гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий

Классы МПК:C07K14/22 из Neisseriaceae (F), например Acinetobacter
C12N15/62 ДНК последовательности, кодирующие белки при слиянии
A61K38/16 пептиды, содержащие более 20 аминокислот; гастрины; соматостатины; меланотропины; их производные
A61P31/04 антибактериальные средства
Автор(ы):
Патентообладатель(и):НОВАРТИС ВЭКСИНС ЭНД ДИАГНОСТИКС С.Р.Л. (IT)
Приоритеты:
подача заявки:
2002-09-06
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению иммуногенов из Neisseria meningitides, и может быть использовано в медицине. Предложен белок, на 80% и более идентичный аминокислотной последовательности SEQ ID NO:19, а также иммуногенная композиция с указанным белком. Изобретение позволяет примененять указанный белок для эффективной профилактики или лечения бактериального менингита. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 28 табл.

гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495

Формула изобретения

1.Белок для применения в целях профилактики и/или лечения бактериального менингита, характеризующийся:

(a) аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:19; или

(b) аминокислотной последовательностью на 80% или более идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO:19.

2. Композиция для профилактики и/или лечения бактериального менингита, содержащая белок по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

3. Композиция по п.2, кроме того, содержащая адъювант.

4. Композиция по п.2, где белок адсорбируется на соли алюминия.

5. Композиция по п.4, где соль алюминия представляет собой фосфат алюминия.

6. Композиция по п.2, кроме того, содержащая буфер.

Описание изобретения к патенту

Все процитированные в данном описании документы включены в виде ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к области экспрессии белков. В частности, изобретение относится к экспрессии белков из Neisseria (например, N. gonorrhoeae или, предпочтительно, N. meningitidis).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В публикациях 1 и 2 раскрыты альтернативные и усовершенствованные способы экспрессии белков нейссерий, описанных в публикациях 3-6. Один из таких способов состоит в получении «гибридных» белков, при котором два или более белков нейссерий экспрессируются в виде одной полипептидной цепи. Указанный способ предоставляет два преимущества. Во-первых, белок, который может быть нестабильным или плохо экспрессируется сам по себе, может быть получен с помощью добавления подходящего партнера в гибриде, чтобы преодолеть данную проблему. Во-вторых, упрощается коммерческое производство, так как требуется использование только одной экспрессии и очистки, чтобы получить два отдельно применяемых белка.

Задачей данного изобретения являются новые альтернативные и улучшенные способы экспрессии белков нейссерий.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Гибридные белки

Таким образом, изобретение относится к способу одновременной экспрессии двух или более (например, 3, 4, 5, 6 или более) белков нейссерий, при котором указанные два или более белков связаны так, чтобы они транслировались в виде одной полипептидной цепи. В общем, гибридные белки согласно изобретению можно представить формулой: NH2-A-[-X-L-] n-B-COOH, где Х означает аминокислотную последовательность, L означает необязательную аминокислотную последовательность линкера, А означает необязательную N-концевую аминокислотную последовательность, В означает необязательную С-концевую аминокислотную последовательность и n является целым числом, большим 1.

Значение n находится в пределах от 2 до x, а значение x обычно равно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Предпочтительно n равно 2, 3 или 4; более предпочтительно 2 или 3; наиболее предпочтительно n=2.

Составляющие -X-

Существует две основных группы гибридных белков согласно изобретению. Указанные две группы не являются взаимоисключающими.

В первой группе каждая составляющая -Х- представляет собой:

(a) аминокислотную последовательность orf1, orf4, orf25, orf40, orf46.1, orf83, NMB1343, 230, 233, 287, 292, 594, 687, 736, 741, 907, 919, 936, 953, 961 или 983;

(b) аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью согласно (а); или

(c) аминокислотную последовательность, содержащую фрагмент аминокислотной последовательности согласно (а).

Предпочтительной подгруппой (а) являются: orf46.1, 230, 287, 741, 919, 936, 953, 961 и 983. Более предпочтительной подгруппой (а) являются: orf46.1, 287, 741 и 961. На фиг.3 показаны предпочтительные гибридные белки.

Во второй группе гибридный белок содержит первую составляющую -Х- (-Ха-) и вторую составляющую -Х- (-Хb-). Составляющая -Ха- имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей:

(d) 446 четных SEQ ID (т.е. 2, 4, 6, гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 , 890, 892), представленных в публикации 3;

(e) 45 четных SEQ ID (т.е. 2, 4, 6, гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 , 88, 90), представленных в публикации 4;

(f) 1674 четных SEQ ID NO:2-3020, четных SEQ ID NO:3040-3114 и все SEQ ID NO:3115-3241, представленные в публикации 5;

(g) 2160 аминокислотных последовательностей с NMB0001 по NMB2160 из публикации 7; или

(h) аминокислотная последовательность, представленная в публикации 1 или публикации 2.

Составляющая -Хb- является родственной -Ха- при условии, что: (i) -Хb- обладает идентичностью последовательностей с -Ха- и/или (j) -Хb- содержит фрагмент -Ха-.

Примеры указанного второго типа гибридного белка включают белки, в которых две или более составляющих -Х- являются идентичными или в которых они являются вариантами одного и того же белка, например, две полиморфные формы одного и того же белка могут экспрессироваться в виде -Хab-, и три полиморфные формы могут экспрессироваться в виде -Хabc- и т.д.

Составляющие -Ха- и -Хb- могут быть расположены в любом порядке от N-конца к С-концу.

Составляющая -Х а- предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность orf1, orf4, orf25, orf40, orf46.1, orf83, NMB1343, 230, 233, 287, 292, 594, 687, 736, 741, 907, 919, 936, 953, 961 или 983. Более предпочтительно составляющая -Ха- является аминокислотной последовательностью orf46.1, 230, 287, 741, 919, 936, 953, 961 или 983. Наиболее предпочтительно составляющая -Ха - является аминокислотной последовательностью orf46.1, 287, 741 или 961.

В случае белков, где каждый из n составляющих -Х- проявляет идентичность последовательностей с каждой другой составляющей -Х-, белок называют «тандемным белком». Предпочтительны тандемные белки, в которых n=2.

Степень «идентичности последовательностей» в отношении (b) и (1) предпочтительно составляет более 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более, до 100%). Это относится к мутантам, гомологам, ортологам, аллельным вариантам и т.д. [например, см. ссылку 8]. Идентичность предпочтительно определяют с помощью алгоритма поиска гомологии Смита-Ватермана, который выполняется в программе MPSRCH (Oxford Molecular), с использованием поиска аффинных гэпов с параметрами: штраф за открытие гэпа=12 и штраф за продолжение гэпа=1. Обычно идентичность, составляющая 50% или более, между двумя белками считается показателем функциональной эквивалентности.

«Фрагмент» по отношению к (с) и (j) должен состоять, по меньшей мере, из m следующих друг за другом аминокислот из аминокислотной последовательности из (a), (d), (е), (f), (g) или (h) и в зависимости от конкретной последовательности m равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 или более).

Предпочтительно фрагмент содержит эпитоп из аминокислотной последовательности из (а), (d), (е), (f), (g) или (h). Предпочтительными фрагментами являются фрагменты, описанные в публикациях 9 и 10.

Предпочтительными (с)- и (j)-фрагментами являются усеченные на С- и/или N-конце фрагменты (например, гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 1-287, гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 2-287 и т.д.).

В предпочтительные последовательности (b), (с), (i) и (j) не включены полиглициновые последовательности. Обнаружено, что это способствует экспрессии [ссылка 2]. Полиглициновые последовательности могут быть представлены в виде (Gly)g , где gгибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 3 (например, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более). Если составляющая -Х- содержит полиглициновую последовательность в своей форме дикого типа, предпочтительно исключить указанную последовательность в гибридных белках согласно изобретению. Это можно осуществить путем нарушения или удаления (Gly)g - посредством делеции (например, CGGGGS-CGGGS, CGGS, CGS или CS), замены (например, CGGGGS-CGXGGS, CGXXGS, CGXGXS и т.д.) и/или вставки (например, CGGGGSгибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 CGGXGGS, CGXGGGS и т.д.). Предпочтительна делеция (Gly) g и делеция N-концевой части белка до и включая полиглициновую последовательность (например, делеция остатков 1-32 в SEQ ID NO:1) обозначается в данном описании «гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G». Удаление полиглицина, в частности, применимо в случае белков 287, 741, 983 и Tbp2 (гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287, гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741, гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G983 и гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 GTbp2 - ссылки 1 и 2).

В предпочтительных (с)- и (j)-фрагментах исключены целые белковые домены. В частности, это применимо в случае белка 961, 287 и ORF46. В том случае, если белок условно разделен на домены, в (с)- и (j)-фрагментах могут быть исключены один или несколько указанных доменов (например, 287В, 287С, 287ВС, ORF461-433, ORF46434-608 , 961с - ссылка 2; фигуры 4 и 5 в данном описании).

Белок 287 условно разделен на три домена, названных А, В и С (см. фигуру 5 в публикации 2). Домен В выравнивается с протеазами IgA, домен С выравнивается с белками, связывающими трансферрин, и не наблюдается строгого выравнивания домена А с последовательностями в базе данных. Выравнивание полиморфных форм 287 описано в публикации 8.

ORF46 условно разделен на два домена - первый домен (аминокислоты 1-433; ORF46.1), который высококонсервативен среди видов и серогрупп, и второй домен (аминокислоты 434-608), который не является высоко консервативным. Второй домен предпочтительно делегируют, оставляя ORF46.1. Выравнивание полиморфных форм ORF46 описано в публикации 8.

Белок 961 условно разделен на несколько доменов (фиг.4).

Если составляющая -Х- имеет последовательность лидерного пептида в своей форме дикого типа, она может быть включена или опущена в гибридных белках согласно изобретению. Когда лидерный пептид исключен, последовательность является предпочтительным примером аминокислотной последовательности по (с) и (j). В одном варианте лидерные пептиды будут делегированы, за исключением случая, когда составляющая -Х- расположена на N-конце гибридного белка, т.е. лидерный пептид X1 будет сохранен, а лидерные пептиды Х2 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 Хn будут удалены. Это эквивалентно делегированию всех лидерных пептидов и использованию лидерного пептида X 1 в виде составляющей -А-.

В том случае, когда n=2, предпочтительными парами составляющих -Х- являются: гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287 и 230; гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287 и 936; гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287 и 741; 961с и 287; 961с и 230; 961с и 936; 961cL и 287; 961cL и 230; 961cL и 936; ORF46.1 и 936; ORF46.1 и 230; 230 и 961; 230 и 741; 936 и 961; 936 и 741. В том случае, когда n=2, предпочтительными парами составляющих -Х- для тандемных белков являются: гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741 и 741; гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287 и 287. Более конкретно в случае, когда n=2, предпочтительными являются следующие комбинации X1 и Х2:

X1X 2гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 X1 X2
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287230 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 230 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287936 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 936 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287741 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 741 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287961 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 961 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287ORF46.1 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ORF46.1 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287919 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 919 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287953 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 953 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287
961с287 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 287 961с
961с 230 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 230 961с
961с 936 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 936 961с
961с 741 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 741 961с
961с 983 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 983 961с
961с гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G983гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G983961с
961с ORF46.1гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ORF46.1 961с
961ORF46.1 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ORP46.1 961
961cL287 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 287 961cL
961cL 230 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 230 961cL
961cL 936 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 936 961cL
ORF46.1 936 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 936 ORF46.1
ORF46.1230 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 230 ORF46.1
ORF46.1741 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 741 ORF46.1
ORF46.1гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741ORF46.1
ORF46.1 983 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 983 ORF46.1
ORF46.1гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G983гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G983ORF46.1
230 961гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 961 230
230 741 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 741 230
230 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741230
936 961гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 961 936
936 741 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 741 936
936 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741936
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741741 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287287
ORF46.1 983 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 983 ORF46.1
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741ORF46.1 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ORF46.1 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741983 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 983 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741961 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 961 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741961с гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 961с гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G983ORF46.1 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ORF46.1 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G983
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G983961 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 961 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G983
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G983961с гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 961с гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G983

В том случае, когда 287 используют в полноразмерной форме, он предпочтительно находится на С-конце гибридного белка; если его необходимо использовать на N-конце, то предпочтительно используют гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G-форму 287. Подобным образом, в том случае, когда 741 используют в полноразмерной форме, он предпочтительно расположен на С-конце гибридного белка; если его необходимо использовать на N-конце, то предпочтительно используют гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G-форму 741.

Составляющие -L-

Для каждого n случая [-X-L-] линкерная аминокислотная последовательность -L- может присутствовать или отсутствовать. Например, когда n=2 гибрид может представлять собой NH2-X1-L 1-X2-L2-COOH, NH2-X 1-X2-COOH, NH2-X1-L 1-X2-COOH, NH2-X1-X 2-L2-COOH и т.д.

Линкерная аминокислотная последовательность(ти) -L- обычно будет(будут) короткой(короткими) (например, 20 или меньше аминокислот, т.е. 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование, полиглициновые линкеры (т.е. Glyn, где n=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) и гистидиновые метки (т.е. HiS n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более). Другие подходящие линкерные аминокислотные последовательности будут очевидны для специалистов в данной области. Применим линкер GSGGGG (SEQ ID NO:27), при этом дипептид Gly-Ser образован из сайта рестрикции BamHI, таким образом, способствуя клонированию и манипуляциям, а тетрапептид Gly4 является типичным полиглициновым линкером.

Если Xn+1 является белком гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G и Ln является глициновым линкером, это может быть эквивалентно случаю, когда Xn+1 не является гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G-белком, а Ln отсутствует.

Составляющая -А-

-А- является необязательной N-концевой аминокислотной последовательностью. Обычно она является короткой (например, 40 или меньше аминокислот, т.е. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают лидерные последовательности для направленного перемещения белков или короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например, гистидиновые метки, т.е. Hisn, где n=3, 4, 5, 6, 1, 8, 9, 10 или более). Другие подходящие N-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны для специалистов в данной области. Если X1 не содержит на своем N-конце метионин, -А- может быть остатком метионина.

Составляющая -В-

-В- является необязательной С-концевой аминокислотной последовательностью. Обычно она является короткой (например, 40 или меньше аминокислот, т.е. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают последовательности для направленного перемещения белков, короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например, содержащие гистидиновые метки, т.е. Hisn, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более), или последовательности, которые повышают стабильность белка. Другие подходящие С-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны специалистам в данной области.

Полиморфные формы белков

В изобретении можно использовать аминокислотные последовательности из любых штаммов N. meningitidis. Ссылка на конкретный белок (например, «287» или «ORF46.1») таким образом включает в себя такой белок из любого штамма. Вариации последовательностей между штаммами включены в (b), (с), (i) и (j).

Опубликованные последовательности из N. meningitidis серогруппы В включают:

БелокСсылка гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 Белок Ссылка
orf1 Ref.3, SEQ ID 650 orf4Ref.3, SEQ ID 218
orf25Ref.3, SEQ ID 684orf40 Ref.4, SEQ ID 4
orf46 Ref.6, SEQ ID 1049 orf83Ref.3, SEQ ID 314
NMB1343Ref.7, NMB1343 230 Ref.5, SEQ ID 830
233Ref.5, SEQ ID 860287 Ref.5, SEQ ID 3104
292Ref.5. SEQ ID 1220594 Ref.5, SEQ ID 1862
687Ref.5, SEQ ID 2282736 Ref.5, SEQ ID 2506
741Ref.5, SEQ ID 2536907 Ref.5, SEQ ID 2732
919Ref.5, SEQ ID 3070936 Ref.5, SEQ ID 2884
953Ref.5, SEQ ID 2918961 Ref.5, SEQ ID 940
983Ref.7, NMB1969 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495

В публикации 8 описаны полиморфные формы белков ORF4, ORF40, ORF46, 225, 235, 287, 519, 726, 919 и 953. Полиморфные формы 961 описаны в публикациях 11 и 12. Любую из указанных полиморфных форм можно использовать согласно данному изобретению.

Приведенный в данном описании список последовательностей включает полиморфные формы белков 741 (SEQ ID 1-22) и NMB1343 (SEQ ID 23-24), которые были идентифицированы.

Серогруппы и штаммы

Предпочтительные белки согласно изобретению содержат составляющие -Х-, имеющие аминокислотную последовательность, обнаруженную в N. meningitidis серогруппы В. В одном белке согласно изобретению отдельные составляющие -Х- могут быть из одного или нескольких штаммов. Например, когда n=2, Х2 может быть из того же самого штамма, что и X1, или из другого штамма. Когда n=3, штаммы могут быть (i) Х12 3, (ii) Х12гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 Х3, (iii) Х1гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 Х23, (iv) Х1гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 Х2гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 Х3 или (v) X1=X3гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 X2 и т.д.

В серогруппе В предпочтительные составляющие -Х- получены из штаммов 2996, МС58, 95N477 или 394/98. Штамм 95N477 иногда в данном описании называют «ЕТ37», это его электрофоретический тип. Штамм 394/98 иногда в данном описании называют «nz», так как это новозеландский штамм.

В том случае, когда используют форму 287, она предпочтительно получена из штамма 2996 или из штамма 394/98.

В том случае, когда используют форму 741, предпочтительно она получена из штаммов серогруппы В МС58, 2996, 394/98 или 95N477 или из штамма серогруппы С 90/18311.

В том случае, когда используют форму 961, предпочтительно она получена из штамма 2996.

Штаммы указаны подстрочным индексом, например, 741мс58 означает белок 741 из штамма МС58. Если не оговорено особо, указанные в данном описании белки (например, без подстрочного индекса) из штамма 2996 N. meningitidis, который может быть принят в качестве «эталонного» штамма. Однако будет понятно, что изобретение в общем не ограничено штаммом. Как указано выше, можно полагать, что общая ссылка на белок (например, «287», «919» и т.д.) включает такой белок из любого штамма. Обычно он будет обладать идентичностью последовательностей с 2996, равной 90% или более (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более).

Основанная на доменах экспрессия белка 961

В публикациях 1 и 2 описано, как можно условно разделить белок на домены и как можно осуществлять манипуляции с белком на основе указанных доменов. В данном изобретении расширено применение данного способа по отношению к белку 961 (также, известный как «NadA» [11, 12]).

У штамма 2996 N. meningitidis серогруппы В NadA содержит 405 аминокислот. Указанный белок условно разделен на следующие девять доменов (фиг.4):

Название домена Аминокислоты Название домена Аминокислоты
961-1 'L' 1-23961-6 269-286
961-224-87 961-7 287-330
961-388-143 961-8 ЗЗТ-350
961-4144-180 961-9 351-405
961-5181-268 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495

Приведенную информацию можно использовать для локализации таких же доменов в других формах 961.

Указанные домены были делегированы из 961 штамма 2996 различными способами (фиг.5). В предпочтительных фрагментах 961 исключен один или несколько из указанных девяти доменов, например, следующие:

- с 961-2 по 961-5 («961а»)

- с 961-6 по 961-9 («961b»)

- с 961-1 по 961-8 («961cL»)

- с 961-2 по 961-8 («961с»)

- с 961-2 по 961-6 и аминокислоты 287-325 из домена 961-7 («961d»)

- с 961-2 по 961-8 и аминокислоты 351-383 из домена 961-9 («961гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 1»)

- с 961-1 по 961-8 и аминокислоты 351-383 из домена 961-9 («961гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 1L»)

- с 961-1 по 961-7 и аминокислоты 331-343 из домена 961-8 («961cL-гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 aro»)

- с 961-1 по 961-6 и аминокислоты 287-315 из домена 961-7 («961cL-гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 cc»)

- с 961-1 по 961-5 («961aL»)

- с 961-1 по 961-4 («961aL-гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 1»)

- с 961-1 по 961-3 («961aL-гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 2»)

- с 961-1 по 961-2 («961aL-гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 3»)

Указанные тринадцать фрагментов (и их подфрагментов, в которых отсутствуют 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот на любом из концов или на обоих концах) являются предпочтительными (с)- и (j)-фрагментами, но они также могут быть экспрессированы сами по себе, т.е. не в форме гибридного белка согласно изобретению. Таким образом, изобретение относится к белку, содержащему один из указанных фрагментов, при условии, что белок не является полноразмерным 961 и не является белком, конкретно описанным в публикации 1 или 2. Данный белок может быть слитым белком (например, слиянием с GST или слиянием с His-меткой).

Последовательности

Изобретение также относится к белку, имеющему аминокислотную последовательность из SEQ ID 1-24. Изобретение также относится к белкам и нуклеиновой кислоте, имеющим последовательности, идентичные указанным. Как описано выше, степень «идентичности последовательностей» предпочтительно выше 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или выше).

Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей такие белки.

Кроме того, изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая может гибридизоваться с данной нуклеиновой кислотой предпочтительно в условиях «высокой жесткости» (например, при 65°С в растворе 0,1×SSC, 0,5% SDS).

Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей белки согласно изобретению.

Следует понимать, что изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательности, комплементарные последовательностям, описанным выше (например, используемым в качестве антисмысловых или в виде зондов).

Нуклеиновую кислоту согласно изобретению, конечно, можно получить множеством способов (например, в результате химического синтеза, из библиотеки геномной или кДНК, из самого организма и т.д.), и она может принимать различные формы (например, однонитевую, двунитевую, векторы, зонды и т.д.).

Кроме того, термин «нуклеиновая кислота» включает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные остовы, а также пептидонуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д.

Смеси

Изобретение также относится к композиции, содержащей два или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) из следующих белков:

(1) 287

(2) 741

(3) ORF46.1

(4) 961

(5) NH2-A-[-X-L-]n -B-COOH, где n=2, X1=287, X2=953

(6) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH, где n=2, X 1=287, X2=919

(7) NH2 -A-[-X-L-]n-B-COOH, где n=2, X1=287, X 2=961

Смесь может содержать один или оба из следующих белков либо в комбинации с двумя или большим количеством белков (1)-(7), либо в комбинации только с одним из белков (1)-(7):

(8) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH, где n=2, X1=287, X2=741

(9) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH, где n=2, X 1=936, Х2=741

В том случае, когда в смесь включены белки 287 и 741 (т.е. в случае белка 1, 2, 5, 6, 7 или 8), они могут быть в форме «гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G». В том случае, когда включен белок 961, он предпочтительно находится в форме «961с», в которой отсутствуют N-концевой лидер и С-концевой мембранный якорь [например, см. ссылки 1, 2 и 11].

Предпочтительная смесь содержит следующие три белка:

(1) 961с, предпочтительно 961 с2996 (например, SEQ ID NO:31, приведенная в данном описании);

(2) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH, где n равно 2, -X1- означает гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287 (предпочтительно гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287NZ), -Х2- означает 953 (предпочтительно 9532996), не содержащий своего лидерного пептида, -L1- означает GSGGGG и -А- содержит N-концевой метионин (например, -А- является М или МА) (например, SEQ ID NO:28 и 29, приведенные в данном описании); и

(3) NH 2-A-[-X-L-]n-B-COOH, где n=2, X1=936 (предпочтительно 9362996), X2=гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741 (предпочтительно гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741MC58), L1=GSGGGG (например, SEQ ID NO:30, приведенная в данном описании).

Смеси также могут содержать пузырьки наружной мембраны N. meningitidis.

Гетерологичный хозяин

Хотя экспрессия белков согласно изобретению может иметь место в Neisseria, в данном изобретении предпочтительно используется гетерологичный хозяин. Гетерологичный хозяин может быть прокариотическим (например, бактерией) или эукариотическим. Предпочтительно хозяином является Е.coli, но другие подходящие хозяева включают Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (например, М. tuberculosis), дрожжи и т.д.

Векторы и др.

Изобретение относится к (а) нуклеиновой кислоте, кодирующей описанные выше белки, (b) векторам, содержащим указанные последовательности нуклеиновых кислот, (с) клеткам-хозяевам, содержащим указанные векторы, (d) композициям, содержащим белки или нуклеиновые кислоты согласно изобретению, которые могут быть подходящими в качестве иммуногенных композиций (например, вакцин) или в качестве диагностических реагентов, (е) указанным композициям для применения в качестве лекарственных средств (например, в качестве вакцин) или в качестве диагностических реагентов, (f) применению указанных композиций в производстве (1) лекарственного средства для лечения или профилактики инфекций, обусловленных бактериями нейссериями, (2) диагностического реагента для выявления наличия бактерий нейссерий или антител, выработанных против бактерий нейссерий, и/или (3) реагента, который может вызывать образование антитела против бактерий нейссерий, и (g) к способу лечения пациента, предусматривающему введение пациенту терапевтически эффективного количества указанных композиций.

Осуществление изобретения, как правило, будет включать в себя основные стадии: получение первой нуклеиновой кислоты, кодирующей первый белок; получение второй нуклеиновой кислоты, кодирующей второй белок; и лигирование первой и второй нуклеиновых кислот. Полученную в результате нуклеиновую кислоту можно встраивать в экспрессирующий вектор, или она уже может быть частью экспрессирующего вектора.

Чтобы повысить растворимость, очистка гибридных белков может включать в себя способы рефолдинга, описанные в данной заявке.

Иммуногенные композиции и лекарственные средства

Композиции согласно изобретению предпочтительно являются иммуногенными композициями и более предпочтительно композициями вакцин. Значение рН композиции предпочтительно составляет от 6 до 7. рН можно поддерживать с использованием буфера. Композиция может быть стерильной.

Вакцины согласно изобретению могут быть либо профилактическими (т.е. для того, чтобы предотвращать инфекцию) или терапевтическими (т.е. для того, чтобы лечить инфекцию), но, как правило, будут профилактическими.

Изобретение также относится к композиции согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства. Лекарственное средство предпочтительно способно вызывать иммунный ответ у млекопитающего (т.е. является иммуногенной композицией) и наиболее предпочтительно является вакциной.

Изобретение также относится к применению композиции согласно изобретению в производстве лекарственного средства, вызывающего иммунный ответ у млекопитающего. Лекарственное средство предпочтительно является вакциной.

Изобретение также относится к способу, позволяющему вызвать иммунный ответ у млекопитающего, включающему в себя стадию введения эффективного количества композиции согласно изобретению. Иммунный ответ предпочтительно является защитным. Способ может вызывать вторичный иммунный ответ.

Млекопитающим предпочтительно является человек. В том случае, когда вакцина предназначена для профилактического применения, человек предпочтительно является ребенком (например, ребенком раннего или младшего возраста); в том случае, когда вакцина предназначена для терапевтического применения, человек предпочтительно является взрослым. Вакцину, предназначенную для детей, также можно вводить взрослым, например, чтобы оценить безопасность, дозу, иммуногенность и т.д.

Указанные применения и способы предпочтительно предназначены для профилактики и/или лечения заболевания, вызванного Neisseria (например, менингита, заражения крови, гонореи и т.д.). Предпочтительна профилактика и/или лечение бактериального менингита.

Дополнительные компоненты композиции

Композиция согласно изобретению, как правило, кроме указанных выше компонентов будет содержать один или несколько «фармацевтически приемлемых носителей», которые включают любой носитель, который сам по себе не индуцирует продукции антител, вредных для индивидуума, принимающего композицию. Подходящие носители обычно являются крупными, медленно метаболизирующими макромолекулами, такими как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, трегалоза (WO 00/56365) и липидные аггрегаты (такие как капельки масла или липосомы). Такие носители хорошо известны специалистам в данной области. Вакцины также могут содержать разбавители, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и т.д. Дополнительно могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, буферные вещества для поддержания рН и тому подобные. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых эксципиентов имеется в Remington's Pharmaceutical Sciences.

Иммуногенные композиции, используемые в качестве вакцин, содержат иммунологически эффективное количество антигена, а также при необходимости любой другой из вышеуказанных компонентов. Под «иммунологически эффективным количеством» подразумевается, что введение этого количества индивидууму либо в однократной дозе, либо в виде части серии доз является эффективным для лечения или профилактики. Данное количество варьирует в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, которого необходимо лечить, возраста, таксономической группы индивидуума, которого необходимо лечить (например, примат, отличный от человека, примат и т.д.), способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, степени требуемой защиты, приготовления препарата вакцины, оценки лечащим врачом медицинского случая и других факторов, имеющих к этому отношение. Предполагается, что количество будет находиться в относительно широких пределах, которые можно определить посредством обычных испытаний. Режим дозирования может представлять собой схему на основе однократной дозы или схему с использованием многократных доз (например, включая повторные дозы). Вакцину можно вводить вместе с другими иммунорегулирующими агентами.

Композиция может содержать другие адъюванты в дополнение (или вместо) соли алюминия. Предпочтительные адъюванты для усиления эффективности композиции включают, но не ограничены указанным: (1) эмульсионные препараты типа «масло-в-воде» (в присутствии или без других специфичных иммуностимулирующих агентов, таких как мурамилпептиды (см. ниже) или компоненты клеточной стенки бактерий), такие как, например, (a) MF59гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 (WO 90/14837; глава 10 в ссылке 13), содержащий 5% Сквален, 0,5% Твин 80 и 0,5% Спан 85 (необязательно содержащий МТР-РЕ), приготовленный в виде субмикронных частиц с использованием микрофлюидизатора, (b) SAF, содержащий 10% Сквалан, 0,4% Твин 80, 5% блок-сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена L121 и thr-MDP, либо микрофлюидизированный до субмикронной эмульсии, либо подвергнутый встряхиванию для образования эмульсии с частицами более крупного размера, и (с) адъювантная система Ribiгибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), содержащая 2% Сквален, 0,2% Твин 80 и один или несколько компонентов клеточной стенки бактерий из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL), димиколата трегалозы (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL+CWS (Detoxгибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ); (2) можно использовать адъюванты на основе сапонина, такие как QS21 или Stimulonгибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), или частицы, созданные на их основе, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы), и указанные ISCOM могут не содержать дополнительного детергента, например, WO 00/07621; (3) полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA); (4) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (WO 99/44636), и т.д.), интерфероны (например, гамма-интерферон), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF) и т.д.; (5) монофосфориллипид А (MPL) или 3-O-деацилированный MPL (3dMPL), например, GB-2220221, ЕР-А-0689454; (6) комбинации 3dMPL, например, с QS21 и/или эмульсиями типа «масло-в-воде», например, ЕР-А-0835318, ЕР-А-0735898, ЕР-А-0761231; (7) олигонуклеотиды, содержащие CpG-мотивы [Krieg, Vaccine 2000, 19, 618-622; Krieg Curr. opin. Mol. Ther. 2001, 3: 15-24; Roman et al., Nat. Med., 1997, 3, 849-854; Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis et al., J. Immunol., 1998, 160, 870-876; Chu et al., J. Exp. Med., 1997, 186, 1623-1631; Lipford et al., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344; Moldoveanu et al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman et al., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883; Ballas et al., J. Immunol., 1996, 157, 1840-1845; Cowdery et al., J. Immunol., 1996, 156, 4570-4575; Halpern et al., Cell. Immunol., 1996, 167, 72-78; Yamamoto et al., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey et al., J. Immunol., 1996, 157, 2116-2122; Messina et al., J. Immunol., 1991, 147, 1759-1764; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 4918-4925; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402; Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 4755-4761; и Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906; международные заявки на выдачу патентов WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 и WO 98/52581], т.е. содержащие, по меньшей мере, один динуклеотид CG, при этом необязательно вместо цитозина используют 5-метилцитозин; (8) простой полиоксиэтиленовый эфир или сложный полиоксиэтиленовый эфир, например, WO 99/52549; (9) поверхностно-активное вещество сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана в комбинации с октоксинолом (например, WO 01/21207) или поверхностно-активное вещество простой или сложный эфир полиоксиэтиленалкила в комбинации, по меньшей мере, с одним дополнительным неионогенным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол (например, WO 01/21152); (10) иммуностимулирующий олигонуклеотид (например, CpG-олигонуклеотид) и сапонин, например WO 00/62800; (11) иммуностимулятор и частица соли металла, например, WO 00/23105; (12) сапонин и эмульсия типа «масло-в-воде», например, WO 99/11241; (13) сапонин (например, QS21)+3dMPL+IL-12 (необязательно+стерол), например, WO 98/57659; (14) другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие агенты, чтобы повысить эффективность композиции.

Мурамилпептиды включают N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-[1',2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ) и т.д.

Дополнительные антигены

Дополнительные антигены, которые можно включать в композицию согласно изобретению, включают:

- препарат пузырьков наружной мембраны (OMV) из N. meningitidis серогруппы В, такой как препараты, описанные в ссылках 14, 15, 16, 17 и т.д.,

- сахаридный антиген из N. meningitidis серогруппы А, С, W135 и/или Y, такой как олигосахарид, описанный в публикации 18, из серогруппы С [см. также ссылку 19], или олигосахариды, описанные в публикации 20,

- сахаридный антиген из Streptococcus pneumoniae [например, ссылки 21, 22, 23],

- белковый антиген из Helicobacter pylori, такой как СаgА [например, 24], VacA [например, 24], NAP [например, 25], НорХ [например, 26], HopY [например, 26] и/или уреаза,

- антиген вируса гепатита А, такой как инактивированный вирус [например, 27, 28],

- антиген вируса гепатита В, такой как поверхностный и/или коровый антигены [например, 28, 29],

- антиген вируса гепатита С [например, 30],

- антиген из Bordetella pertussis, такой как голотоксин коклюша (РТ) и филаментный гемагглютинин (FHA) В. pertussis, необязательно также в комбинации с пертактином и/или агглютиногенами 2 и 3 [например, ссылки 31 и 32],

- дифтерийный антиген, такой как дифтерийный токсоид [например, глава 3, ссылка 33], например, мутант CRM197 [например, 34],

- антиген столбняка, такой как токсоид столбняка [например, глава 4 в ссылке 33],

- сахаридный антиген из Haemophilus influenzae В [например, 19],

- антиген из N. gonorrhoeae [например, 3, 4, 5],

- антиген из Chlamydia pneumoniae [например, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41],

- антиген из Chlamydia trachomatis [например, 42],

- антиген из Porphyromonas gingivalis [например, 43],

- антиген(ы) полиовируса [например, 44, 45], такого как IPV или OPV,

- антиген(ы) вируса бешенства [например, 46], такие как лиофилизованный инактивированный вирус [например, 47, RabAvertгибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ],

- антигены кори, свинки и/или краснухи [например, главы 9, 10 и 11, ссылка 33],

- антиген(ы) гриппа [например, глава 19 в ссылке 33], такие как поверхностные белки гемагглютинин и/или нейраминидаза,

- антиген из Moraxella catarrhalis [например, 48],

- белковый антиген из Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В) [например, 49, 50],

- сахаридный антиген из Streptococcus agalactiae,

- антиген из Streptococcus pyogenes (стрептококк группы А) [например, 50, 51, 52],

- антиген из Staphylococcus aureus [например, 53].

Композиция может содержать один или несколько из указанных дополнительных антигенов.

В том случае, когда используют сахаридный или углеводный антиген, он предпочтительно конъюгирован с белком-носителем для того, чтобы повысить иммуногенность [например, ссылки 54-63]. Предпочтительными белками-носителями являются бактериальные токсины или токсоиды, такие как токсоиды дифтерии или столбняка. Токсоид дифтерии CRM197 является особенно предпочтительным. Другие подходящие белки-носители включают белок наружной мембраны N. meningitidis [например, ссылка 64], синтетические пептиды [например, 65, 66], белки теплового шока [например, 67], белки коклюша [например, 68, 69], белок D из Н. influenzae [например, 70], токсин А или В из С.difficile [например, 71] и т.д. В том случае, когда смесь содержит капсульные сахариды как А-, так и С-серогруппы, предпочтительно, чтобы отношение (мас./мас.) сахарид МеnА: сахарид МеnС было более 1 (например, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 или более). Сахариды из разных серогрупп N. meningitidis можно конъюгировать с одним и тем же или с разными белками-носителями.

Можно использовать любую подходящую реакцию конъюгации с любым подходящим линкером в случае необходимости.

Токсичные белковые антигены в случае необходимости можно подвергнуть детоксикации (например, детоксикация токсина коклюша химическими и/или генетическими способами [32]).

В том случае, когда в композицию включен дифтерийный антиген, также предпочтительно включить антиген столбняка и антигены коклюша. Подобным образом, когда включен антиген столбняка, предпочтительно также включить антигены дифтерии и коклюша. Подобным образом, когда включен антиген коклюша, предпочтительно также включить антигены дифтерии и столбняка.

Антигены предпочтительно смешивают (и более предпочтительно адсорбируют) с солью алюминия (например, фосфатом, гидроксидом, гидроксифосфатом, оксигидроксидом, ортофосфатом, сульфатом). Соль может принимать любую подходящую форму (например, гелеобразную, кристаллическую, аморфную и т.д.).

Антигены в композиции, как правило, будут присутствовать в концентрации, по меньшей мере, 1 мкг/мл каждого. В общем, концентрация любого данного антигена должна быть достаточна для того, чтобы вызвать иммунный ответ против данного антигена.

В качестве альтернативы использования белковых антигенов в композиции согласно изобретению можно использовать нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген [например, ссылки 72-80]. Таким образом, белковые компоненты композиций согласно изобретению можно заменить нуклеиновой кислотой (предпочтительно ДНК, например, в форме плазмиды), которая кодирует белок.

Определения

Термин «содержащий» означает «включающий в себя», а также «состоящий из», например, композиция, «содержащая» X, может состоять исключительно только из Х или может включать в себя что-нибудь дополнительно, например, X+Y.

Термин «примерно» по отношению к числовому значению х означает, например, x±10%.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 показано выравнивание двадцати трех последовательностей белка 741. Последовательности представляют собой SEQ ID 1-22 плюс последовательность из МС58.

На фиг.2 показано выравнивание последовательности NMB1343 из гонококка (вверху; SEQ ID NO:25) и менингококка (внизу; SEQ ID NO:26).

На фиг.3 показаны гибридные и тандемные белки согласно изобретению.

На фиг.4 показаны 9 доменов в 9612996 , а на фиг.5 показано, каким манипуляциям подвергали домены.

ВАРИАНТЫ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Гибридные белки - X1=гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287

Кроме белков, описанных в публикациях 1 и 2, конструировали семь гибридных белков с гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287 из штамма 2996 на N-конце. Также получены восемь тандемных белков 287 (см. ниже).

# nX1 L1 X2L 2
12 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287- 230 (His)6
22 -936 (His)6
32 -741MC58 (His)6
4 2 -741ET37 (His)6
5 2 -74190/18311 (His)6
6 2 -74195N477 (His)6
7 2 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287nz -741MC58 (His)6

К указанным белкам добавляли адъювант, либо полный адъювант Фрейнда (FCA), либо 3 мг/мл квасцов и использовали для иммунизации мышей. Полученные в результате сыворотки тестировали против различных штаммов нейссерий, используя бактерицидный анализ. Титры при использовании белка № 3 были следующими:

гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495

В следующих экспериментах с использованием белка № 3 с добавлением адъюванта гидроксида алюминия, титры анти-287 и анти-741 в ELISA, каждый из которых превышал титры 984150 и БСА, были следующими:

2996(B) MC58(B) NGH38(B) 394/98(B) 44/76(B) F6124(A) BZ133(C)
800065000 40004000 320008000 16000

Следующие результаты получали после иммунизации белками, описанными в публикациях 1 и 2, тестированными против гомологичного штамма:

nX 1 L1 X2 L2 Бактерицидный титр EUSA
FCA Квасцы FCAКвасцы
2 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287394/98 -961 (His)6 -32768 ->109350
919 327684096 47183678
953 >32768>16384 1900 6936
741 16384 2048232 862
2гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G2872996 -961 (His)6 6553632768 108627 >109350
919128000 3200011851 2581
95365536 -3834 -
741 16384 8192315 4645

Гибридные белки - X1=961с или 961cL

Кроме белков, описанных в публикациях 1 и 2, конструировали восемь гибридных белков либо с 961с, либо с 961cL (т.е. 961с+лидерный пептид) на N-конце:

# nX1 L1 X2L 2
12 961с- 287-
2 2- 287(His)6
3 2 -230 (His)6
42 -936 (His)6
52 961cL- 287-
6 2- 287(His)6
7 2 -230 (His)6
82 -936 (His)6

К указанным белкам добавляли адъювант, либо полный адъювант Фрейнда (FCA), либо 3 мг/мл квасцов и использовали для иммунизации мышей. Полученные в результате сыворотки тестировали против различных штаммов нейссерий, используя бактерицидный анализ. Титры при использовании белка № 8 были следующими;

Штамм (серогруппа) 2996(B) МС58(B) 394/98(B) 44/76(B) F6124(A)
Гидроксид Al8192 8192512 1024<16
FCA 6553616384 >2048 >20488192

Титры, полученные после иммунизации 961с-741 [ссылки 1 и 2], были следующими:

гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495

Указанные результаты можно было улучшить в результате смешивания 961с-741 с ORF46.1 или с гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287-919.

Получали следующие результаты после иммунизации белками, описанными в публикациях 1 и 2, тестированными против гомологичного штамма:

nX 1 L1 Х2 L2 Бактерицидный титр ELISA
FCA Квасцы FCAКвасцы
2 961с - ORF46.1 (His)6 327681024 >109350>109350
741 >163848192 >109350 >109350
936>32768 8192 >109350>109350

Гибридные белки - X1=ORF46.1

Кроме белков, описанных в публикациях 1 и 2, конструировали два гибридных белка с ORF46.1 на N-конце:

# nX1 L1 X2L 2
12 ORF46.1- 936(His)6
2 2 -230 (His)6

К указанным белкам добавляли адъювант, либо полный адъювант Фрейнда (FCA), либо 3 мг/мл квасцов и использовали для иммунизации мышей. Полученные в результате сыворотки тестировали против гомологичного штамма, используя бактерицидный анализ и ELISA.

Следующие результаты получали после иммунизации белками, описанными в публикациях 1 и 2:

nX 1 L1 X2 L2 Бактерицидный титр ELISA
FCA Квасцы FCAКвасцы
2 ORF46.1 - 961(His)6 8192 819221558 >109350
-961с (His)6 8192128 902076545

Гибридный белок - X 1=230

Кроме белков, описанных в публикациях 1 и 2, конструировали четыре гибридных белка с 230 на N-конце:

# nX1 L1 X2L 2
12 230- ORF46.1(His) 6
22 -961 (His)6
32 -961с (His)6
42 -741MC58 (His)6

Гибридный белок - X1=936

Кроме белков, описанных в публикациях 1 и 2, конструировали семь гибридных белков с 936 на M-конце:

# nX1 L1 X2L 2
12 936- ORF46.1(His) 6
22 -961 (His)6
32 -741ET37 (His)6
4 2 -741MC58 (His)6
5 2 -74190/18311 (His)6
6 2 -74195N477 (His)6
7 2 -741 (His)6

К указанным белкам добавляли адъювант, либо полный адъювант Фрейнда (FCA), либо 3 мг/мл квасцов и использовали для иммунизации мышей. Полученные в результате сыворотки тестировали против различных штаммов нейссерий, используя бактерицидный анализ. Титры при использовании белка № 2 были следующими:

гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495

Титры при использовании белка № 4 были следующими:

Штамм (серогруппа) 2996(B) МС58(B) 394/98(B) 44/76(B) F6124(A)
Гидроксид Al256 >262144>2048 32768 8192
FCA 1024 >262144>2048 >32768 >32768

Титры при использовании белка № 7 были следующими:

Штамм (серогруппа) 2996(B) МС58(B) 394/98(B) 44/76(B) F6124(A) BZ133(C)
Гидроксид Al256 130000 1600032000 8000 16000

Следующие результаты получали после иммунизации белками, описанными в публикациях 1 и 2, тестированными против гомологичного штамма:

nX 1 L1 X2 L2 Бактерицидный титр EUSA
FCA Квасцы FCAКвасцы
2 936 - 741 (His)6 1024256 14665715
936 >32768>32768 >109350 >109350

Смеси гибридных белков

Мышей иммунизировали тремя белками с добавлением адъюванта гидроксида алюминия, либо отдельно, либо в тройной комбинации: (1) 287NZ-953; (2) 936-741 и (3) 961с. Смесь обладала способностью индуцировать высокие бактерицидные титры против различных штаммов:

гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 2996 (B)МС58 (B)NGH38 394/98(B) Н44/76(B) F6124(A) BZ133(C) C11(C)
(1) 32000 16000130000 16000 320008000 160008000
(2) 256131000 12816000 320008000 16000<4
(3) 320008000 -- -8000 -32000
Смесь 3200032000 65000 16000260000 65000 >650008000
(X) 40004000 10001000 >40001000 4000 n.d.
"-" показывает, что данный штамм не содержит гена NadA;
(X) представлял собой комбинацию белка 287 с пузырьками наружной мембраны для сравнения;
n.d. - не определено.

При наблюдении за отдельными мышами показано, что смесь индуцировала высокие и стойкие бактерицидные титры:

гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495

Тандемные белки

Гибридные белки согласно изобретению можно представить формулой NH 2-[-X-L-]n-СООН. Когда -Х- во всех n случаях является одним и тем же основным белком (либо идентичным, либо таким же белком из разных штаммов или видов), белок называют «тандемным» белком.

Двенадцать конкретных тандемных белков:

# nX1 L1 X2L 2
12 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741MC58 -741MC58 (His)6
2 2 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G2872996 (Gly)6 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287394/98 (His)6
32 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G2872996 (Gly)6 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G2872996 (His)6
42 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287394/98 (Gly)6 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287394/98 (His)6
52 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287394/98 (Gly)6 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G2872996 (His)6
62 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G2872996 (Gly)6 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287394/98 -
7 2 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G2872996 (Gly)6 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G2872996 -
8 2 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287394/98 (Gly)6 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287394/98 -
9 2 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287394/98 (Gly)6 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G2872996 -
10 2 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741МС58 -741394/98 (His)6
11 2 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741MC58 -74190/18311 (His)6
12 2 гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G741МС58 -74195N477 (His)6

Все белки № 1- № 5 экспрессировались в растворимой форме в E.coli. Уровни экспрессии составляли от 0,24 до 0,50 мг белка на литр культуры. Тандемные белки очищали и смешивали с фосфатом алюминия в качестве адъюванта. Тандемные белки № 2, № 4 и № 5 легко адсорбировались на фосфате алюминия; адсорбция была менее полной в случае тандемных белков № 1 и № 3.

Аллельные варианты - 741

Обнаружены двадцать две полиморфные последовательности 741 (SEQ ID 1-22). Указанные последовательности и последовательность МС58 выровнены на фиг.1.

Аллельные варианты - NMB1343

С использованием ПЦР на 42 штаммах менингококков различных серогрупп ген, кодирующий белок NMB1343, обнаружен в 24/42 штаммах и отсутствует в 18/42 штаммов (таблица 1). Ген NMB1343 секвенировали для 10 штаммов NMB1343+ (таблица 1, колонка 3). Последовательность нуклеиновой кислоты (и, следовательно, аминокислотная последовательность SEQ ID NO:23; GenBank AAF41718) идентична во всех 10 штаммах.

NMB1343 также обнаружен в двух штаммах N. gonorrhoeae (F62 и SN4). Аминокислотная последовательность из гонококка представляет собой SEQ ID NO:24. Выравнивание с последовательностью менингококка:

гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495

Выравнивание соответствующих нуклеотидных последовательностей показано на фиг.2. Выравнивание показывает, что последовательность гонококков имеет 4-мерную инсерцию в 5'-области гена NMB1343, которая вызывает сдвиг рамки считывания и, как следствие, утрату 5'-остатка метионина.

Делеция доменов - 961

961 не присутствует в геномной последовательности N. meningitidis серогруппы А [81], хотя окружающие области консервативны (>90%) в серогруппах А и В. В публикациях 11 и 12 описаны полиморфные формы 961. Обнаружено, что ген присутствует в 91% штаммов серогруппы В, относящихся к гипервирулентным линиям ЕТ-5, ЕТ-37 и кластеру А4, но отсутствует во всех протестированных штаммах линии 3. Большинство протестированных штаммов серогруппы С были позитивными, хотя и не относящимися к гипервирулентным линиям. Это же справедливо и для штаммов серогруппы В с серотипами 2а и 2b. В случае серогруппы А один штамм, относящийся к подгруппе III, был позитивным, тогда как другие два штамма, относящиеся к подгруппе IV-1, были негативными. 961 отсутствовал в N. gonorrhoeae и в видах-комменсалах N. lactamica и N. cinerea.

На фиг.4 и 5 показаны домены в белке 961.

Когда якорная область (домен 9) («961cL») в белке 961 делегирована и белок экспрессирован в Е.coli, он экспортируется в периплазму и секретируется в надосадок культуры.

Чтобы исследовать данный белок далее, конструировали делеционные мутанты в С-концевой области 961 (961cL-гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 aro, 961cL-гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 cc, 961aL, 961aL-гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 1, 961aL-гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 2, 961aL-гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 3) на основе структурных параметров (делеции ароматических остатков в случаях мутанта 961с-гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 aro и областей двойной спирали в других случаях). Мутанты анализировали в отношении экспрессии и секреции в периплазму и надосадок культуры. Во всех случаях указанных делеционных мутантов белок продуцируется в большом количестве, присутствует в периплазматической фракции и высвобождается в надосадок культуры.

гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287 - перекрестная бактерицидная активность между штаммами

Клонировали 287 для пяти различных штаммов N. meningitidis серогруппы В и подвергали манипуляциям, чтобы делегировать N-конец вплоть до конца полиглициновой области и ввести С-концевую his-метку. Получили пять белков гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 G287. К белкам добавляли адъювант FCA и использовали для стимулирования образования иммунных сывороток у мышей, которые затем тестировали в отношении бактерицидной активности против всех пяти штаммов серогруппы В, а также против штаммов серогруппы А и С. Получали следующие бактерицидные титры:

Белок, штамм Сыворотка, тестированная в отношении бактерицидной активности штамма*
2996BZ232 МС581000 394/98F6124 BZ133
299616000 1284096 40961024 800016000
BZ232 >8000256 2048 80002048 160008000
МС58 >800064 >8000 80002048 80008000
1000 >800064 4096 80001024 1600016000
394/98 >16000 12816000 >2048>16000 - -
* титры против гомологичного штамма показаны жирным шрифтом

Рефолдинг

Чтобы повысить уровни растворимого белка для некоторых гибридных белков, выбрали альтернативные протоколы рефолдинга по сравнению с протоколами, описанными в публикации 2.

Внутриклеточные тельца (IB) выделяли следующим образом:

1. Гомогенизировали клетки (5 г сырой массы) в 25 мл 0,1 М Трис-HCl, рН 7, 1 мМ EDTA при 4°С, используя гомогенизатор Ultraturrax (10000 об/мин).

2. Добавляли 1,5 мг лизоцима на грамм клеток, быстро перемешивали с помощью Ultraturrax и инкубировали при 4°С в течение 30 мин.

3. Использовали обработку ультразвуком или гомогенизацию при высоком давлении (Френч-пресс), чтобы разрушить клетки.

4. Чтобы расщепить ДНК, добавляли MgCl 2 до конечной концентрации 3 мМ и ДНКазу до конечной концентрации 10 мкг/мл и инкубировали в течение 30 мин при 25°С.

5. К раствору добавляли 0,5 об. 60 мМ EDTA, 6% Тритона X-100, 1,5М NaCl, pH 7 и инкубировали в течение 30 мин при 4°С.

6. Осаждали внутриклеточные тельца центрифугированием при 31000×g (20000 об/мин) в течение 10 мин, 4°С.

7. Ресуспендировали осадок в 40 мл 0,1 М Трис-HCl, pH 7, 20 мМ EDTA, используя Ultraturrax.

8. Повторяли стадию центрифугирования 6.

9. Осадок внутриклеточных телец можно было использовать или хранить в замороженном виде при -20°С.

Гибридные белки экспрессировали в Е.coli следующим образом:

Белок Объем культуры (литры) Объем колбы (литры) Температура (°C) Конечная OD600 Выход внутриклеточных телец (мас./мас.)
ORF46.3-961-His 12 371,51 33,2%
ORF46.1-961 c-His1 237 1,628,3%
961c.ORF46.1 His 1 237 1,1823,5%
orf46.1-741 His 5 537 12,4235,2

Осадки растворяли, подвергали рефолдингу, ультрафильтровали, диализовали и затем белок очищали:

ORF46.1-961-His. IB растворяли следующим образом: белки IB ресуспендировали в 4 мл буфера, содержащего 6 М гуанидин-HCl, 1 мМ EDTA, pH 8,5, до конечной концентрации белка 1 мг/мл. Чтобы подвергнуть белок рефолдингу, 2 мл растворенного белка разбавляли в 400 мл буфера для рефолдинга (0,1 М Трис-HCl, 1 М L-аргинин, 2 мМ EDTA, pH 8,2) и инкубировали в течение 1 часа при 15°С, получая в результате концентрацию белка 5 мкг/мл. Затем добавляли другие 2 мл растворенного белка и инкубировали еще в течение часа при такой же температуре, получая в результате конечную концентрацию белка 10 мкг/мл. Продукт подвергали ультрафильтрации, используя ячейку для ультрафильтрации Amicon на 300 мл (8400), используя давление 3 бара на мембране Amicon с отсечением 30 кД (YM30), получая в результате конечный объем 130 мл. Продукт, полученный после ультрафильтрации, диализовали, используя мембрану из регенерированной целлюлозы в форме трубки с отсечением 12-14 кД (Cellusep - Step bio), в течение 24 часов против 10 л 0,1 М буфера Трис-HCl, pH 8,2. Выполняли второй диализ в течение 24 час против 10 л буфера, содержащего 300 мМ NaCl, 50 мМ фосфат натрия, pH 8,0. Отдиализованный продукт центрифугировали при 22000 об/мин в течение 45 минут при 4°С в центрифужном роторе Beckman JA25.5. Надосадок, выделенный после центрифугирования, использовали для очистки на основе His-метки.

orf46.1-961c-His. IB растворяли следующим образом: белки IB ресуспендировали в 4 мл буфера, содержащего 6 М гуанидин-HCl, 1 мМ EDTA, pH 8,5, до конечной концентрации белка 1 мг/мл. Чтобы подвергнуть белок рефолдингу, 2 мл растворенного белка разбавляли в 400 мл буфера для рефолдинга (0,5 М Трис-HCl, 1 М L-аргинин, 2 мМ EDTA, pH 8,2) и инкубировали в течение 1 часа при 15°С, получая в результате концентрацию белка 5 мкг/мл. Затем добавляли другие 2 мл растворенного белка и инкубировали еще в течение часа при такой же температуре, получая конечную концентрацию белка 10 мкг/мл. Продукт подвергали ультрафильтрации, используя ячейку для ультрафильтрации Amicon на 300 мл (8400), используя давление 3 бара на мембране Amicon с отсечением 30 кД (YM30), получая в результате конечный объем 150 мл. Продукт, полученный после ультрафильтрации, диализовали, используя мембрану из регенерированной целлюлозы в форме трубки с отсечением 12-14 кД (Cellusep - Step bio), в течение 24 часов против 10 л 0,1 М буфера Трис-HCl, рН 8,2. Выполняли второй диализ в течение 24 час против 10 л буфера, содержащего 300 мМ NaCl, 50 мМ фосфат натрия, рН 8,0. Отдиализованный продукт центрифугировали при 22000 об/мин в течение 45 минут при 4°С в центрифужном роторе Beckman JA25.5. Надосадок, выделенный после центрифугирования, использовали для очистки на основе His-метки.

961c-orf46.1-His. IB растворяли следующим образом: белки IB ресуспендировали в 4 мл буфера, содержащего 6 М гуанидин-HCl, 1 мМ EDTA, рН 8,5, до конечной концентрации белка 1 мг/мл. Чтобы подвергнуть белок рефолдингу, 2 мл растворенного белка разбавляли в 400 мл буфера для рефолдинга (0,1 М Трис-HCl, 0,5 М L-аргинин, 2 мМ EDTA, рН 8,2) и инкубировали в течение 1 часа при 15°С, получая концентрацию белка 5 мкг/мл. Затем добавляли другие 2 мл растворенного белка и инкубировали еще в течение часа при такой же температуре, получая в результате конечную концентрацию белка 10 мкг/мл. Продукт подвергали ультрафильтрации, используя ячейку для ультрафильтрации Amicon на 300 мл (8400), используя давление 3 бара на мембране Amicon с отсечением 30 кД (YM30), получая в результате конечный объем 150 мл. Продукт, полученный после ультрафильтрации, диализовали, используя мембрану из регенерированной целлюлозы в форме трубки с отсечением 12-14 кД (Cellusep - Step bio), в течение 24 часов против 10 л 0,1 М буфера Трис-HCl, рН 8,2. Выполняли второй диализ в течение 24 час против 10 л буфера, содержащего 300 мМ NaCl, 50 мМ фосфат натрия, рН 8,0. Отдиализованный продукт центрифугировали при 22000 об/мин в течение 45 минут при 4°С в центрифужном роторе Beckman JA25.5. Надосадок, выделенный после центрифугирования, использовали для очистки на основе His-метки.

orf46.1-741-His. IB растворяли следующим образом: белки IB ресуспендировали в 4 мл буфера, содержащего 6 М гуанидин-HCl, 1 мМ EDTA, рН 8,5, до конечной концентрации белка 10 мг/мл. Чтобы подвергнуть белок рефолдингу, 2 мл растворенного белка разбавляли в 400 мл буфера для рефолдинга (0,5 М Трис-HCl, 0,7 М L-аргинин, 2 мМ EDTA, рН 7,2) и инкубировали в течение 1 часа при 15°С, получая в результате концентрацию белка 50 мкг/мл. Затем добавляли другие 2 мл растворенного белка и инкубировали еще в течение часа при такой же температуре, получая в результате конечную концентрацию белка 100 мкг/мл. Продукт подвергали ультрафильтрации, используя ячейку для ультрафильтрации Amicon на 300 мл (8400), используя давление 3 бара на мембране Amicon с отсечением 30 кД (YM30), получая в результате конечный объем 120 мл. Продукт, полученный после ультрафильтрации, диализовали, используя мембрану из регенерированной целлюлозы в форме трубки с отсечением 12-14 кД (Cellusep - Step bio), в течение 24 часов против 10 л 0,1 М буфера Трис-HCl, рН 8,2. Выполняли второй диализ в течение 24 час против 10 л буфера, содержащего 300 мМ NaCl, 50 мМ фосфат натрия, рН 8,0. Отдиализованный продукт центрифугировали при 22000 об/мин в течение 45 минут при 4°С в центрифужном роторе Beckman JA25.5. Надосадок, выделенный после центрифугирования, использовали для очистки на основе His-метки.

При сравнении с белками, очищенными, как описано в публикации 2, получили следующие титры в бактерицидном анализе:

Белок Публикация 2 После рефолдинга
CFAГидроксид алюминия Гидроксид алюминия MF59 Фосфат алюминия
ORF46.1-961-His 81928192 32768- -
ORF46.1-961c-His 8192 128<64 8192-
961c-ORF46.1 His 32768 102416384 --
orf46.1-741 His <416 <4256 -

Сходные способы использовали в случае ORF46.1, чтобы очистить белок из IB, когда он экспрессировался без His-метки («ORF46.1K»):

Белок Объем культуры (литры) Объем колбы (литры) Температура (°С) Конечная OD600 Выход внутриклеточных телец (мас./мас.)
orf46.1K5 537 13.729.4

Белки IB ресуспендировали в 4 мл буфера, содержащего 6 М гуанидин-HCl, 1 мМ EDTA, рН 8,5, до конечной концентрации белка 10 мг/мл. Чтобы подвергнуть белок рефолдингу, 2 мл растворенного белка разбавляли в 400 мл буфера для рефолдинга (0,5 М Трис-HCl, 0,7 М L-аргинин, 2 мМ EDTA, рН 7,2) и инкубировали в течение 1 часа при 15°С, получая в результате концентрацию белка 50 мкг/мл. Затем добавляли другие 2 мл растворенного белка и инкубировали еще в течение часа при такой же температуре, получая конечную концентрацию белка 100 мкг/мл. Продукт подвергали ультрафильтрации, используя ячейку для ультрафильтрации Amicon на 300 мл (8400), используя давление 3 бара на мембране Amicon с отсечением 30 кД (YM30), получая в результате конечный объем 120 мл. Продукт, полученный после ультрафильтрации, диализовали, используя мембрану из регенерированной целлюлозы в форме трубки с отсечением 12-14 кД (Cellusep - Step bio), в течение 12 часов против 10 л буфера, содержащего 50 мМ фосфат натрия, 2 мМ EDTA, рН 7,2. Выполняли второй диализ в течение 24 час против 10 л такого же буфера. Отдиализованный продукт центрифугировали при 22000 об/мин в течение 45 минут при 4°С в центрифужном роторе Beckman JA25.5. Надосадок, выделенный после центрифугирования, использовали для катионообменной хроматографии. Очистку осуществляли в системе хроматографического анализатора АКТА (Amersham-Pharmacia Biotech), используя колонку HP с сефарозой SP HiTrap объемом 5 мл (Amersham-Pharmacia Biotech). Применяемая скорость потока составляла 1,5 мл в минуту. Колонку промывали 35 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,2. Создавали линейный градиент (0-1 М NaCl), используя 50 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,2. Белок элюировался в двух пиках при 92 мМ и 380 мМ NaCl. Фракции, составляющие каждый пик, объединяли и соответственно называли пул 1 и пул 2.

При сравнении с белками, очищенными, как описано в публикации 2, титры в бактерицидном анализе при использовании в качестве адъюванта гидроксида алюминия были повышены от <4 до 1024. Титр при использовании в качестве адъюванта фосфата алюминия с подвергнутым рефолдингу белком составлял 2048. В ELISA титры были следующими:

Белок Алюминиевый адъювант Elisa (М7)SBA (2996)
Orf46.1k (пул 1)Гидроксид 3,3 мг/мл1212 512
Фосфат 0,6 мг/мл 1541024
Orf46.1k (пул 2)Гидроксид 3,3 мг/мл1085 1024
Фосфат 0,6 мг/мл 2501024

Будет понятно, что изобретение описано только в виде примера и могут быть осуществлены модификации, сохраняя при этом объем и сущность изобретения.

Таблица 1
Штамм1343 Последовательность Классификация штамма
72/00+ гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ЕТ5 В:15:Р1.7,13,13а
30/00 +гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ЕТ5 В:15:Р1.7,16
39/99 +гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ЕТ5 С:15:Р1.7,16
95330 +гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ЕТ5 В:4:Р1.15
М4102 +гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ЕТ5 nd
МС58(21) + +ЕТ5 В:15:Р1.7,16b
BZ169(7) + +ET5 B:NT:P1.16
BZ83(19) + гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ЕТ5 В:15:-.-
CU385 ++ ЕТ5 В:4:Р1.15
2201731+ гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ЕТ5 NG:4:P1.15
64/96 ++ ЕТ5 NG:15:P1.7,16 (носитель)
2201731+ гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ЕТ5 В:4:Р1.15 (носитель)
ISS1071+ гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 nd В:15:Р1.7,16 (ЕТ5?)
BZ198(2)+ +lin. 3 В:8:Р1.1
980-2543 + +lin. 3 B:NT:P1.4
16060 ++ другой В:4:Р1.14 (носитель)
394-98+ гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 nd B:4:P1.4(lin3?)
ISS1106 + гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 nd В:4:Р1.4 (lin.3?)
BZ133(10)+ + sub I B:NT:-.-
S3446+ +nd B:14:P1.23,14
ISS1001 + +nd B:14:P1.13
2411751 + гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 другой NG:21:P1.16 (носитель)
1712741+ гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 другой NG: 15:-(носитель)
66/96+ гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 другой В:17:P 1.15 (носитель)
961-5945- гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 А4
96217 -гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 А4
312294 -гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 А4
90/18311(24) - гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ЕТ37
93/4286(25) - гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ЕТ37
M986 -гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ЕТ37
1000(5) - гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 другой
NGE28(13) - гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 другой носитель
NGH38(14) - гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 другой носитель
BZ232(18) - гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 другой
F6124(23) - гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 sub III А:-.-
C11 - гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 С:-
NMB -гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 nd
8047 -гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 nd
ISS759 -гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ndC:2b:P1.2
ISS1113 - гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 ndC:2:P1.5
65/96 -гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 nd 4:P1.14
2996(96) - гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий, патент № 2475495 nd B:2b:P1.5,2

ПУБЛИКАЦИИ

(содержание которых включено в данное описание в виде ссылки)

1 - Международная заявка на выдачу патента WO01/64 920.

2 - Международная заявка на выдачу патента WO01/64922.

3 - Международная заявка на выдачу патента W099/24578.

4 - Международная заявка на выдачу патента W099/36544.

5 - Международная заявка на выдачу патента WO99/57280.

6 - Международная заявка на выдачу патента WO00/22430.

7 - Tettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815.

8 - Международная заявка на выдачу патента WO00/66741.

9 - Международная заявка на выдачу патента WO00/71574.

10 - Международная заявка на выдачу патента WO01/04316.

11 - Международная заявка на выдачу патента PCT/IB02/03396.

12 - Comanducci et al. (2002) J Exp Med 195:1445-1454.

13 - Vaccine Design: subunit & adjuvant approach (1995) Powell & Newman (ISBN: 030644867X).

14 - Международная заявка на выдачу патента WO01/52885.

15 - Bjune et al. (1991) Lancet 338 (8775):1093-1096.

16 - Fukasawa et al. (1999) Vaccine 17:2 951-2 958.

17 - Rosenqvist et al. (1998) Dev. Biol. Stand. 92:323-333.

18 - Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698.

19 - Costantino et al. (1999) Vaccine 17:1251-1263.

20 - Международная заявка на выдачу патента PCT/IB02/03191.

21 - Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332.

22 - Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v.

23 - Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.

24 - Международная заявка на выдачу патента WO93/18150.

25 - Международная заявка на выдачу патента WO99/53310.

26 - Международная заявка на выдачу патента WO98/04702.

27 - Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188.

28 - Iwarson (1995) APMIS 103:321-326.

29 - Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 & 79-80.

30 - Hsu et al. (1999) Clin Liver Dis 3:901-915.

31 - Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349-355.

32 - Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238.

33 - Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0.

34 - Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70.

35 - Международная заявка на выдачу патента WO02/02606.

36 - Kalman et al. (1999) Nature Genetics 21:385-389.

37 - Read et al. (2000) Nucleic Acids Res 28:1397-406.

38 - Shirai et al. (2000) J. Infect. Dis. 181(Suppl 3):S524-S527.

39 - Международная заявка на выдачу патента WO99/27105.

40 - Международная заявка на выдачу патента WO00/27994.

41 - Международная заявка на выдачу патента WO00/37494.

42 - Международная заявка на выдачу патента WO99/28475.

43 - Ross et al. (2001) Vaccine 19:4135-4142.

44 - Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308.

45 - Zimmerman & Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126.

46 - Dreesen (1997) Vaccine 15 Suppl:S2-6.

47 - MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998 Jan 16; 47(1):12, 19.

48 - McMichael (2000) Vaccine 19 Suppl 1:S101-107.

49 - Schuchat (1999) Lancet 353(9146):51-6.

50 - WO02/34771.

51 - Dale (1999) Infect Dis Clin North Am 13:227-43, viii.

52 - Ferretti et al. (2001) PNAS USA 98: 4658-4663.

53 - Kuroda et al. (2001) Lancet 357(9264):1225-1240; see also pages 1218-1219.

54 - Ramsay et al. (2001) Lancet 357 (9251):95-196.

55 - Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28-36.

56 - Buttery & Moxon (2000) J R Coll Physicians Lond 34:163-168.

57 - Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-133, vii.

58 - Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567.

59 - Европейский патент 0477508.

60 - Патент США 5306492.

61 - Международная заявка на выдачу патента WO 98/42721.

62 - Conjugate Vaccines (eds. Cruse et al.) ISBN 3805549326, particularly vol. 10:48-114.

63 - Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques ISBN: 0123423368 or 012342335X.

64 - Европейская заявка на выдачу патента 0372501.

65 - Европейская заявка на выдачу патента 0378881.

66 - Европейская заявка на выдачу патента 0427347.

67 - Международная заявка на выдачу патента WO 93/17712.

68 - Международная заявка на выдачу патента WO 98/58668.

69 - Европейская заявка на выдачу патента 0471177.

70 - Международная заявка на выдачу патента WO 00/56360.

71 - Международная заявка на выдачу патента WO 00/61761.

72 - Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271-283.

73 - Donnelly et al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648.

74 - Scott-Taylor & Dalgleish (2000) Expert Opin Investig Drugs 9:471-480.

75 - Apostolopoulos & Plebanski (2000) Curr Opin Mol Ther 2:441-447.

76 - Ilan (1999) Curr Opin Mol Ther 1:116-120.

77 - Dubensky et al. (2000) Mol Med 6:723-732.

78 - Robinson & Pertmer (2000) Adv Virus Res 55:1-74.

79 - Donnelly et al. (2000) Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 2):S 190-193.

80 - Davis (1999) Mt. Sinai J. Med. 66:84-90.

81 - Parkhill et al. (2000) Nature 404:502-506.

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2475495

patent-2475495.pdf

Класс C07K14/22 из Neisseriaceae (F), например Acinetobacter

нейссериальные вакцинные композиции, содержащие комбинацию антигенов -  патент 2494758 (10.10.2013)
менингококковые полипептиды fhbp -  патент 2475496 (20.02.2013)
полипептиды из neisseria meningitidis -  патент 2450019 (10.05.2012)
химерные, гибридные и тандемные полипептиды менингококкового белка nmb1870 -  патент 2431671 (20.10.2011)
вакцинная композиция, содержащая трансферрин-связывающий белок и hsf из грамотрицательных бактерий -  патент 2359696 (27.06.2009)
антигены нейссерий -  патент 2347813 (27.02.2009)
антигены neisseria meningitidis -  патент 2343159 (10.01.2009)
гибридная и тандемная экспрессия белков нейссерий -  патент 2339646 (27.11.2008)
белок nmb1125 и его применение в фармацевтических композициях -  патент 2336900 (27.10.2008)
белок nmb0928 и его применение в фармацевтических композициях -  патент 2335505 (10.10.2008)

Класс C12N15/62 ДНК последовательности, кодирующие белки при слиянии

дисплей на поверхности клеток полипептидных изоформ на основе прочитывания терминирующего кодона -  патент 2528858 (20.09.2014)
модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)
слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк -  патент 2528251 (10.09.2014)
искусственный ген mel-tci-a0201, кодирующий полиэпитопный белок-иммуноген mel-tci-a0201, рекомбинантная плазмидная днк pmel-tci-a0201, обеспечивающая экспрессию искусственного гена mel-tci-a0201 и искусственный белок-иммуноген mel-tci-a0201, содержащий множественные ctl- и th-эпитопы антигенов меланомы -  патент 2522830 (20.07.2014)
рекомбинантная днк, кодирующая гибридный белок эпидермального фактора роста человека слитого последовательностью глутатион-s-трансферазы (gst-hegf) и рекомбинантная плазмида pas007, обеспечивающая синтез gst-hegf в клетках escherichia coli -  патент 2521515 (27.06.2014)
рекомбинантная плазмидная днк pg1-rm7, обеспечивающая синтез гибридного белка g1-rm7, и гибридный белок, связывающий фактор некроза опухолей и обладающий биолюминесцентной активностью -  патент 2513686 (20.04.2014)
мутеины кислотной зоны внеклеточного домена рецептора фактора роста фибробластов -  патент 2509774 (20.03.2014)
способы скрининга с применением g-белок сопряженных рецепторов и родственных композиций -  патент 2506274 (10.02.2014)
способ синтеза белка с модифицированным профилем n-гликозилирования в растениях -  патент 2499053 (20.11.2013)
полинуклеотидная последовательность, кодирующая сконструированный белок пертактин, вектор, включающий такую последовательность, и вакцинные композиции, содержащие белок пертактина или вектор -  патент 2499046 (20.11.2013)

Класс A61K38/16 пептиды, содержащие более 20 аминокислот; гастрины; соматостатины; меланотропины; их производные

средство для лечения аутоиммунных заболеваний -  патент 2528337 (10.09.2014)
антибактериальный пептид хоминин klp-1 широкого спектра действия -  патент 2528055 (10.09.2014)
композиции для доставки белков и методы их применения -  патент 2526904 (27.08.2014)
оксинтомодулин человека, его применение, лекарственный препарат на его основе и способ применения препарата для лечения и профилактики гипергликемии -  патент 2524204 (27.07.2014)
композиции клеток и способы их применения для лечения сердечной ткани -  патент 2519762 (20.06.2014)
мутеины липокалина слезной жидкости, обладающие аффинностью к с-мет рецепторной тирозинкиназе человека и способы их получения -  патент 2515063 (10.05.2014)
способ использования рибонуклеазы bacillus intermedius -  патент 2509801 (20.03.2014)
биологические материалы и их применение -  патент 2508296 (27.02.2014)
лантибиотические карбоксиамидные производные с усиленной антибактериальной активностью -  патент 2506272 (10.02.2014)
остеогенный биорезорбируемый материал для замещения костных дефектов и способ его получения -  патент 2504405 (20.01.2014)

Класс A61P31/04 антибактериальные средства

способ получения алкилбензилдиметиламмонийфторидов, обладающих противовирусным и антибактериальным действием -  патент 2529790 (27.09.2014)
вакцины на основе солюбилизированных и комбинированных капсулярных полисахаридов -  патент 2528066 (10.09.2014)
производные 5-гидроксиметилоксазолидин-2-она для лечения бактериальных кишечных заболеваний -  патент 2527769 (10.09.2014)
способ комплексного лечения некротического энтероколита у новорожденных и детей младшего грудного возраста -  патент 2527348 (27.08.2014)
композиции карбонатных соединений, препятствующих образованию биопленки, для использования при уходе за полостью рта -  патент 2526912 (27.08.2014)
способ получения комплексного антибактериального иммуномодулирующего препарата -  патент 2526184 (20.08.2014)
антибактериальные соединения -  патент 2525915 (20.08.2014)
производные 5-амино-2-(1-гидроксиэтил)тетрагидропирана -  патент 2525541 (20.08.2014)
композиции и способы лечения, включающие цефтаролин -  патент 2524665 (27.07.2014)
антимикробные/антибактериальные медицинские устройства, покрытые традиционными средствами китайской медицины -  патент 2524635 (27.07.2014)
Наверх