ферментативное обессмоливание с использованием смеси фосфолипаз pla и plc

Формула изобретения

1. Способ обессмоливания масляной композиции, включающий

(a) предоставление масляной композиции, содержащей фосфолипиды,

(b) приведение в контакт указанной масляной композиции одновременно с одним или несколькими ферментами фосфолипазы A (PLA) в количестве приблизительно 2 млн^-1 активного фермента или менее и одним или несколькими ферментами фосфолипазы С (PLC) в количестве приблизительно 30 млн^-1 активного фермента или менее, и

(c) отделение продуктов реакции с фосфолипидами от масляной композиции, где оставшаяся масляная композиция после отделения является обессмоленной масляной композицией,

где продолжительность реакции ферментов с фософлипидами составляет менее одного часа, и где указанная реакция ферментов с фосфолипидами происходит при рН приблизительно 3-7, при температуре приблизительно 40-80°С, и обессмоленная масляная композиция со стадии (с) имеет содержание фосфолипида, измеренное в частях на миллион фосфора, приблизительно 20 млн^-1 или менее.

2. Способ по п.1, где продолжительность реакции ферментов с фосфолипидами составляет приблизительно 30 мин.

3. Способ по п.1, где указанные один или несколько ферментов фосфолипаз А выбраны из группы, состоящей из фермента фосфолипазы А1 и фермента фосфолипазы А2.

4. Способ по п.1, где указанные один или несколько ферментов фосфолипаз С выбраны из группы, состоящей из фермента фосфолипазы С и фосфатидил-инозит-специфичного фермента фосфолипазы С.

5. Способ по п.1, где указанная реакция ферментов с фосфолипидами происходит при рН приблизительно 4-5.

6. Способ по п.1, где указанная реакция ферментов с фосфолипидами происходит при температуре приблизительно 40-80°С.

7. Способ по п.6, где указанная реакция ферментов с фосфолипидами происходит при температуре приблизительно 40-60°С.

8. Способ по п.7, где указанная реакция ферментов с фосфолипидами происходит при температуре приблизительно 45-55°С.

9. Способ по п.1, где указанная масляная композиция содержит неочищенное масло.

10. Способ по п.1, где указанная масляная композиция содержит предварительно обессмоленное масло.

11. Способ по п.1, где указанный фермент PLC присутствует в количестве приблизительно 20 млн^-1 активного фермента или менее.

12. Способ по п.11, где указанный фермент PLC присутствует в количестве приблизительно 10 млн^-1 активного фермента или менее.

13. Способ по п.1, где указанный фермент PLA присутствует в количестве приблизительно 1 млн^-1 активного фермента или менее.

14. Способ по п.13, где указанный фермент PLA присутствует в количестве приблизительно 0,5 млн^-1 активного фермента или менее.

15. Способ по п.1, где во время стадии (b) смесь масляной композиции и ферментов сначала перемешивают со сдвигом.

16. Способ по п.15, где указанное перемешивание со сдвигом продолжается с длительностью по меньшей мере приблизительно 45 с.

17. Способ по п.1, где во время стадии (b) добавляют некоторое количество воды.

18. Способ по п.17, где указанное количество воды составляет по меньшей мере приблизительно 1,5 мас.% от общей смеси.

19. Способ по п.18, где указанное количество воды составляет по меньшей мере приблизительно 3,0 мас.% от общей смеси.

20. Способ по п.19, где указанное количество воды составляет по меньшей мере приблизительно 4,5 мас.% от общей смеси.

21. Способ по п.1, где указанное содержание фосфолипида составляет приблизительно 10 млн^-1 или менее.

22. Способ по п.21, где указанное содержание фосфолипида составляет приблизительно 5 млн^-1 или менее.

23. Способ обессмоливания масла, включающий стадию реакции фермента фосфолипазы А с фосфолипидами в масляной композиции, где способ характеризуется тем, что масляную композицию приводят в контакт одновременно по меньшей мере с одним ферментом фосфолипазой А в количестве приблизительно 2 млн^-1 активного фермента или менее и по меньшей мере с одним ферментом фосфолипазой С в количестве приблизительно 30 млн^-1 активного фермента или менее для реакции с фосфолипидами в масляной композиции, где указанная реакция происходит при рН приблизительно 3-7, при температуре приблизительно 40-80°С.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящая заявка относится к ферментативному способу удаления различных фосфолипидов и лецитинов (вместе известных как «смолы») из растительных масел для получения обессмоленного масляного или жирового продукта, который можно использовать для производства пищевых продуктов и/или для непищевых областей применения. Более конкретно, настоящая заявка относится к способу ферментативной обработки и удаления различных фосфолипидов и лецитинов, где способ можно осуществлять на практике либо для неочищенных масел, либо для обессмоленных водой масел. В одном варианте осуществления ферментативная реакция или период обработки может составлять менее приблизительно часа.

Уровень техники

Неочищенные растительные масла, полученные способами либо прессования, либо экстракции растворителем, представляют собой комплексную смесь из триацилглицеринов, фосфолипидов, стеринов, токоферолов, свободных жирных кислот, следов металлов и других минорных соединений. Желательно удалять фосфолипиды, свободные жирные кислоты и следы металлов, чтобы получить качественное салатное масло с мягким вкусом, светлым цветом и длительным сроком годности.

Удаление фосфолипидов приводит почти ко всем потерям, связанным с рафинированием растительных масел. Как проиллюстрировано на фиг.1, фосфолипиды содержат фосфатную группу на одном из двух концов глицеринового остова, в то время как триацилглицерин содержит по меньшей мере одну жирную кислоту.

Фосфатная группа фосфолипида является «гидрофильной» или «водолюбивой», что означает, что функциональная группа X притягивается к воде. Цепи жирных кислот фосфолипидов R1 и R2 являются «липофильными» или «липидолюбивыми», что означает, что они притягиваются к липидам. Поскольку молекула фосфолипида обладает как гидрофильной функциональной группой, так и липофильными цепями жирных кислот, она является отличным естественным эмульгатором.

Содержащая фосфат функциональная группа фосфолипидов, обозначенная на фиг.1 как «X», определяет степень их гидрофильной природы. Функциональная группа X на фиг.1 может относиться к любому из нескольких разнообразных известных типов, некоторые из которых проиллюстрированы на фиг.2.

Фосфолипиды, содержащие функциональные группы - холин и этаноламин, обладают большей аффинностью к воде, в то время как кислоты, кислые соли (кальция, магния и железа) и инозит обладают меньшими аффинностями к воде. Фосфатидная кислота и соли фосфатидной кислоты являются общеизвестными как «негидратируемые фосфолипиды» или NHP. Фосфолипиды обычно определяют в масле как «содержание фосфора» в частях на миллион. Таблица 1 содержит типичные количества фосфолипидов, присутствующие в семенах основных сельскохозяйственных масличных растений, и распределение различных функциональных групп в виде процента фосфолипидов, присутствующих в масле.

Композиция фосфолипидов

Таблица 1 Типичные уровни и распределения фосфолипидов для общепринятых семян масличных растений
	Соевое масло	Масло канолы	Подсолнечное масло
P (ч./млн)	400-1200	200-900	300-700
PC (-холин)	12-46%	25-40%	29-52%
PE (-этаноламин)	8-34%	15-25%	17-26%
PA (-кислота)	2-21%	10-20%	15-30%
PI (-инозит)	2-15%	2-25%	11-22%

Фосфолипиды можно частично или полностью удалять из растительных масел посредством нескольких различных известных способов. Наиболее общепринятыми в промышленности способами являются водное обессмоливание, кислое обессмоливание, щелочное рафинирование и ферментативное обессмоливание.

Водное обессмоливание

Данный способ обычно применяют к неочищенным маслам, содержащим большое количество гидратируемых фосфолипидов. Благодаря их мягким характеристикам, полученные фосфолипиды можно использовать как лецитин (естественный эмульгатор). Масло, полученное таким способом, как правило, обозначают в данной области как «обессмоленное», несмотря на то что оно является только частично обессмоленным. Поскольку обессмоленное водой масло еще содержит большие количества фосфолипидов, особенно негидратируемых фосфолипидов, применение других технологий способа, таких как щелочное рафинирование или обессмоливание ферментом PLA1, может быть необходимым для получения готового высококачественного масла, обладающего высокой стабильностью и неинтенсивной окраской.

В способе водного обессмоливания воду (1-5% мас./мас.) добавляют к неочищенному маслу при 60-75°C с интенсивным перемешиванием. Затем масло осторожно перемешивают от 15 до 60 минут для облегчения гидратации фосфолипидов, присутствующих в масле. Гидратация фосфолипидов или «смол» вызывает набухание и агломерацию смол в виде флокулянта. Флокулянт представляет собой эмульсию или смесь гидратированных смол и масла. Эмульсия обладает специфической плотностью, более высокой, чем у масла, и ее можно отделить осаждением, фильтрацией или промышленной практикой центрифугирования. Центрифугированием получают два потока, обессмоленного водой масла и влажных смол. Способом водного обессмоливания удаляют преимущественно только гидратируемые фосфолипиды. Оставшиеся фосфолипиды (50-250 ч./млн), определенные как соли фосфатидной кислоты и/или PI, можно удалять в последующих операциях переработки.

Отделенные влажные смолы присутствуют в эмульгированной масляной смеси, содержащей по меньшей мере одну молекулу триацилглицерина (или масла) на каждые две молекулы фосфолипида (или смолы). Такое эмульгированное масло невозможно физически отделить или выделить из эмульсии, и его рассматривают как связанные со способом потери. Смолы можно высушить и продавать как пищевой лецитин, но обычно их используют в качестве побочного продукта для других областей применения, таких как корм для животных или в промышленном способе, с уменьшенной экономической ценностью.

Потеря масла в ходе эмульгации является значительной, с отрицательным вкладом в общий экономический баланс стоимости способа для рафинированного масла.

Кислое обессмоливание

Данный способ обычно применяют для неочищенных масел, когда целью является полное удаление фосфолипидов. Полученное масло в промышленности обычно называют «супер-обессмоленным» или «полностью обессмоленным».

Неочищенное масло обрабатывают 250-2000 ч./млн фосфорной кислоты или лимонной кислоты при 60-90°C с интенсивным перемешиванием. Кислоте дают взаимодействовать с солями NHP в течение периода 10-90 минут. Кислота улучшает гидрофильные свойства NHP, таким образом, способствуя их удалению. Затем воду (1-5% мас./мас.) добавляют к обработанному кислотой неочищенному маслу при 60-75°C с интенсивным перемешиванием. Затем масло осторожно перемешивают от 15 до 60 минут для облегчения гидратации фосфолипидов. Гидратация фосфолипидов или «смол» вызывает набухание и агломерацию смол в виде флокулянта. Флокулянт представляет собой эмульсию или смесь гидратированных смол и масла. Эмульсия обладает специфической плотностью, более высокой, чем у масла, и ее можно отделить осаждением, фильтрацией или промышленной практикой центрифугирования. Центрифугированием получают кислое обессмоленное масло и влажную смолу. Способом кислого обессмоливания удаляют большинство фосфолипидов, но еще остается достаточно (25-100 ч./млн) в обессмоленном масле для необходимости дополнительной обработки. Для применения в отраслях пищевой промышленности обессмоленное масло обычно подвергают обесцвечиванию и дезодорированию по способу, известному в промышленности как «физическое рафинирование». Смолы, обработанные кислотой, более непригодны для пищевого лецитина.

Как и в способе водного обессмоливания, отделенные и безводные смолы в способе обессмоливания кислотой содержат по меньшей мере одну молекулу триацилглицерина (или масла) на каждые две молекулы фосфолипида (или смолы). Такое эмульгированное масло невозможно физически отделить или выделить, и его рассматривают как связанные со способом потери, с отрицательным вкладом в общий экономический баланс стоимости способа для рафинированного масла.

Щелочное рафинирование

Данный способ обычно применяют для неочищенных или обессмоленных водой масел, когда целью является удаление всех фосфолипидов и свободных жирных кислот.

Неочищенное или обессмоленное водой масло обрабатывают 200-1000 ч./млн фосфорной кислоты или лимонной кислоты при 60-90°C с интенсивным перемешиванием. Кислоте дают взаимодействовать с солями NHP от 10 до 90 минут. Кислота улучшает гидрофильные свойства NHP, таким образом, способствуя их удалению. Разбавленный раствор гидроксида натрия (10-18% мас./мас.) добавляют к обработанному кислотой маслу при 65-75°C. Количество гидроксида натрия (щелочи) основано на количестве свободных жирных кислот, присутствующих в масле, так же как на избытке 0,05-0,20% на основании сухого вещества. Щелочной раствор нейтрализует свободные жирные кислоты (образуя натриевые мыла), нейтрализует избыток кислоты и с образованными натриевыми мылами способствует гидратации и эмульгированию всех оставшихся фосфолипидов.

Раствор гидроксида натрия/масла перемешивают в течение приблизительно 10 минут, затем разделяют осаждением, фильтрацией или промышленной практикой центрифугирования. Центрифугированием получают обработанное щелочью масло и сырье для получения мыла. Обработанное щелочью масло затем «промывают» с помощью 10-20% смягченной воды при 90-95°C и снова центрифугируют. Масло из центрифуги известно как «однократно рафинированное», а вода общеизвестна как «смывная вода». Для применения в отраслях пищевой промышленности «однократно рафинированное» масло обычно подвергают обесцвечиванию и дезодорированию для получения салатного масла. Альтернативой промыванию водой является обработка обработанного щелочью масла абсорбирующим силикагелем и отфильтровывание остаточных мыл и фосфолипидов, не удаленных начальным центрифугированием.

Как и для способов обессмоливания водой и кислотой, отделенные и безводные смолы в способе щелочного рафинирования содержат одну молекулу триацилглицерина (или масла) на каждые две молекулы фосфолипида (или смолы). Такое эмульгированное масло невозможно физически отделить или выделить, и его рассматривают как связанные со способом потери. Кроме того, гидроксид натрия будет вступать в реакцию с нейтральным маслом, образуя мыла, таким образом, дополнительно уменьшая общий выход масла с отрицательным вкладом в общий экономический баланс стоимости способа для рафинированного масла.

Ферментативная обработка

Другим способом рафинирования, применяемым в промышленности растительного масла, является «ферментативное рафинирование» или «ферментативное обессмоливание». Ферментативное обессмоливание используют, когда целью является полное удаление фосфолипидов. Как правило, ферментативные обработки для обессмоливания предшествующего уровня техники осуществляли на практике для масел, которые были предварительно обессмолены одним из других способов, обычно водным обессмоливанием. Для применения в отраслях пищевой промышленности ферментативно обессмоленное масло затем подвергают обесцвечиванию и дезодорированию способом, известным в промышленности как «физическое рафинирование». Ферментативное обессмоливание обеспечивает лучший выход масла, чем водное, кислое или щелочное обессмоливание, с улучшенными экономическими результатами.

Ферментативная реакция изменяет природу фосфолипида, отщепляя некоторые из частей фосфолипида. Это уменьшает эмульгирующие свойства фосфолипидов, так что теряется меньше масла, когда смолы отделяют от масла, таким образом, сохраняя масло. Ферменты, обладающие активностью по отношению к фосфолипидам, обычно называют «фосфолипазами». Типы фосфолипаз основаны на положении в молекуле фосфолипида, с которым вступает в реакцию фермент, и известны как PLA1, PLA2, PLC и PLD. Положения в молекуле фосфолипида, с которыми вступают в реакцию различные типы фосфолипаз, проиллюстрированы на фиг.3.

На фиг.3 можно видеть, что различные типы фосфолипаз будут образовывать различные соединения при взаимодействии с фосфолипидами. Кроме того, каждый тип фосфолипазы обладает своей собственной скоростью реакции и своими собственными условиями реакции по отношению к pH, % воды и температуре. Для PLA при использовании отдельно, как правило, необходимо время реакции по меньшей мере приблизительно 4 часа, в то время как для PLC при использовании отдельно, как правило, необходимо время реакции приблизительно один час. Известно, что ферментативную обработку следует проводить при pH, меньшем или равном 8, чтобы минимизировать нежелательное омыление масла, однако PLA обладает оптимальным pH реакции 4,5, в то время как PLC обладает оптимальным pH реакции 7,0. Каждый фермент обладает также различной термоустойчивостью. Ферменты PLA будут денатурировать приблизительно при 50°C, в то время как ферменты PLC будут денатурировать приблизительно при 65°C.

Последовательности аминокислот с фосфолипазной активностью широко опубликованы в литературе и описаны в патентах, и опубликовано, что некоторые из них обладают активностью по отношению к фосфолипидам, присутствующим в растительных маслах. Все это известно в данной области.

Одним из коммерческих ферментных продуктов PLA1 с фосфолипазной активностью является фосфолипаза из Novozymes A1 Lecitase® Ultra. Известно, что этот продукт образует полярные лизофосфолипиды и полярные жирные кислоты при смешивании с обессмоленным маслом с 1-1,5% буфера лимонная кислота-NaOH в воде, при 4,5<pH<7,0 и 40°C<T<55°C, как описано в Novozymes Application Sheet Oils & Fats# 2002-185255-01 и 2002-05894-03. PLA1 избирательно гидролизует жирную кислоту напротив фосфатной функциональной группы на глицериновом остове, как проиллюстрировано на фиг.4.

Итоговая реакция приводит к образованию лизофосфолипида и жирной кислоты. Молекула лизофосфолипида теряет одну гидрофильную функциональную группу, а оставшаяся группа спирта в участке реакции является гидрофильной. Теперь, с двумя гидрофильными участками, молекула лизофосфолипида является водорастворимой и теряет свои эмульгирующие свойства. Способ обессмоливания PLA1, таким образом, уменьшает потери при рафинировании вследствие того, что больше не удаляет никакого нейтрального масла со смолами, и единственной потерей является исходная молекула фосфолипида.

В то время как ферментативное обессмоливание дает значительные преимущества предприятиям по переработке масла, оно обладает также определенными недостатками. Одним из недостатков является то, что реакция фермента с фосфолипидами может быть медленной и требующей затрат времени. В частности, реакция ферментов фосфолипаз A с фосфолипидами может занимать много часов, в зависимости от таких переменных реакций, как pH, температура, относительные концентрации и условия перемешивания. Такие продолжительные периоды времени реакции могут оказывать значительное отрицательное влияние на общую экономическую выгоду способов ферментативного обессмоливания. Обусловленное медленной реакцией PLA ферментативное обессмоливание, как правило, проводят в масляных композициях, которые сначала подвергали водному обессмоливанию. Таким образом, масло должно быть обессмолено дважды для получения продукта, который имеет уровень содержания фосфора, достаточно низкий для его намеченных целей.

В данной области известно, что ферменты PLC вступают в реакцию с фосфолипидом путем избирательного гидролиза фосфатной функциональной группы, как показано на фиг.5. Итоговая реакция приводит к образованию диацилглицерина («DAG») и фосфатидной группы. Молекула диацилглицерина больше не имеет фосфатной функциональной группы, и ее не нужно удалять. Способ обессмоливания PLC снижает потери при рафинировании за счет сохранения исходной молекулы фосфолипида при удалении только фосфатной функциональной группы. Однако PLC не вступает в реакцию со всеми фосфолипидами, присутствующими в масле. Как правило, PLC не вступает в реакцию ни с фосфатидной кислотой (PA), ни с фосфатидным инозитом (PI), проиллюстрированными на фиг.2. Как PA, так и PI, еще являются негидратируемыми фосфатидами, которые остаются в масле после водного обессмоливания. Таким образом, обработанное PLC масло необходимо дополнительно обрабатывать щелочью для удаления остаточных смол.

Известно, что конкретные PLC будут вступать в реакцию только с конкретными фосфатидными группами. Например, известна PI-специфичная PLC, идентифицированная как PI-PLC.

Таким образом, в одном аспекте изобретения представлен способ ферментативного обессмоливания масел, в котором скорость ферментативной реакции больше, чем в способах ферментативного обессмоливания предшествующего уровня техники.

В другом аспекте изобретения представлен способ увеличения скорости реакции фермента фосфолипазы A, применяемого в способе ферментативного обессмоливания.

В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ обессмоливания масляной композиции, в котором как гидратируемые, так и негидратируемые фосфолипиды можно обрабатывать в одном способе.

В другом аспекте настоящего изобретения представлены такие способы ферментативного обессмоливания и обработки, в которых продолжительность ферментативной реакции составляет менее приблизительно одного часа.

Следующие ссылки относятся к области ферментативного обессмоливания масел.

В US 5264367 от Aalrust et al. описано применение фосфолипаз A1, A2 или B для обработки масла, которое сначала рафинировали до 50-250 ч./млн фосфора. Технология, описанная в данном патенте, коммерчески известна как Enzymax®. Aalrust утверждает, что поскольку эти ферменты атакуют лецитин, «не имеет смысла использовать способ по изобретению для масел, обладающих высоким содержанием лецитина, таких как необработанное соевое масло». Реакцию проводят при температуре 20-80°C, с лимонной кислотой или ее солью в диапазоне pH 3-7. Утверждают, что фермент необходимо тщательно распределить в масле, где раствор фермент-вода присутствует в виде капель менее 10 мкм в диаметре. Форма измерения и вычисления средневзвешенного не описаны. Используют эмульгатор для растворения фосфолипаз, полученный из панкреатина или продуктов поджелудочной железы, содержащих жир. Aalrust утверждает, что поскольку масло, которое выделяют, содержит менее 5 ч./млн фосфора, его можно адаптировать для физического рафинирования до пищевого масла. Позднее подробности технологии, описанной Aalrust, были раскрыты в нескольких публикациях (Dahlke, K. and Eichelsbacher, M., Enzymax® and Alcon® - Lurgi's route to Physical Refining in Proceeding of the World Conference on Oilseed and Edible Oils Processing, Istanbul, Turkey, 1996, ed. Kaseoglu, Rhee and Wilson; Dalke, K. et al., First Experiences with Enzymatic Oil Refining, Inform, vol.6, No. 12, Dec. 1995). Данные, раскрытые в этих публикациях для промышленных испытаний, подкрепляют использование описанной в ссылках технологии для масел с содержанием P в диапазоне от 40 до 180 ч./млн и не выше. В них описано также, что «способ не требует какого-либо специального оборудования. Все насосы, мешалки, смесители и теплообменники, так же как центрифуга, имеют стандартный дизайн, и их можно закупить у различных поставщиков». Dahlke, K. and Eichelsbacher, M., Enzymax® and Alcon® - Lurgi's route to Physical Refining in Proceeding of the World Conference on Oilseed and Edible Oils Processing, Istanbul, Turkey, 1996, ed. Kaseoglu. Rhee and Wilson, page 56.

В US 5532163 от Yagi et al. описан ферментативный способ с использованием по меньшей мере 30 массовых частей воды и, предпочтительно, 50-200 массовых частей воды на 100 массовых частей масла или жира, для реакции фосфолипаз A1, A2 или B с маслом, содержащим 100-10000 ч./млн фосфора. Затем масло промывают с помощью 30-200% массовых частей воды или кислого водного раствора на 100 массовых частей масла или жира. Общая загрузка воды, необходимая для использования способа, лежит в диапазоне от 60% до 400% мас./мас. переработанного масла. Получение такого большого количества сточных вод на промышленном предприятии относит этот способ к неэкономичным.

В US 6001640 от Loeffler et al. описан способ, где одно или несколько растительных масел, содержащих фосфорсодержащие компоненты, подвергают воздействию смеси фосфолипаз, полученной из Aspergillus, где смесь содержит фермент, обладающий активностью A1, активностью A2, или обеими, и фермент, обладающий лизофосфолипазной активностью. В патенте указано, что поскольку фосфолипаза будет атаковать лецитин, непрактично использовать этот способ для масел с высоким содержанием лецитина, таких как неочищенное соевое масло.

Loeffler et al. описывают, что ферментативную реакцию следует проводить при pH менее 4 и с размером капель эмульсии менее 20 мкм. Форма измерения и вычисления средневзвешенного размера капель эмульсии не описаны. В патенте указано, что конечный продукт будет иметь остаточный P 15 ч./млн или менее. В данной области известно, что если подвергать масло воздействию pH величиной настолько низкой, как 4, или ниже, то смолы, присутствующие в масле, будут вынуждены становиться гидратированными и отделяться от реакционной среды. Гидратированные смолы будут действовать в качестве эмульгаторов, так что когда они будут отделяться, они будут уносить с собой масло, таким образом, приводя к потерям масла. Не представлено данных о потере масла в смолах.

В US 6103505 от Clausen et al. описаны открытие и активность конкретных фосфолипаз (A1, A2 или B) для использования в ферментативном удалении фосфолипидов, и способ получения ферментов. В способе ферментативного обессмоливания может быть использован способ, описанный в US 5264367, без каких-либо дополнительных стадий способа.

В US 6127137 от Hasida et al. описаны открытие и активность конкретных фосфолипаз, способных удалять обе жирные ацильные группы, присутствующие в молекуле фосфолипида, при смешивании с обессмоленным маслом (50-250 ч./млн фосфора) с 0,5-5% воды, pH 1,5-3, при температуре 30-45°C и времени 1-12 часов.

В US 6143545 от Clausen et al. описаны открытие и активность конкретных фосфолипаз (A1, A2 или B) для использования в ферментативном удалении фосфолипидов, и способ получения ферментов. В способе ферментативного обессмоливания может быть использован способ, описанный в US 5264367, без каких-либо дополнительных стадий способа.

В US 6548633 от Edwards et al. описаны последовательности кДНК, кодирующие секретируемые белки. В колонке 44 патента указано, что белок по данному изобретению можно использовать в ферментативном обессмоливании растительных масел, как описано в US 6001640, процитированном выше. Кроме того, в патенте указано, в том же самом абзаце, что белок по данному изобретению можно комбинировать в «коктейле» с другими ферментами для улучшения использования кормов для животных.

В патентной заявке США серийный № 10/556816 от Dayton et al. описан способ улучшенного ферментативного обессмоливания, где pH забуференной реакционной смеси для фермента понижают ниже 4,5 после завершения ферментативной реакции, таким образом, исключая засорение оборудования, в частности, теплообменников и разделяющей центрифуги, которое будет происходить в результате осаждения солей кальция и магния при оптимальном pH, необходимом для активности фермента.

В US 2004/0005399 A1 от Chakrabarti et al. описан ферментативный способ с использованием однократного добавления фермента и буферной системы и короткого времени удержания/реакции, с последующим обесцвечиванием с помощью 2-4% отбеливающей глины и 0-1% активированного угля, а затем депарафинизации для получения масла с содержанием фосфора 5 ч./млн. Как способом обесцвечивания, так и способом депарафинизации, из масла будет удаляться остаточный фосфор. Кроме того, Chakrabarti et al. утверждают, что потери масла в смолах находятся в диапазоне 30-40% от отделенных смол, что позволяет предположить, что ферментативная реакция не прошла до завершения, приводя к большим потерям масла из-за эмульгации масла в удаленных фосфолипидах.

В US 2005/0059130 A1 от Bojsen at al. описаны открытие и активность конкретных фосфолипаз для использования в ферментативном удалении фосфолипидов, и способ получения ферментов. Публикация относится к обработке растительного масла для уменьшения содержания фосфолипидов, как описано в US 5264367.

В US 2005/0108789A1 от Gramatikova et al., в настоящее время в патенте США № 7226771, предусматривают описание фосфолипаз (например, ферментов фосфолипазы A, B, C, D, пататина), которые эффективно расщепляют сложноэфирные связи глицерофосфата в маслах, таких как растительные масла, для получения поддающегося экстракции водой фосфорилированного основания и диглицерида. В абзаце 108 в заявке, кроме того, указано, что такие фосфолипазы можно использовать для ферментативного обессмоливания растительных масел, и что PLC по изобретению можно использовать в дополнение к PLA1 и PLA2, или вместо их, при промышленном обессмоливании масла, таком как способ ENZYMAX®, где фосфолипиды гидролизуют посредством PLA1 и PLA2. В абзаце 474 данной заявки указано, что PLC можно использовать отдельно или вместе с PLA для удаления негидратируемых фосфолипидов из масла, которое предварительно подвергали водному обессмоливанию, но не представлены условия реакции для использования двух ферментов вместе. Поскольку оптимальные условия реакции для фермента PLA и фермента PLC отличаются, это утверждение в заявке без работающих примеров не разъясняет специалисту в данной области, как использовать ферменты PLA и PLC одновременно. Кроме того, в заявке указано, что фосфолипазы C, D1 и D2 можно использовать в ферментативном обессмоливании предварительно обессмоленных и необессмоленных (неочищенных) масел и в качестве вспомогательного средства для щелочного рафинирования.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение относится к способу обессмоливания масляной композиции, включающему

(a) предоставление масляной композиции, содержащей некоторое количество фосфолипидов,

(b) приведение в контакт указанной масляной композиции одновременно с одним или несколькими ферментами фосфолипазами A и одним или несколькими ферментами фосфолипазами C, в условиях, подходящих для ферментов, чтобы взаимодействовать с фосфолипидами с образованием продуктов реакции с фосфолипидами, и

(c) отделение продуктов реакции с фосфолипидами от масляной композиции, где оставшаяся масляная композиция после отделения является обессмоленной масляной композицией,

причем во время стадии (b) реакция с указанным одним или несколькими ферментами фосфолипазами A протекает с более высокой скоростью, чем она протекала бы в отсутствие указанного одного или нескольких ферментов фосфолипаз C. В предпочтительном варианте осуществления реакция на стадии (b) продолжается до длительности менее приблизительно одного часа.

Количество воды, необходимое для способа по настоящему изобретению, может составлять менее приблизительно 5%, и преимущественно его можно уменьшить до менее приблизительно 3% и, предпочтительно, до приблизительно 1,5-2,0%.

Величину pH системы можно регулировать либо до, либо после добавления одного или всех ферментов к масляной композиции. Выход масла максимизируют на основании композиции фосфолипидов, содержащейся в неочищенном сырье.

В частности, настоящее изобретение относится к способу, в котором как фермент фосфолипазу C (PLC), так и фермент фосфолипазу A (PLA) используют вместе в ферментативной реакции для удаления фосфолипидов, присутствующих в масле. Более конкретно, настоящее изобретение относится к добавлению фосфолипазы C (PLC) и/или фосфатидил-инозит-специфичной фосфолипазы C (PI-PLC) в комбинации с фосфолипазой A1 (PLA1) и/или фосфолипазой A2 (PLA2) для максимизации выхода масла и уменьшения количества полученных отходов производства. Неожиданно было обнаружено, что кинетика ферментативных реакций проходит намного быстрее, чем ожидали, когда два фермента используют вместе, чем когда каждый используют отдельно. Кроме того, было обнаружено, что реакции проходят быстрее, чем ожидали, даже когда условия реакции не являются оптимизированными по меньшей мере для одного из ферментов. Кроме того, было обнаружено, что реакция может проходить менее чем приблизительно за один час, и может проходить так быстро, как приблизительно за тридцать минут.

Преимущественно, обрабатываемое масло может представлять собой неочищенное масло или обессмоленное водой масло. Ферменты можно добавлять к маслу либо по отдельности, либо вместе, однако два фермента будут в одновременном контакте с маслом. В соответствии с настоящим изобретением параметры ферментативной реакции, такие как концентрация воды, температура, pH, время перемешивания и концентрация фермента, можно регулировать, оптимизируя реакцию для конкретной комбинации ферментов в системе конкретного масла.

Описание фигур

На фиг.1 проиллюстрированы химические структуры общих фосфолипидов и общих триацилглицеринов.

На фиг.2 проиллюстрированы функциональные группы и структуры общеизвестных фосфолипидов.

На фиг.3 проиллюстрированы положения в молекуле фосфолипида, с которыми вступают в реакцию различные типы фосфолипаз.

На фиг.4 проиллюстрирована реакция фосфолипида с ферментом PLA 1 и конечные продукты.

На фиг.5 проиллюстрирована реакция фосфолипида с ферментом PLC и конечные продукты.

Фиг.6 представляет собой график, обобщающий результаты примеров 13-30, в которых средний остаточный фосфор в обессмоленном образце нанесен на график для каждого уровня каждого оцениваемого экспериментального фактора.

Фиг.7 представляет собой график, обобщающий результаты примеров 31-38, в котором средний остаточный фосфор в обессмоленном образце нанесен на график для каждого уровня каждого оцениваемого экспериментального фактора.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к улучшению способа ферментативного обессмоливания масляной композиции. Авторами изобретения обнаружено, что, неожиданно, используя комбинацию ферментов, можно улучшить кинетику реакции расщепления фосфолипида. В частности, способом ферментативного обессмоливания, проведенным с комбинацией фермента фосфолипазы C с ферментом фосфолипазой A, получают обессмоленный масляный продукт с более низким содержанием фосфора за более короткое время реакции, чем можно достичь с одной фосфолипазой A. Кроме того, было неожиданно обнаружено, что реакция может проходить менее чем приблизительно за один час и может проходить так быстро, как приблизительно за тридцать минут. Это является особенно неожиданным, поскольку для PLA при использовании отдельно, как правило, необходимо время реакции по меньшей мере приблизительно 4 часа, в то время как для PLC при использовании отдельно, как правило, необходимо время реакции приблизительно один час. Более того, PLA обладает оптимальным для реакции pH 4,5, в то время как PLC обладает оптимальным для реакции pH 7,0. Каждый фермент обладает также различной термоустойчивостью. Фермент PLA будет денатурировать приблизительно при 50°C, в то время как фермент PLC будет денатурировать приблизительно при 65°C. Кроме того, в данной области известно, что термостабильность ферментов можно улучшить посредством сайтспецифичных мутаций. Такие клонированные ферменты могут быть термостабильными при температурах до 80°C, и применение таких клонированных ферментов предусмотрено в настоящем изобретении.

Уменьшение времени реакции подтверждено посредством PLA. При использовании в сочетании с PLC время реакции значительно уменьшается, и в некоторых вариантах осуществления изобретения может составлять менее приблизительно 1 часа, даже в кислых условиях реакции, которые не являются оптимальными для PLC. Кроме того, авторами изобретения обнаружено, что в надлежащих условиях возможно уменьшить время реакции до настолько низкого, как приблизительно 30 минут.

Было обнаружено, что концентрацию воды можно регулировать для соответствия нуждам конкретной производственной среды. Таким образом, концентрацию воды можно уменьшать до приблизительно 1-2% и, в частности, до приблизительно 1,5%, если желательно уменьшить количество сточных вод, полученных в результате способа. Альтернативно, концентрацию воды можно увеличить до приблизительно 4-5% и, в частности, до приблизительно 4,5%, если желательно увеличить эффективность способа обессмоливания.

Преимуществом настоящего изобретения является то, что масло, подлежащее обессмоливанию, может представлять собой либо неочищенное масло, либо предварительно обессмоленное одним из способов предшествующего уровня техники. Отдельным преимуществом для предприятия по переработке масла является возможность осуществлять обессмоливание масла в одну стадию. Масла, которые можно обрабатывать в соответствии с настоящим изобретением, могут включать, без ограничения, следующие: масло канолы, касторовое масло, кокосовое масло, кориандровое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, масло лесного ореха, конопляное масло, льняное масло, масло из косточек плодов манго, масло пенника лугового, копытное масло, оливковое масло, пальмовое масло, пальмоядровое масло, пальмовый олеин, арахисовое масло, рапсовое масло, масло из рисовых отрубей, сафлоровое масло, масло камелии масличной, соевое масло, подсолнечное масло, талловое масло, масло камелии японской и растительное масло.

Фермент фосфолипаза A, применяемый в способе по настоящему изобретению, может представлять собой либо фермент фосфолипазу A1, либо фермент фосфолипазу A2. Фермент фосфолипаза C, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой либо фосфолипазу C, либо инозит-специфичную фосфолипазу C. Множество вариантов ферментов из семейств фосфолипазы A и фосфолипазы C являются коммерчески доступными; и предусматривают, что такие ферменты и их эквиваленты будут подходящими для применения по настоящему изобретению.

В способе по изобретению различные фосфолипазы, используемые вместе в способе ферментативного обессмоливания по настоящему изобретению, можно смешивать вместе перед добавлением к маслу, подлежащему обработке. Альтернативно, их можно добавлять к маслу по отдельности, либо последовательно, либо одновременно. При последовательном или совместном добавлении ферментативная реакция будет проходить в некоторый момент, когда оба фермента присутствуют в реакционной смеси.

Способ обессмоливания по настоящему изобретению осуществляют при величине pH ниже приблизительно 8, предпочтительно приблизительно 3-7 и наиболее предпочтительно приблизительно 4-5. Величины pH в способе ферментативного обессмоливания можно достигать добавлением известных буферов. Хорошо известно, что лимонная кислота и гидроксид натрия подходят для этой цели. Другие забуферивающие средства можно использовать по необходимости для регулирования pH в конкретных условиях реакции.

Температура в способе ферментативного обессмоливания по настоящему изобретению может находиться в диапазоне приблизительно 40-80°C, предпочтительно в диапазоне приблизительно 40-60°C и более предпочтительно в диапазоне приблизительно 45-55°C. Неожиданно было обнаружено, что в способах по настоящему изобретению обессмоливание PLA может проходить при температуре выше ее собственного оптимума 45°C и ближе к оптимуму рабочей температуры PLC, без избыточной денатурации.

Способ по настоящему изобретению предусматривает одностадийный способ обессмоливания, в котором содержание фосфолипидов в масле, даже в неочищенном масле, можно уменьшить до менее 50 ч./млн P, предпочтительно, менее 20 ч./млн P, более предпочтительно, менее 10 ч./млн P и, наиболее предпочтительно, менее 5 ч./млн P.

После завершения ферментативного обессмоливания и отделения обессмоленного масла от смол, обессмоленное масло можно подвергать дополнительным стадиям переработки, известным в данной области, таким как обесцвечивание или дезодорирование, что может быть необходимым или желательным в зависимости от конечного применения, для которого предназначен обессмоленный масляный продукт.

Различные предпочтительные варианты осуществления изобретения указаны в примерах ниже, вместе с контрольными примерами с использованием условий предшествующего уровня техники. В каждом из примеров ниже верхнеприводная мешалка представляла собой мешалку Heidolph модели Elector KG с плоскими лопастями, работающую при 90 об/мин для нормального перемешивания и 350 об/мин для интенсивного перемешивания. Центрифуга представляла собой De Laval Gyro - Tester, со встроенной «роторной единицей» для непрерывного разделения. Ротор центрифуги закрывался встроенными запорными винтами. Смешивание со сдвигом осуществляли с использованием гомогенизатора Ultra-Turrax SD-45 с ротором-статором G450 при 10000 об/мин. Фермент PLA1 представлял собой Lecitase® Ultra (номер партии LYN050070), продаваемый Novozymes A/S из Дании, и имел концентрацию 11,2 ед./мг. Фермент PLA2 представлял собой Rohalase® MPL (номер партии Ch: 4738), продаваемый AB Enzymes, находящимся в Германии, и имел концентрацию 2000 ед./мг. Фермент PLC представлял собой Purifine , продаваемый Diversa Corporation из San Diego, California. Для примеров 1-12 PLC представлял собой партию BD16449, имеющую концентрацию 205 ед./мг. Для примеров 13-38 PLC представлял собой партию 90BU002A1, имеющую концентрацию 27,5 ед./мг. Количество фосфолипидов, остающихся в обработанном масле, определяли как ч./млн P согласно способу American Oil Chemists' Society Official Method Ca 20-99, «Analysis of Phosphorus in Oil by Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy».

Пример 1

Контроль: водное обессмоливание - 1965,4 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 746 ч./млн фосфора, нагревали до 70-75°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. К теплому маслу добавляли 39,4 грамма деионизированной воды при интенсивном перемешивании в течение 1 минуты. Вращение мешалки замедляли до нормальной скорости (90 об/мин), чтобы дать возможность смолам флокулировать в течение 30 минут. Затем масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в обессмоленном водой масле составлял 80,7 ч./млн.

Пример 2

Контроль: Обессмоливание одним ферментом с фосфолипазой A1 (PLA1) - 1997,9 г неочищенного соевого масла, содержащего 746 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение одного часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 40-45°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 40-45°C, сначала добавляли 60,0 граммов деионизированной воды и смесь перемешивали со сдвигом 1 минуту, затем добавляли 0,1044 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra PLA1 и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости с помощью верхнеприводной мешалки в течение 4 часов при температуре в диапазоне 41-48°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в обессмоленном PLA1 масле составлял 31,7 ч./млн.

Пример 3

Контроль: Обессмоливание одним ферментом с фосфолипазой C (PLC) - 2011,1 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 746 ч./млн фосфора, нагревали до 55-60°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 60,3 грамма деионизированной воды и смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Добавляли 0,1051 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза BD 16449, содержащая 205 ед./мг) и смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масляную смесь подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа при 50-63°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в обессмоленном PLC масле составлял 70,9 ч./млн.

Пример 4

Контроль: Обессмоливание PLC, затем PLA - В данном контрольном примере образец масла подвергали взаимодействию с каждым ферментом отдельно в условиях реакции, оптимальных для данного фермента, согласно предшествующему уровню техники, 2110,5 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 560,1 ч./млн фосфора, нагревали до 60°C при нормальном перемешивании. Добавляли 63 грамма деионизированной воды и 0,1123 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза BD16449, содержащая 205 ед./мг) и смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 1 часа при 55-56°C. Затем масло центрифугировали и собирали масло и влажные смолы. Для получения буфера с pH 4,5 сначала 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты добавляли к PLC-обессмоленному маслу, смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты, а затем перемешивали в течение одного часа при нормальной скорости с помощью верхнеприводной мешалки; затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и масляную смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Добавляли 59 граммов деионизированной воды и смесь перемешивали со сдвигом 1 минуту. С полученным буфером добавляли 0,1061 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra PLA1 и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло перемешивали при нормальной скорости в течение 4 часов при температуре приблизительно 45°C. Затем масло центрифугировали; собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в масле, последовательно обессмоленном PLC, затем PLA1, составлял 3,2 ч./млн.

Пример 5

PLC и PLA1 вместе, нейтральный pH со временем реакции 1 час при 45°C - 2004,9 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 560,1 ч./млн фосфора, нагревали до 45°C при нормальном перемешивании. При нейтральном pH масла к маслу добавляли 60 граммов деионизированной воды, 0,1037 грамма Diversa's Purifine (фермент PLC) и 0,1076 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (фермент PLA1) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Смесь масла и фермента перемешивали при нормальной скорости в течение 1 часа при температуре приблизительно 45°C. Затем масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Из масла, обработанного комбинированной смесью ферментов PLC и PLA1, при нейтральном pH и 45°C, со временем реакции один час, получали обессмоленное масло, содержащее 13,2 ч./млн остаточного фосфора.

Уровень остаточного фосфора значительно ниже, чем уровень, достигаемый либо с одним PLA при оптимальных для него условиях (пример 2), либо с одним PLC при оптимальных для него условиях (пример 3).

Пример 6

PLC и PLA1 вместе, нейтральный pH со временем реакции 4 часа при 45°C - 2003,7 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 560,1 ч./млн фосфора, нагревали до 45°C при нормальном перемешивании. Добавляли 60 граммов деионизированной воды, 0,1040 грамма Diversa's Purfine (фермент PLC) и 0,1085 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (фермент PLA1) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 4 часов при температуре приблизительно 45°C. Затем масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Способом с использованием комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1, со временем реакции четыре часа при нейтральном pH получали обессмоленное масло, содержащее 10,5 ч./млн остаточного фосфора.

Уровень остаточного фосфора только немного улучшен по сравнению с уровнем, достигнутым в примере 5, указывая на то, что увеличение времени реакции от одного часа до четырех часов не приводит к существенному различию в эффективности способа обессмоливания.

Пример 7

PLC и PLA1 вместе, pH 4,5 со временем реакции 1 час при 45°C - 2021,4 г неочищенного соевого масла, содержащего 547,9 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение одного часа. Маслу давали охлаждаться до тех пор, пока температура не достигала 40-45°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Добавляли 61,0 грамм деионизированной воды, 0,1184 грамма Diversa's Purfine (фермент PLC) и 0,1038 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (фермент PLA1) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 1 часа при температуре приблизительно 45°C. Затем масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Способом с использованием комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1, со временем реакции один час, при pH 4,5 и температуре 45°C получали обессмоленное масло, содержащее 2,4 ч./млн остаточного фосфора.

Данный уровень остаточного фосфора является приблизительно таким же, и даже немного лучшим, чем уровень, достигнутый в примере 4, где реакцию с каждым ферментом проводили отдельно и в его собственных оптимальных условиях. Неожиданно, эффективность обессмоливания является точно такой же хорошей, когда два фермента действуют вместе при времени реакции, которое не является оптимальным для PLA, и при значениях pH и температуры, не являющихся оптимальными для PLC, как и когда два фермента действуют по отдельности, каждый в его собственных оптимальных условиях.

Пример 8

PLC и PLA1 вместе, pH 4,5 со временем реакции 4 часа при 45°C - 2069,3 г неочищенного соевого масла, содержащего 547,9 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты, а затем перемешивали при нормальной скорости в течение одного часа. Смеси давали охладиться до 40-45°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Добавляли 63 грамма деионизированной воды, 0,1112 грамма Diversa's Purfine (фермент PLC) и 0,1258 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (фермент PLA1) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 4 часов при температуре приблизительно 45°C. Затем масляную смесь центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Способом с использованием комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1, со временем реакции четыре часа при pH 4,5 получали обессмоленное масло, содержащее 2,5 ч./млн остаточного фосфора.

Данный уровень остаточного фосфора является приблизительно таким же, как достигнутый в примере 7, указывая на то, что увеличение времени реакции от одного часа до четырех часов не приводило к существенному различию в эффективности способа обессмоливания.

Пример 9

PLC и PLA1 вместе, pH 4,5 со временем реакции 1 час при 55°C - 1985,2 г неочищенного соевого масла, содержащего 547,9 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты, затем перемешивали при нормальной скорости в течение одного часа. Смеси давали охладиться до 40-45°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Добавляли 63,0 грамма деионизированной воды, 0,1085 грамма Diversa's Purfine (фермент PLC) и 0,1045 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (фермент PLA1) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 1 часа при температуре 55°C. Затем масло центрифугировали; собирали разделенные масло и влажные смолы. Способом с использованием комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1, со временем реакции один час, при pH 4,5 и температуре реакции 55°C получали обессмоленное масло, содержащее 2,3 ч./млн остаточного фосфора.

Данный уровень остаточного фосфора является приблизительно таким же, как уровень, достигнутый в примерах 7 и 8, указывая на то, что увеличение температуры реакции от приблизительно 45°C до приблизительно 55°C не приводит к существенному различию в эффективности способа обессмоливания, даже несмотря на то, что в норме можно ожидать, что PLA1 будет денатурировать при температуре выше 50°C.

Пример 10

PLC вместе с 2-кратной концентрацией PLA1, pH 4,5 со временем реакции 1 час при 45°C - 1992,2 г неочищенного соевого масла, содержащего 547,9 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при перемешивании с нормальной скоростью. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты, затем перемешивали в течение одного часа. Смеси давали охладиться до 40-45°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. В смесь добавляли 60 граммов деионизированной воды, 0,1319 грамма Diversa's Purfine (фермент PLC) и 0,2139 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (фермент PLA1) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 1 часа при температуре порядка 45°C. Затем масляную смесь центрифугировали; собирали разделенные масло и влажные смолы. Способом с использованием комбинированной смеси ферментов PLC и двойной концентрации PLA1, со временем реакции один час при pH 4,5 получали обессмоленное масло, содержащее 7,0 ч./млн остаточного фосфора.

Данный уровень остаточного фосфора является приемлемым для определенных областей применения, но не настолько хорошим, как уровень, достигнутый в примерах 7-9, указывая на то, что, неожиданно, увеличение дозы PLA1 не приводит к улучшенной эффективности способа обессмоливания, даже в условиях реакции, оптимальных для PLA1.

Пример 11

PLC и PLA2 вместе, pH 4,5 со временем удержания 1 час при 45°C - 1998,4 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 341,2 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 40°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 40-45°C, добавляли 0,1112 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза BD16449, содержащая 205 ед./мг) и 0,2094 грамма Rohalase® MPL (номер партии Ch: 4738), продаваемой AB Enzymes, затем 60 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 60 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 60 минут при температуре 40-45°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA2 при нейтральном pH приводил к обессмоленному маслу, содержащему 3,3 ч./млн остаточного фосфора.

Данный пример аналогичен примеру 7 выше, за исключением замены PLA1 на PLA2. Низкий уровень остаточного фосфора в конечном продукте показывает, что PLA2 может функционировать приблизительно так же хорошо, как PLA1, в способе по настоящему изобретению.

Пример 12

PLC и PLA2 вместе, pH 4,5 со временем удержания 4 часа при 45°C - 1998,4 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 341,2 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 40°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 40-45°C, добавляли 0,1038 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза BD16449, содержащая 205 ед./мг) и 0,2047 грамма Rohalase® MPL (номер партии Ch: 4738), продаваемой AB Enzymes, затем 60 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 60 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 4 часов при температуре 40-45°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA2 при нейтральном pH приводил к обессмоленному маслу, содержащему 5,8 ч./млн остаточного фосфора.

Данный пример иллюстрирует, что увеличение времени реакции от одного до четырех часов не приводит к лучшему обессмоливанию, а фактически приводит к более высокому уровню остаточного фосфора.

Результаты вышеизложенных примеров 1-12 суммированы в таблице 2 ниже.

Таблица 2
Пр.	Добавление фермента	PLC (ч./млн активного фермента)	PLA1 (ч./млн активного фермента)	PLA2 (ч./млн активного фермента)	Время реакции (мин)	Темп. (°С)	рН	Вода (%)	Фосфор (ч./млн)
1	Нет				30	70-75	7	2,0	80,7
2	Отдельно		0,6		240	41-48	4,5	3,0	31,7
3	Отдельно	10,8			60	50-63	7	3,0	70,9
4	Последовательно	11,5	0,6		60, 240	55,45	4,5	3,1	3,2
5	Одновременно	10,6	0,6		60	45	7	3,0	13,2
6	Одновременно	10,7	0,6		240	45	7	3,0	10,5
7	Одновременно	12,1	0,6		60	45	4,5	3,0	2,4
8	Одновременно	11,4	0,7		240	45	4,5	3,1	2,5
9	Одновременно	11,1	0,6		60	55	4,5	3,1	2,3
10	Одновременно	13,5	1,2		60	45	4,5	3,0	7,0
11	Одновременно	11,4		209	60	45	4,5	3,0	3,3
12	Одновременно	10,6		205	240	45	4,5	3,0	5,8

Примеры 13-30

Дизайн экспериментов (DOE) разрабатывали для определения эффектов контрольных переменных конкретного способа на способ ферментативного обессмоливания, как указано в таблице 3 ниже.

Таблица 3
Переменная		Уровни
Добавление фермента		Последовательно	Одновременно
Количество PLC (ч./млн активного)		10	20	30
Количество PLA (ч./млн активного)		0,5	1,0	2,0
Время перемешивания (с)		45	60	120
рН		4,5	5,0	7,0
Вода (%)		1,5	3,0	4,5
Температура (°С)		40	50	60
Время реакции (мин)		30	60	120

Последовательно - каждый фермент добавляли отдельно, хотя оба фермента были в контакте с масляной смесью в течение по меньшей мере части времени реакции.

Одновременно - оба фермента добавляли в одно и то же время.

pH - pH, при котором масло подвергают воздействию ферментов.

Температура - температура, при которой масло подвергают воздействию ферментов.

Время перемешивания - время, в течение которого смесь перемешивают при высокой скорости после добавления каждого фермента.

Время реакции - общее время, в течение которого по меньшей мере один фермент находится в контакте с маслом.

Данные рабочие переменные оценивали в восемнадцати отдельных испытаниях, представленных здесь как примеры 13-30. Значения каждой переменной, тестированной в каждом примере 13-30, указаны в таблице 4 ниже.

Таблица 4
Пр.	Добавление фермента	PLC (ч./млн активного фермента)	PLA1 (ч./млн активного фермента)	Время реакции (мин)	Темп. (°С)	рН	Вода (%)	Время перемешивания (с)
13	Последовательно	20	1	120	40	5	1,5	120
14	Одновременно	20	1	60	60	7	1,5	45
15	Последовательно	10	1	30	40	7	4,5	60
16	Последовательно	10	2	60	50	4,5	1,5	120
17	Последовательно	20	2	30	50	7	3,0	45
18	Последовательно	10	0,5	120	60	5	3,0	45
19	Одновременно	30	2	30	60	5	1,5	60
20	Одновременно	10	2	120	60	7	4,5	120
21	Одновременно	20	2	120	40	4,5	3,0	60
22	Последовательно	30	2	60	40	5	4,5	45
23	Последовательно	30	1	30	60	4,5	3,0	120
24	Одновременно	30	1	120	50	4,5	4,5	45
25	Одновременно	10	1	60	50	5	3,0	60
26	Последовательно	20	0,5	60	60	4,5	4,5	60
27	Последовательно	30	0,5	120	50	7	1,5	60
28	Одновременно	30	0,5	60	40	7	3,0	120
29	Одновременно	20	0,5	30	50	5	4,5	120
30	Одновременно	10	0,5	30	40	4,5	1,5	45

Пример 13

1999,1 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 769,5 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 40°C, затем добавляли 2,4 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 5,0. Поддерживая температуру 40°C, добавляли 1,5008 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1), затем 30 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 120 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 60 минут. Поддерживая температуру 40°C, добавляли 0,2132 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 120 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 60 минут при температуре 40°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в масле, последовательно обессмоленном PLC, затем PLA1 составлял 6,5 ч./млн.

Пример 14

2010,5 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 785,1 ч./млн фосфора, охлаждали до 60°C с использованием нормального перемешивания и верхнеприводной мешалки. Поддерживая температуру 60°C, добавляли 1,5316 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и 0,2073 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 30 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 45 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 60 минут при температуре 60°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при нейтральном pH приводил к обессмоленному маслу, содержащему 109,6 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 15

1994,5 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 785,1 ч./млн фосфора, охлаждали до 40°C с использованием нормального перемешивания и верхнеприводной мешалки. Поддерживая температуру 40°C, добавляли 0,754 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1), затем 90 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 60 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 15 минут. Поддерживая температуру 40°C, добавляли 0,2242 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 60 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 15 минут при температуре 40°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в масле, последовательно обессмоленном PLC, затем PLA1, составлял 27,4 ч./млн.

Пример 16

2002,0 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 785,1 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 50°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 50°C, добавляли 0,7498 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1), затем 30 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 120 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 30 минут. Поддерживая температуру 50°C, добавляли 0,4064 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 120 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 30 минут при температуре 50°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в масле, последовательно обессмоленном PLC, затем PLA1, составлял 7,6 ч./млн.

Пример 17

2010,7 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 785,1 ч./млн фосфора, нагревали до 50°C с использованием нормального перемешивания и верхнеприводной мешалки. Поддерживая температуру 50°C, добавляли 1,4981 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1), затем 60 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 45 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 15 минут. Поддерживая температуру 50°C, добавляли 0,4143 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 45 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 15 минут при температуре 50°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в масле, последовательно обессмоленном PLC, затем PLA1, составлял 79,3 ч./млн.

Пример 18

2005,3 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 742,9 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 60°C, затем добавляли 2,4 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 5,0. Поддерживая температуру 60°C, добавляли 0,7491 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1), затем 60 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 45 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 60 минут. Поддерживая температуру 60°C, добавляли 0,1220 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 45 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 60 минут при температуре 60°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в масле, последовательно обессмоленном PLC, затем PLA1, составлял 2,2 ч./млн.

Пример 19

2000,4 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 742,9 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 60°C, затем добавляли 2,4 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 5,0. Поддерживая температуру 60°C, добавляли 2,2270 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и 0,3937 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 30 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 60 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 30 минут при температуре 60°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при pH 5,0 приводил к обессмоленному маслу, содержащему 7,8 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 20

2006,3 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 719,3 ч./млн фосфора, нагревали до 60°C с использованием нормального перемешивания и верхнеприводной мешалки. Поддерживая температуру 60°C, добавляли 0,7561 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и 0,4098 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 90 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 120 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 120 минут при температуре 60°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при нейтральном pH приводил к обессмоленному маслу, содержащему 64,1 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 21

1998,5 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 719,3 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 40°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 40°C, добавляли 1,4798 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и добавляли 0,4018 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 60 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 60 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 120 минут при температуре 40°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при pH 4,5 приводил к обессмоленному маслу, содержащему 5,5 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 22

2001,3 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 719,3 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 40°C, затем добавляли 2,4 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 5,0. Поддерживая температуру 40°C, добавляли 2,2580 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1), затем 90 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 45 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 30 минут. Поддерживая температуру 40°C, добавляли 0,4126 грамма Novozymes' Lecitase© Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 45 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 30 минут при температуре 40°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в обессмоленном масле, последовательно обработанном PLC и PLA1, составлял 2,1 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 23

2002,0 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 747,3 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 60°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 60°C, добавляли 2,2194 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1), затем 60 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 120 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 15 минут. Поддерживая температуру 60°C, добавляли 0,2198 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 120 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 15 минут при температуре 60°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в обессмоленном масле, последовательно обработанном PLC и PLA1, составлял 4,6 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 24

2000,8 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 747,3 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 50°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 50°C, добавляли 2,2500 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и добавляли 0,2216 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 90 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 45 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 120 минут при температуре 50°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 приводил к обессмоленному маслу, содержащему 1,8 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 25

1998,9 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 747,3 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 50°C, затем добавляли 2,4 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 5,0. Поддерживая температуру 50°C, добавляли 0,7445 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и добавляли 0,2042 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 60 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 60 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 60 минут при температуре 50°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 приводил к обессмоленному маслу, содержащему 7,2 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 26

1997,3 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 810,8 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 60°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 60°C, добавляли 1,5189 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1), затем 90 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 60 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 30 минут. Поддерживая температуру 60°C, добавляли 0,1119 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 60 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 30 минут при температуре 60°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в обессмоленном масле, последовательно обработанном PLC и PLA1, составлял 2,2 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 27

2010,0 граммов неочищенного соевого масла, содержащего 810,8 ч./млн фосфора, охлаждали до 50°C с использованием нормального перемешивания и верхнеприводной мешалки. Поддерживая температуру 50°C, добавляли 2,2608 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1), затем 30 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 60 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 60 минут. Поддерживая температуру 50°C, добавляли 0,1172 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007) и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 60 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 60 минут при температуре 50°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в обессмоленном масле, последовательно обработанном PLC и PLA1 при нейтральном pH, составлял 72,6 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 28

2005,1 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 810,8 ч./млн фосфора, нагревали до 40°C при использовании нормального перемешивания и верхнеприводной мешалки. Поддерживая температуру 40°C, добавляли 2,2622 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и 0,1031 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 60 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 120 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 60 минут при температуре 40°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при нейтральном pH приводил к обессмоленному маслу, содержащему 61,5 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 29

2006,3 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 795,3 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 50°C, затем добавляли 2,4 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 5,0. Поддерживая температуру 50°C, добавляли 1,5373 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и 0,1168 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 90 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 120 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 30 минут при температуре 50°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при pH 5,0 приводил к обессмоленному маслу, содержащему 1,9 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 30

2006,1 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 795,3 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 40°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 40°C, добавляли 0,7736 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и 0,1072 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 30 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 45 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 30 минут при температуре 40°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при pH 4,5 приводил к обессмоленному маслу, содержащему 13,7 ч./млн остаточного фосфора.

Результаты примеров 13-30 по отношению к достигнутому уровню фосфора приведены в таблице 5 ниже.

Таблица 5
Пр.	Добавление фермента	PLC (ч./млн активного фермента)	PLA1 (ч./млн активного фермента)	Время реакции (мин)	Темп. (°С)	рН	Вода (%)	Время перемешивания (с)	Фосфор (ч./млн)
13	Последовательно	20,6	1,2	120	40	5	1,5	120	6,5
14	Одновременно	21,1	1,2	60	60	7	1,5	45	109,6
15	Последовательно	10,4	1,3	30	40	7	4,5	60	27,4
16	Последовательно	10,3	2,3	60	50	4,5	1,5	120	7,6
17	Последовательно	20,6	2,3	30	50	7	3,0	45	79,3
18	Последовательно	10,3	0,7	120	60	5	3,0	45	2,2
19	Одновременно	30,6	2,2	30	60	5	1,5	60	7,8
20	Одновременно	10,4	2,3	120	60	7	4,5	120	64,1
21	Одновременно	20,3	2,3	120	40	4,5	3,0	60	5,5
22	Последовательно	31,0	2,3	60	40	5	4,5	45	2,1
23	Последовательно	30,5	1,2	30	60	4,5	3,0	120	4,6
24	Одновременно	30,9	1,2	120	50	4,5	4,5	45	1,8
25	Одновременно	10,2	1,4	60	50	5	3,0	60	7,2
26	Последовательно	20,9	0,6	60	60	4,5	4,5	60	2,2
27	Последовательно	31,1	0,7	120	50	7	1,5	60	72,6
28	Одновременно	31,1	0,6	60	40	7	3,0	120	61,5
29	Одновременно	21,1	0,7	30	50	5	4,5	120	1,9
30	Одновременно	10,6	0,6	30	40	4,5	1,5	45	13,7

Обобщение вышеописанных экспериментальных прогонов проиллюстрировано на графике, показанном на фиг.6, который представляет собой график среднего количества конечного фосфора при каждом уровне каждого фактора.

При нейтральном pH, оптимальном для фермента PLC, с комбинацией из двух ферментов не удалось получить масло с приемлемыми уровнями фосфора, позволяющими физическое рафинирование масла. Однако при кислом pH, оптимальном для фермента PLA, с комбинацией ферментов, добавляемых последовательно или вместе, получали приемлемые уровни остаточного фосфора в маслах, которые будут позволять их физическое рафинирование. При использовании кислого pH только в одном из экспериментальных прогонов не удалось получить масло с содержанием остаточного фосфора менее 10 ч./млн. В примере 30 получили уровень остаточного фосфора более 10 (13,7 ч./млн), и его получили с самыми низкими уровнями обоих ферментов, самой низкой температурой, самым низким процентом воды, самым коротким временем смешивания и перемешивания, и наиболее кислым pH.

Обнаружили синергический эффект между комбинацией ферментов, позволяющий реакции проходить до завершения менее 30 минут, по сравнению с 1 часом для ферментов PLC или 4 часами для ферментов PLA. Проводили дополнительное тестирование, чтобы проверить эффект очень короткого времени реакции; результаты приведены в таблице 6 ниже. В этих дополнительных тестах pH поддерживали при 4,5, с учетом указанного выше обнаружения того, что при более низком pH получают значительно более благоприятные результаты, чем при нейтральном pH. Количество PLA1 также поддерживали постоянным при 0,5 ч./млн, поскольку ранее определили, что увеличение количества PLA1 выше этого уровня не приводит к более эффективному обессмоливанию. Кроме того, в каждом из этих примеров ферменты добавляли одновременно, а не последовательно, принимая во внимание указанное выше определение того, что при одновременном добавлении ферментов получают лучшие результаты обессмоливания, чем при последовательном добавлении. Кроме того, в промышленном способе выгодно ограничивать общее время способа, общее оборудование и специализированные устройства.

Таблица 6
Пример	Добавление фермента	PLC (ч./млн активного фермента)	PLA1 (ч./млн активного фермента)	Время реакции (мин)	Темп. (°С)	рН	Вода (%)	Время перемешивания (с)
31	Одновременно	20	0,5	120	40	4,5	2,0	120
32	Одновременно	10	0,5	120	60	4,5	4,5	45
33	Одновременно	10	0,5	30	40	4,5	4,5	120
34	Одновременно	20	0,5	30	60	4,5	2,0	45
35	Одновременно	20	0,5	120	40	4,5	4,5	45
36	Одновременно	20	0,5	30	60	4,5	4,5	120
37	Одновременно	10	0,5	30	40	4,5	2,0	45
38	Одновременно	10	0,5	120	60	4,5	2,0	120

Пример 31

2003,6 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 784,8 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 40°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 40°C, добавляли 1,4603 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и 0,1021 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 40 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 120 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 120 минут при температуре 40°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при pH 4,5 приводил к обессмоленному маслу, содержащему 10,7 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 32

2004,8 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 784,8 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 60°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 60°C, добавляли 0,7509 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и 0,1105 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 90 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 45 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 120 минут при температуре 60°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при pH 4,5 приводил к обессмоленному маслу, содержащему 6,7 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 33

2000,4 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 697,7 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 40°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 40°C, добавляли 0,7530 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и 0,1022 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 90 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 120 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 30 минут при температуре 40°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при pH 4,5 приводил к обессмоленному маслу, содержащему 2,2 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 34

1999,4 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 714,2 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 60°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 60°C, добавляли 1,508 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и 0,1139 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 40 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 45 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 30 минут при температуре 60°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при pH 4,5 приводил к обессмоленному маслу, содержащему 16,5 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 35

1999 граммов неочищенного соевого масла, содержащего 714,2 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 40°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 40°C, добавляли 1,5010 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и 0,1060 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 90 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 45 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 120 минут при температуре 40°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при pH 4,5 приводил к обессмоленному маслу, содержащему 1,9 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 36

1999 граммов неочищенного соевого масла, содержащего 695,1 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 60°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 60°C, добавляли 1,5296 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и 0,1241 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 90 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 120 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 30 минут при температуре 60°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при pH 4,5 приводил к обессмоленному маслу, содержащему 5,2 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 37

2005,2 грамма неочищенного соевого масла, содержащего 695,1 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 40°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 40°C, добавляли 0,7422 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и 0,1195 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN05007), затем 40 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 45 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 30 минут при температуре 40°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при pH 4,5 приводил к обессмоленному маслу, содержащему 6,7 ч./млн остаточного фосфора.

Пример 38

1998 граммов неочищенного соевого масла, содержащего 695,1 ч./млн фосфора, нагревали до 75-80°C при нормальном перемешивании с использованием верхнеприводной мешалки. Добавляли 2,0 грамма 50% мас./мас. раствора лимонной кислоты и перемешивали со сдвигом в течение 1 минуты. Масло подвергали нормальному перемешиванию в течение 1 часа с помощью верхнеприводной мешалки. Маслу давали охлаждаться с перемешиванием при нормальной скорости до тех пор, пока температура масла не достигала 60°C, затем добавляли 1,8 миллилитра 4-молярного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали со сдвигом в течение 10 секунд. Лимонная кислота и щелочь образовывали слабый буфер с pH 4,5. Поддерживая температуру 60°C, добавляли 0,7429 грамма Diversa's Purifine (PLC липаза, номер партии 90BU002A1) и 0,1041 грамма Novozymes' Lecitase® Ultra (PLA1 липаза, номер партии LYN 05007), затем 40 граммов деионизированной воды и всю смесь перемешивали со сдвигом в течение 120 секунд. Масляную смесь перемешивали при нормальной скорости в течение 120 минут при температуре 60°C. Затем обработанное ферментом масло центрифугировали и собирали разделенные масло и влажные смолы. Остаточный фосфор в комбинированной смеси ферментов PLC и PLA1 при pH 4,5 приводил к обессмоленному маслу, содержащему 4,4 ч./млн остаточного фосфора.

Таблица 7
Пример	Добавление фермента	PLC (ч./млн активного фермента)	PLA1 (ч./млн активного фермента)	Время реакции (мин)	Темп. (°С)	рН	Вода (%)	Время перемешивания (с)	Фосфор (ч./млн)
31	Одновременно	20,9	0,7	120	40	4,5	2,0	120	10,7
32	Одновременно	10,3	0,7	120	60	4,5	4,5	45	6,7
33	Одновременно	10,4	0,7	30	40	4,5	4,5	120	2,2
34	Одновременно	20,7	0,6	30	60	4,5	2,0	45	16,5
35	Одновременно	20,7	0,6	120	40	4,5	4,5	45	1,9
36	Одновременно	21,0	0,7	30	60	4,5	4,5	120	5,2
37	Одновременно	10,2	0,6	30	40	4,5	2,0	45	6,7
38	Одновременно	10,2	0,6	120	60	4,5	2,0	120	4,4

Фиг.7 представляет собой график, обобщающий примеры 31-38, в котором среднее конечное количество фосфора нанесено на график для каждого уровня каждого фактора с поддержанием pH, дозы PLA и объединенного добавления постоянными.

Пять факторов, оцениваемых в данных примерах 31-38, перечислены ниже в порядке величины их эффекта на способ обессмоливания. Эффекты представляют собой различия в среднем уровне фосфора (в абсолютном значении) между высокой и низкой установками фактора.

Увеличение дозы воды снижает остаточный фосфор.

Уменьшение дозы PLC снижает остаточный фосфор.

Уменьшение температуры реакции снижает остаточный фосфор.

Увеличенное перемешивание снижает остаточный фосфор.

Увеличение времени реакции снижает остаточный фосфор.

Это описано в новом способе обессмоливания масел с использованием фермента фосфолипазы A и фермента фосфолипазы C одновременно. Неожиданно было обнаружено, что такая комбинация работает лучше, чем каждый фермент отдельно, даже когда, при необходимости, реакция с одним или другим из ферментов проходит в условиях реакции ниже оптимума для этого фермента. Неожиданно также было обнаружено, что обессмоливания до уровней менее приблизительно 10 ч./млн фосфора, настолько низких, как приблизительно 5 ч./млн фосфора, и даже настолько низких, как приблизительно 3 ч./млн фосфора, в конечном продукте можно достигать в подходящих условиях с настолько низким временем реакции, как приблизительно тридцать минут. Кроме того, без желания быть связанными с какой-либо теорией, по-видимому, либо фермент PLC, либо один из продуктов его реакции гидролиза, катализирует реакцию фермента PLA, допуская время реакции значительно меньшее, чем время реакции для любого из отдельных ферментов. Эти результаты являются неожиданными, если исходить из известных оптимальных параметров реакции для ферментов PLA и PLC.

Специалистам в данной области будет понятно из предшествующего описания, что различные рабочие параметры можно изменять в практическом осуществлении настоящего изобретения, в зависимости от целей конкретной ситуации, оставаясь в пределах объема изобретения. Например, при определении концентраций ферментов PLA и PLC, подлежащих использованию в конкретном прогоне, выбор будет зависеть от того, является ли целью прогон при наименьшей возможной стоимости или при наибольшей возможной производительности. Если целью является прогон при наименьшей возможной стоимости, тогда концентрация PLA может составлять менее приблизительно 2,0 ч./млн, предпочтительно менее приблизительно 1,0 ч./млн и наиболее предпочтительно менее приблизительно 0,5 ч./млн. Такая низкая концентрация фермента PLA еще может обеспечивать эффективное обессмоливание во многих ситуациях. Напротив, если желательна максимальная производительность, то концентрация PLA предпочтительно составляет по меньшей мере приблизительно 0,5 ч./млн более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1,0 ч./млн и наиболее предпочтительно 2,0 ч./млн. Специалистам в области переработки масла будет понятно, как изменять концентрации ферментов в реакционной смеси для достижения желаемого равновесия между экономической эффективностью и производительностью по продукту.

Возможны также изменения в других условиях переработки. Величина pH может составлять приблизительно 7,0, в то время как величина pH приблизительно 5,0 является предпочтительной и величина pH приблизительно 4,5 в настоящее время является предпочтительной. Концентрация воды в системе, как правило, может составлять приблизительно 3,0%, но может быть настолько низкой, как приблизительно 1,5%, если желательно уменьшение объема сточных вод, или настолько высокой, как приблизительно 4,5%, если желательна более высокая эффективность обессмоливания. Температура реакции может быть настолько высокой, как приблизительно 60°C, но более предпочтительно составляет менее приблизительно 50°C и, неожиданно, наиболее предпочтительно приблизительно 40°C. Время перемешивания при начальном смешивании может составлять приблизительно 45 секунд, более предпочтительно составляет приблизительно 60 секунд и наиболее предпочтительно составляет приблизительно 120 секунд. Наконец, продолжительность ферментативной реакции можно значительно уменьшить, в некоторых вариантах осуществления оно может преимущественно составлять менее приблизительно 60 минут и предпочтительно приблизительно 30 минут.

В то время как предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны в данном документе, другие варианты осуществления, включающие изобретательский способ, будут совершенно очевидными для специалистов в данной области, и все такие варианты осуществления и их эквиваленты предназначены, чтобы быть защищенными этой заявкой и охваченными ее формулой изобретения.