C(O)-(низш.)алкил, замещенный арил, арил(низш.)алкил, замещенный N-(низш.)алкиламиногруппой, N,N-ди(низш.)алкиламиногруппой или пирролидиногруппой, или незамещенный или замещенный гетероарил или гетероаралкил, R₆ и R₇ одновременно и независимо друг от друга обозначают водород, (низш.)алкил, гидрокси(низш.)алкил, алкокси(низш.)алкил, гидроксиалкокси(низш.)алкил, амино(низш.)алкил, N-(низш.)алкиламино(низш.)алкил, N,N-ди(низш.)алкиламино(низш.)алкил, N-(гидрокси(низш.)алкил)амино(низш.)алкил, N,N-ди(гидрокси(низш.)алкил)амино(низш.)алкил или вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют азаалициклический цикл, или его соли и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, и к способам их получения.

Предпочтительно в соответствии с вышеизложенным, предпочтительным соединением формулы I является 4-[3,5-бис(2-гидроксифенил)-[1,2,4]триазол-1-ил]бензойная кислота или ее фармацевтически приемлемая соль.

Соединения формулы I получают, как описано, например, в US 6596750 B2 или US 6465504 B1 или EP 0914118.

Галоген обозначает, например, хлор, бром или фтор, а также иод.

Приставка "низш." обозначает радикал, содержащий не более 7 и прежде всего не более 4 атомов углерода.

Алкил обозначает радикал с прямой или разветвленной цепью. (Низш.)алкил как таковой или в составе других групп, например (низш.)алкоксигруппы, (низш.)алкиламиногруппы, (низш.)алканоила, (низш.)алкиламинокарбонила, незамещен или замещен, например, галогеном, гидроксилом, (низш.)алкоксигруппой, трифторметилом, цикло(низш.)алкилом, азаалициклилом или фенилом, предпочтительно незамещен или замещен гидроксилом.

Например, (низш.)алкил обозначает н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, неопентил, н-гексил или н-гептил, предпочтительно метил, этил и н-пропил. Галоген(низш.)алкил обозначает (низш.)алкил, замещенный галогеном, предпочтительно хлором или фтором, прежде всего одним-тремя атомами хлора или фтора.

(Низш.)алкоксигруппа обозначает, например, н-пропоксигруппу, изопропоксигруппу, н-бутоксигруппу, изобутоксигруппу, втор-бутоксигруппу, трет-бутоксигруппу, н-амилоксигруппу, изоамилоксигруппу, предпочтительно метоксигруппу и этоксигруппу. Галоген(низш.)алкоксигруппа обозначает (низш.)алкоксигруппу, замещенную галогеном, предпочтительно хлором или фтором, прежде всего одним-тремя атомами хлора или фтора.

Карбамоил обозначает радикал H₂ N-C(O)-, N-(низш.)алкилкарбамоил обозначает (низш.)алкил-HN-С(О)-, а N,N-ди(низш.)алкилкарбамоил обозначает ди(низш.)алкил-N-С(O)-.

(Низш.)алканоил обозначает HC(O)- и (низш.)алкил-C(O)-, например ацетил, пропаноил, бутаноил или пивалоил.

(Низш.)алкоксикарбонил обозначает радикал (низш.)алкил-О-С(О)-, например н-пропоксикарбонил, изопропоксикарбонил, н-бутоксикарбонил, изобутоксикарбонил, втор-бутоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил, н-амилоксикарбонил, изоамилоксикарбонил, предпочтительно метоксикарбонил и этоксикарбонил.

Арил, например, в виде арила или в составе других групп, например арил(низш.)алкила или ароила, обозначает, например, фенил или нафтил, замещенный или незамещенный. Арил предпочтительно обозначает фенил, незамещенный или замещенный одним или более, прежде всего одним или двумя заместителями, например (низш.)алкилом, (низш.)алкоксигруппой, гидроксилом, нитрогруппой, галогеном, трифторметилом, карбоксилом, (низш.)алкоксикарбонилом, аминогруппой, N-(низш.)алкиламиногруппой, N,N-ди(низш.)алкиламиногруппой, аминокарбонилом, (низш.)алкиламинокарбонилом, ди(низш.)алкиламинокарбонилом, гетероциклоалкилом, гетероарилом или цианогруппой. Прежде всего арил обозначает незамещенный фенил или нафтил, или фенил, замещенный (низш.)алкилом, (низш.)алкоксигруппой, гидроксилом, галогеном, карбоксилом, (низш.)алкоксикарбонилом, N,N-ди(низш.)алкиламиногруппой или гетероциклоалкилкарбонилом.

Ароил обозначает радикал арил-С(О)-, например бензоил, толуоил, нафтоил или пара-метоксибензоил.

Арил(низш.)алкил обозначает, например, бензил, пара-хлорбензил, орто-фторбензил, фенилэтил, пара-толилметил, пара-диметиламинобензил, пара-диэтиламинобензил, пара-цианобензил, пара-пирролидинобензил.

Гетероциклоалкил обозначает циклоалкил, содержащий в цикле от 3 до 8, прежде всего от 5 до не более 7 атомов, в том числе по меньшей мере один гетероатом, предпочтительно атом кислорода и серы. Азаалициклил обозначает насыщенный циклоалкил, содержащий в цикле от 3 до 8, прежде всего от 5 до 7 атомов, из которых по меньшей мере один атом является атомом азота. Азаалициклил может также содержать в цикле другие гетероатомы, например атомы кислорода, азота или серы, например, может обозначать пиперидинил, пиперазинил, морфолинил или пирролидинил. Азаалициклил незамещен или замещен галогеном или (низш.)алкилом. Азаалициклильные радикалы, присоединенные через атом азота, который является предпочтительным, обозначаются как пиперидино, пиеразино, морфолино, пирролидино и т.д.

Гетероарил как таковой, например гетероарил, или в составе других заместителей, например гетероарил(низш.)алкила, обозначает ароматический радикал, содержащий в цикле от 3 до не более 7, прежде всего от 5 до не более 7 атомов, в том числе по меньшей мере один гетероатом, т.е. обозначает пирролил, имидазолил, триазолил, тетразолил, оксазолил, тиазолил, фуранил, тиофенил, пиридил, пиразинил, оксазинил, тиазинил, пиранил или пиримидинил. Гетероарил замещен или незамещен. Предпочтителен гетероарил, незамещенный или замещенный одним или более, прежде всего одним или двумя заместителями, например (низш.)алкилом, галогеном, трифторметилом, карбоксилом или (низш.)алкоксикарбонилом.

Гетероарил(низш.)алкил обозначает (низш.)алкил, в котором по меньшей мере один из атомов водорода, предпочтительно при концевом атоме углерода, заменен на гетероарил, при условии, что алкил содержит два или более атомов углерода.

N-(Низш.)алкиламиногруппа обозначает, например, н-пропиламиногруппу, н-бутиламиногруппу, изопропиламиногруппу, изобутиламиногруппу, гидроксиэтиламиногруппу, предпочтительно метиламиногруппу и этиламиногруппу. Алкильные заместители в составе N,N-ди(низш.)алкиламиногруппы являются идентичными или различными. Таким образом, N,N-ди(низш.)алкиламиногруппа обозначает, например, N,N-диметиламиногруппу, N,N-диэтиламиногруппу, N,N-метилэтиламиногруппу, N-метил-N-морфолиноэтиламиногруппу, N-метил-N-гидроксиэтиламиногруппу или N-метил-N-бензиламиногруппу.

Защитные группы, способы их введения и удаления описаны, например, в монографиях McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, London, New York (1973), Methoden der organischen Chemie [Methods of organic chemistry], Houben-Weyl, 4 изд., т.1571, Georg Thieme, Stuttgart (1974) и Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley, New York (1981). Для защитных групп характерно, что их можно удалить простыми методами, т.е. без нежелательных побочных реакций, обычно сольволизом, восстановлением, фотолизом, а также с использованием ферментов, например, в условиях, аналогичных физиологическим условиям, причем характерно, что эти группы отсутствуют в конечных продуктах.

Гидроксигруппы могут, например, присутствовать в форме легко расщепляемой сложноэфирной группы или в виде простого эфира, предпочтительно алканоильной или аралканоильной сложноэфирной группы или циклогетероалкильных, аралкильных или алкоксиалкильных простых эфиров, а также в виде сложного силилового или простого силильного эфира, прежде всего ацетильного или бензоильного сложного эфира или в виде тетрагидропиранилового, бензилового или метоксиметилового простого эфира.

Соли соединений формулы (I) являются фармацевтически приемлемыми солями, прежде всего солями оснований, такими как соответствующие соли щелочного или щелочно-земельного металла, например соли натрия, калия или магния, фармацевтически приемлемые соли переходного металла, такие как соли цинка, или соли органических аминов, таких как циклические амины, моно-, ди- или три(низш.)алкиламины, такие как гидрокси(низш.)алкиламины, например моно-, ди- или тригидрокси(низш.)алкиламины, гидрокси(низш.)алкил(низш.)алкиламины или полигидрокси(низш.)алкиламины. Циклическими аминами являются, например, морфолин, тиоморфолин, пиперидин или пирролидин. Пригодными моно(низш.)алкиламинами являются, например, этил- и трет-бутиламин, ди(низш.)алкиламинами являются, например, диэтил- и диизопропиламин, а три(низш.)алкиламинами являются, например, триметил- и триэтиламин. Пригодными гидрокси(низш.)алкиламинами являются, например, моно-, ди- и триэтаноламин, гидрокси(низш.)алкил(низш.)алкиламинами являются, например, N,N-диметиламино- и N,N-диэтиламиноэтанол, пригодным полигидрокси(низш.)алкиламином является, например, глюкозамин. В других вариантах возможно образование кислотно-аддитивных солей, например, сильных неорганических кислот, таких как минеральные кислоты, например серная кислота, фосфорная кислота или галогенводородная кислота, сильных органических кислот, таких как (низш.)алканкарбоновые кислоты, например уксусная кислота, таких как насыщенные или ненасыщенные дикарбоновые кислоты, например малоновая, малеиновая или фумаровая кислота, или таких как гидроксикарбоновые кислоты, например винная или лимонная кислота, или сульфоновых кислот, таких как (низш.)алкан- или замещенные или незамещенные бензолсульфоновые кислоты, например метан- или пара-толуолсульфоновая кислота. Соединения формулы (I), содержащие кислотную группу, например карбоксигруппу, и основную группу, например аминогруппу, могут также присутствовать в форме внутренних солей, т.е. в форме цвиттериона, или часть молекулы может присутствовать в форме внутренней соли, а другая часть в форме обычной соли.

Соединения, включая их соли, могут также присутствовать в форме гидратов или сольватов или их кристаллы могут включать, например, растворитель, используемый для кристаллизации.

Соединения формулы I и их соли, в зависимости от выбора исходных материалов и методик, могут присутствовать в форме одного из возможных изомеров, например стереоизомеров или таутомеров, или их смесей. В связи с этим получаемые чистые изомеры представляют собой, например, чистые энантиомеры, чистые диастереоизомеры или чистые таутомеры. Соответственно, смеси изомеров представляют собой, например, рацематы или смеси диастереоизомеров. Смеси изомеров соединений формулы I, в свободной форме или в форме соли, разделяют на компоненты обычным способом, например, используя различие в физико-химических свойствах, например фракционной кристаллизацией, перегонкой и/или хроматографией. Предпочтительно выделяют более активный изомер.

Таким образом, одним объектом изобретения является способ лечения пленкообразования у млекопитающих. В указанном способе используется вышеуказанный класс комплексонов железа, которые были ранее получены и оказались пригодными для лечения заболеваний, которые вызывают избыток железа в организме человека или животного или как указано в US 6596750 вызываются избытком железа.

Предпочтительным соединением I формулы I является 4-[3,5-бис(2-гидроксифенил)-[1,2,4]триазол-1-ил]бензойная кислота или ее фармацевтически приемлемая соль. Фармацевтический препарат, включающий соединение I, описан, например, в международной заявке WO 2004/035026. Соединение I можно вводить в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Настоящее изобретение относится к применению соединения формулы I

где

R₁ и R ₅ одновременно или независимо друг от друга обозначают водород, галоген, гидроксил, (низш.)алкил, галоген(низш.)алкил, (низш.)алкоксигруппу, галоген(низш.)алкоксигруппу, карбоксил, карбамоил, N-(низш.)алкилкарбамоил, N,N-ди(низш.)алкилкарбамоил или нитрил,

R₂ и R₄ одновременно или независимо друг от друга обозначают водород, незамещенный или замещенный (низш.)алканоил или ароил, или радикал, который можно удалить в физиологических условиях, например, защитную группу,

R₃ обозначает водород, (низш.)алкил, гидрокси(низш.)алкил, галоген(низш.)алкил, карбокси(низш.)алкил, (низш.)алкоксикарбонил(низш.)алкил, R₆R₇ N-C(O)-(низш.)алкил, незамещенный или замещенный арил или арил(низш.)алкил, или незамещенный или замещенный гетероарил или гетероаралкил,

R₆ и R₇ одновременно или независимо друг от друга обозначают водород, (низш.)алкил, гидрокси(низш.)алкил, алкокси(низш.)алкил, гидроксиалкокси(низш.)алкил, амино(низш.)алкил, N-(низш.)алкиламино(низш.)алкил, N,N-ди(низш.)алкиламино(низш.)алкил, N-(гидрокси(низш.)алкил)амино(низш.)алкил, N,N- ди(гидрокси(низш.)алкил)амино(низш.)алкил или вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют азаалициклический цикл, предпочтительно соединения I или его фармацевтически приемлемой соли, и где приставка "низш." обозначает радикал, содержащий не более 7 атомов углерода, например 4-[3,5-бис(2-гидроксифенил)-[1,2,4]триазол-1-ил]бензойная кислота, в другом варианте в комбинации с антибиотиком, выбранным из группы, включающей аминогликозиды, например гентамицин, амикацин, тобрамицин, хинолоны, например ципрофлоксацин и левофлоксацин, цефалоспорины, например цефтазидим, цефепим, цефпиром, уреидопенициллины, такие как пиперациллин, тикарциллин, карбапенемы, такие как меропенем, имипенем, полимиксины, такие как полимиксин B, колистин, и монобактамы, такие, например, как азтреонам, например, в форме фиксированной комбинации,

(1) для получения лекарственного средства, предназначенного для лечении хронической инфекции Р.aeruginosa,

(2) для получения лекарственного средства, предназначенного для подавления образования биопленки,

(3) для получения лекарственного средства, предназначенного для подавления образования биопленки бактерией Р.aeruginosa,

(4) для получения лекарственного средства, предназначенного для подавления образования биопленки бактерией Р.aeruginosa у пациентов с муковисцидозом,

(5) для получения лекарственного средства, предназначенного для предотвращения образования биопленки бактерией Р.aeruginosa,

(6) для получения лекарственного средства, предназначенного для предотвращения образования биопленки бактерией Р.aeruginosa у пациентов с муковисцидозом,

(7) для уменьшения или удаления биопленки, образованной Р.aeruginosa,

(8) для нарушения образования биопленки, например, бактерией P.aeruginosa,

(9) для разрушения образованной биопленки, например, Р.aeruginosa.

Настоящее изобретение относится к способу уменьшения и/или удаления биопленок на медицинских устройствах, например катетерах, где указанные устройства обрабатывают соединением I.

В другом варианте изобретение относится к комбинации соединения формулы I с антибиотиком, который является активным в отношении Р. aeruginosa. Настоящее изобретение относится к указанной комбинации, где антибиотик выбирают из группы, включающей аминогликозиды, например гентамицин, амикацин, тобрамицин, хинолоны, например ципрофлоксацин и левофлоксацин, цефалоспорины, например цефтазидим, цефепим, цефпиром, уреидопенициллины, такие как пиперациллин, тикарциллин, карбапенемы, такие как меропенем, имипенем, полимиксины, такие как полимиксин В, колистин, и монобактамы, такие, например, как азтреонам. Предпочтительно антибиотик обозначает гентамицин или тобрамицин.

Настоящее изобретение относится к комбинации, включающей (а) соединение формулы I, описанное выше, предпочтительно 4-[3,5-бис(2-гидроксифенил)-[1,2,4]триазол-1-ил]бензойную кислоту, или ее фармацевтически приемлемую соль и (б) антибиотик, выбранный из группы, включающей аминогликозиды, хинолоны, цефалоспорины, уреидопенициллины, карбапенемы, полимиксины и монобактамы.

Любая комбинация компонентов (а) и (б), способ лечения теплокровного животного, включающий введение указанных двух компонентов, фармацевтическая композиция, включающая указанные два компонента, для одновременного, раздельного или последовательного введения, применение комбинации для замедления прогрессии или лечения или применение, указанное выше в пунктах (1)-(7), или для получения фармацевтического препарата для указанных целей или коммерческий продукт, включающий такую комбинацию компонентов (а) и (б), как и все указанное выше, относится также к комбинации по изобретению, т.е. указанный термин относится к каждому из указанных вариантов, которые таким образом могут заменять указанный термин.

Одновременное введение можно, например, проводить в форме одной фиксированной комбинации двух или более активных ингредиентов или вводить одновременно два или более активных ингредиента, которые перерабатывают независимо. Последовательное применение означает, например, введение одного или более компонентов комбинации одновременно, а другие компоненты можно вводить в разное время, т.е. поочередно, при этом комбинация предпочтительно оказывает более эффективное действие по сравнению с независимым введением отдельных соединений, например, прежде всего наблюдается синергетическое действие. Раздельное применение предпочтительно означает, например, введение компонентов комбинации независимо друг от друга в разное время, предпочтительно означает, что компоненты (а) и (б) вводят поочередно, но при этом не наблюдается перекрывания измеряемых уровней обоих соединений в крови, например, в одно и то же время.

Пример 1

Материалы и методы

Действие на рост Р.aerusinosa

Бактерии выращивали в присутствии или в отсутствие соединения I, например, при концентрации, которая наблюдается в периферической крови, в аэробных и анаэробных условиях в отсутствие и в присутствии (10, 30 и 50 мкМ) железа. Средняя концентрация железа в мокроте больных (МБ) обычно составляла 30 мкМ. Действие на рост бактерии определяли стандартным методом, который включал внесение аликвотных частей посевного материала, например, 500 мкл, содержащих приблизительно 10⁶ бактерий, в минимальной среде, содержащей сукцинат, в пробирки из боросиликатного стекла, например, размером 12×75 мм, которые затем инкубировали в аэробных и анаэробных условиях, например, при 37°C. Каждый эксперимент проводили в трех повторах и каждую пробирку извлекали из термостата через равные промежутки времени, например через 0, 4, 8, 12, 16, 20 и 24 ч, и измеряли оптическую плотность культуры при 570 нм в качестве показателя уровня роста. Анаэробные условия создавали в системе AnaerogenTM (фирма Oxoid). При проведении испытаний в анаэробных условиях использовали несколько параллельных образцов, чтобы культуры практически не контактировали с кислородом, т.е. для проведения измерений через необходимые промежутки времени использовали 7 параллельных образцов.

Действие на подвижность Р.aeruginosa

Подвижность Р.aeruginosa оценивали аналогично тому, как описано в статье Singh и др., Nature, 417 (6888), 552-555 (2002), например, в присутствии дополнительного количества железа. Повышенная и нарушенная подвижность коррелирует с неспособностью Р.aeruginosa агрегировать и инициировать образование биопленки in vivo. Анализ подвижности проводили на агаре, например, регистрируя скольжение, рост и резкие движения бактерии, например, в отсутствие или в присутствии 30 мкМ железа и затем в присутствии или в отсутствие соединения I, с использованием соответствующих методов.

Действие на биопленки Р.aeruginosa

Для анализа использовали две короткоживущих модели биопленки, пригодные для исследования ранних стадий образования биопленки: в пробирках из боросиликатного стекла и на покровном стекле.

В обеих моделях рост биопленки исследовали в присутствии или в отсутствии соединения I, в аэробных и анаэробных условиях в отсутствии и в присутствии (10, 30 и 50 мкМ) железа. Подавление образования биопленки соединением I оценивали стандартными методами, т.е. измерением оптической плотности, конфокальной томографией, например, с использованием программы COMSTAT, позволяющей анализировать структуру биопленки в трехмерном измерении. Система визуализации и использование окрашивания жизнеспособных/мертвых клеток красителем BacLight (фирма Molecular Probes) в экспериментах на покровном стекле позволяет определять действие соединений как на микроколонии бактерии, так и на структуру биопленки.

Действие на резистентность Р.aeruginosa к антибиотикам

Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) аминогликозидов гентамицина и тобрамицина определяли в аэробных и анаэробных условиях в отсутствие дополнительного железа или в присутствии (30 мкМ) железа, в присутствии или в отсутствии соединения I и/или, например, в присутствии различных концентраций соединения I.

Действие на продуцирование бактерией Р. aeruginosa факторов вирулентности

Продуцирование некоторых факторов вирулентности можно стимулировать при выращивании клеток в среде с дефицитом железа. Способность соединения I индуцировать продуцирование фактора вирулентности в присутствии или в отсутствие соединения I определяли по нижеописанной методике.

При этом изучали действие вводимых одновременно соединения I и антибиотиков на подавление образования биопленки клиническими штаммами Р.aeruginosa, выделенными из мокроты пациентов (МБ), и действие на разрушение образованных биопленок на моделях биопленки в проточной кювете продолжительного действия.

Подписи к фигурам

Фиг.1. Действие соединения I на рост Р.aeruginosa и образование биопленок.

Оценивали действие соединения I в различных концентрациях на рост бактерии в аэробных и анаэробных условиях (А) и уровень образования биопленок (Б). В качестве среды использовали MMS, содержащую FeCl₃ (0 или 10 мкМ), клетки культивировали в указанных условиях (37°C, 24 ч). Полученные результаты представляли в виде среднего значения ±СО для одного типичного эксперимента в трех повторах.

Фиг.2. Действие высоких концентраций соединения I на рост Р.aeruginosa и образование биопленок.

Оценивали действие соединения I в различных концентрациях на рост бактерии в аэробных и анаэробных условиях (А) и уровень образования биопленок (Б). В качестве среды использовали MMS, содержащую 10 мкМ FeCl₃, клетки культивировали в указанных условиях (37°C, 24 ч). Полученные результаты представляли в виде среднего значения ±СО для двух экспериментов в трех повторах.

* Означает существенно более низкий уровень по сравнению с уровнем, наблюдаемым при отсутствии комплексона (P<0,05).

Фиг.3. Действие соединения I на развитие биопленки в анаэробных условиях при различной концентрации железа.

Оценивали действие соединения I (1339 мкМ) на развитие биопленки при различной концентрации железа, в отсутствие соединения I (столбики черного цвета) и в присутствии соединения I (1339 мкМ, столбики серого цвета). Полученные результаты представляли в виде среднего значения ±СО для одного типичного эксперимента в трех повторах. *Означает существенно более низкий уровень развития биопленок по сравнению с уровнем, наблюдаемым при аналогичной концентрации железа в отсутствие соединения I (P<0,05).

Фиг.4. Действие соединения I на МИК (А) колистина и (Б) тобрамицина в отношении Р. aeruginosa (штамм РАО1)

МИК определяли в среде MMS, содержащей 10 мкМ FeCl₃, в присутствии соединения I (1339 мкМ, сплошная линия) и в отсутствие соединения I (пунктирная линия). Полученные результаты представляли в виде среднего значения ±СО для типичного эксперимента в каждом случае при двойном повторе.

Фиг.5. Действие соединения I на продуцирование фосфолипазы и экзотоксина А.

Клетки инкубировали в анаэробных условиях (24 ч) в присутствии железа и соединения I (1339 мкМ). Полученные результаты представлены в виде уровня продуцирования фосфолипазы (1 эксперимент) и среднего значения ±СО продуцирования экзотоксина А (1 эксперимент в каждом случае при двойном повторе).

Результаты

1. Действие соединения I на рост бактерий и развитие биопленки.

Действие соединения I на планктонический (свободный) рост и развитие биопленки оценивали на модели короткоживущей биопленки в пробирках из боросиликатного стекла. В указанной модели биопленку выращивали на поверхности стекла, а затем окрашивали и солюбилизировали. Оптическая плотность (ОП при 570 нм) раствора соответствует степени развития биопленки.

В указанной модели рост бактерий и уровень развития биопленки определяли после инкубирования (24 ч, 37°C) в минимальной среде, содержащей сукцинат (MMS) и 10 мкМ FeCl ₃ (в аэробной и анаэробной атмосфере). В связи с низкой растворимостью соединения I в среде MMS (pH 7,0) первоначальные эксперименты проводили при низких концентрациях комплексона, таких как 0-100 мкМ. При указанных низких концентрациях соединение I не оказывало влияния на рост бактерий и уровень развития биопленки в аэробных и анаэробных условиях (Фиг.1).

Соединение I растворяли в ПАВ ПЭГ 400, а затем разбавляли средой MMS до необходимой концентрации до 6695 мкМ соединения I включительно. В отдельных экспериментах установлено, что один ПАВ не оказывает влияния на рост и уровень образования биопленки (данные не приводятся). При более высокой концентрации соединение I существенно подавляет рост Р. aeruginosa и уровень развития биопленки в анаэробных условиях (P<0,05), но не оказывает влияния в аэробных условиях.

Затем исследовали возможность подавления соединением I образования биопленки в анаэробных условиях за счет непосредственного снижения уровня ионов железа в среде или за счет другого независимого от иона железа механизма. При этом исследовали подавление образования биопленки в анаэробных условиях при постоянной концентрации соединения I 1339 мкМ и постепенном повышении содержания иона железа в культуральной среде. Было установлено, что по мере повышения концентрации иона железа соединение I становится менее эффективным. Эти данные свидетельствуют о том, что основное действие опосредовано связыванием иона железа (образование хелатных комплексов) и подавление образования биопленки можно предотвратить за счет высокого уровня ионов железа, превосходящего связывающую способность присутствующего в среде комплексона (соединения I).

2. Соединение I повышает чувствительность Р.aeruginosa к антибиотикам.

В эксперименте определяли минимальные ингибирующие концентрации (МИК) двух антибиотиков, которые обычно используются при лечении пациентов с MB, тобрамицина и колистина, в отношении Р. aeruginosa. Испытания проводили в среде MMS, содержащей 10 мкМ FeCl₃ , в присутствии (1339 мкМ) и в отсутствие соединения I в аэробной и анаэробной атмосфере (Фиг.4). Присутствие соединения I не оказывало влияния на величину МИК.

3. Влияние соединения I на продуцирование факторов вирулентности.

К настоящему времени наиболее исследованными факторами вирулентности являются фосфолипаза С и экзотоксин А (ЭТА). Продуцирование указанных факторов исследовали в анаэробных условиях после инкубации а) в среде MMS, б) в среде MMS, содержащей 10 мкМ FeCl₃ , и, наконец, в) в среде MMS, содержащей 10 мкМ FeCl₃ и соединение I (1339 мкМ). При инкубации в присутствии дополнительного количества иона железа наблюдался повышенный уровень обоих факторов вирулентности по сравнению с культивированием в среде, не содержащей иона железа. При добавлении в среду соединения I такое повышение не наблюдается, т.е. соединение I может влиять на продуцирование фактора вирулентности Р.aeruginosa, ассоциированное с ионом железа (Фиг.5).

Указанные результаты свидетельствуют о терапевтической эффективности соединения I в отношении Р.aeruginosa в условиях, соответствующих MB в легких, т.е. при низких давлениях кислорода и доступном ионе железа.

1. Соединение I существенно нарушает рост Р.aeruginosa и уровень развития биопленки в анаэробных условиях. Это действие непосредственно связано со снижением соединением I уровня иона железа, доступного для Р.aeruginosa.

1. Соединение I не оказывает влияния на МИК антибиотиков тобрамицина и колистина при испытании на планктонических организмах.

3. Соединение I не стимулирует продуцирование фосфолипазы С или экзотоксина А (ЭТА), а напротив снижает продуцирование этих бактериальных факторов вирулентности в присутствии иона железа.