способ прогнозирования степени тяжести гипоксического перинатального поражения цнс у новорожденных

Формула изобретения

Способ прогнозирования степени тяжести перинатального гипоксического поражения центральной нервной системы у новорожденных путем изучения биохимического анализа плазмы крови, отличающийся тем, что в плазме пуповинной крови определяют уровень пероксинитрита и при его значениях 133,6-258 нмоль/л прогнозируют среднюю степень тяжести поражения ЦНС, а при 259 нмоль/л и выше - тяжелую степень.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и найдет применение в клинической практике для раннего и своевременного выявления патологии ЦНС у новорожденного.

В последние годы отечественными и зарубежными исследователями уделяется большое внимание изучению состояния здоровья детей, перенесших перинатальное поражение ЦНС (М.М.Ожегов, Н.В.Зайцева, 2006; В.П.Чехонин и соавт., 2006; Р. Delgad et al., 2006). По данным современной литературы до 72% новорожденных, перенесших гипоксию-ишемию в перинатальном периоде, имеют неврологическое поражение мозга различной степени тяжести, при этом у 25% формируются устойчивые расстройства в виде задержки умственного и двигательного развития, детского церебрального паралича, эпилепсии и других состояний с последующей инвалидностью с детства (С.В.Лебедева и соавт., 2009). Чрезвычайно важное значение приобретает ранняя диагностика перинатального поражения центральной нервной системы, степени его тяжести, особенно в первые 72 часа жизни после рождения ребенка, когда существует "терапевтическое окно". Именно в этот период назначение адекватной патогенетической терапии имеет наибольший эффект для восстановления функций поврежденных нейронов головного мозга. В типичных ситуациях и при выраженных клинических проявлениях постановка диагноза не вызывает затруднений. Но при менее выраженной клинике необходимо дифференцировать адаптационные состояния со стороны нервной системы, носящие транзиторный характер, от проявлений заболевания. В этой связи наиболее информативны биохимические показатели, так как их изменения появляются раньше клинических симптомов, что позволяет избежать как гипо-, так и гипердиагностики.

Существующие в настоящее время методы диагностики и терапии перинатального поражения ЦНС не позволили существенно снизить частоту заболевания. В связи с этим актуальной и важнейшей задачей неонатологии, неврологии детского возраста и педиатрии в целом является поиск новых информативных методов ранней диагностики, углубленного изучения механизмов формирования перинатального поражения ЦНС и их последствий, разработка дифференцированных методов патогенетической терапии.

Поэтому проблема создания достаточно простого способа, доступного для широкого круга лечебных учреждений остается актуальной.

Существует метод оценки поражения ЦНС при церебральном детском параличе с использованием электроэнцефалографического исследования (ЭЭГ), компьютерной томографии (КТ) или магнитно-резонансной томографии (МРТ) (Милованова О.А. и соавт., Семиотика эпилептических приступов у пациентов с симптоматической эпилепсией, страдающих детским церебральным параличом // IX Российский конгресс. Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии. Материалы конгресса, Москва // 19-21 октября 2010, с.159-160.).

К недостаткам этих исследований следует отнести то, что только комплексное применение ЭЭГ, КТ и МРТ позволяет отдифференцировать характер поражения ЦНС и характер приступов, в частности сложные фокальные с вторичной генерализацией. Кроме того, описанный метод имеет крайне ограниченную область использования.

Известен способ диагностики перинатального поражения ЦНС по уровню интерлейкинов-1 , 2, 6 (ИЛ-1 , ИЛ-2, ИЛ-6) и фактора некроза опухоли (ФНО). Высокое содержание последних может являться прогностическим критерием по развитию неврологических нарушений в раннем неонатальном периоде (Александрова Ю.Н. Цитокиновый статус у новорожденных детей различного гестационного возраста с различными поражениями ЦНС // IX Российский конгресс. Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии. Материалы конгресса, Москва // 19-21 октября 2010, с.177.).

Недостатком описанного способа является, прежде всего, отсутствие специфичности. Увеличение провоспалительных цитокинов наблюдается при воспалении, имеющем место при самых различных патологиях.

Предложенный способ диагностики перинатального поражения ЦНС по содержанию белка S-100 (Афонин А.А. и соавт. Уровень белка S-100 в сыворотке крови новорожденных из группы риска - показатель доклинической диагностики перинатального гипоксически-ишемического поражения ЦНС // IX Российский конгресс. Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии. Материалы конгресса, Москва // 19-21 октября 2010, с.178-179.) позволяет определить поражение ЦНС, но не дает возможности выявить этиологию развившегося осложнения у новорожденного, в частности воздействие гипоксического фактора, при котором существует иной подход к лечению данной патологии. Последнее следует отнести к недостаткам данного метода.

Известен способ оценки структурно-метаболических нарушений ЦНС тяжелой степени у новорожденных по комплексу используемых методов: кариометрии, определения активности нейроспецифической енолазы (НСЕ), сукцинатдегидрогеназы (СДГ), альфа-глицерофосфатдегидрогеназы ( -ГФДГ) (Ковтун О.П. и соавт. Структурно-метаболические нарушения и их диагностическое значение у доношенных новорожденных с гипоксически-ишемическим поражением центральной нервной системы тяжелой степени // IX Российский конгресс. Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии. Материалы конгресса, Москва // 19-21 октября 2010, с.190.).

К недостаткам этого способа следует отнести использование значительного количества показателей, которые требуют больших затрат, а также выполнение их не только в сыворотке крови новорожденных, но и в ликворе, что предоставляет большую опасность травматизации ребенка.

Известен способ диагностики поражения мозга плода по выявлению внутрижелудочковых кровоизлияний у недоношенных новорожденных детей по нейросонографии (НСГ) в сочетании с допплеровским исследованием сосудов головного мозга (Науменко Е.И. Диагностика внутрижелудочковых кровоизлияний у недоношенных новорожденных // IX Российский конгресс. Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии. Материалы конгресса, Москва // 19-21 октября 2010, с.203.).

К недостаткам способа следует отнести отсутствие возможности в каждом роддоме иметь высококвалифицированного специалиста по нейросонографии и допплерометрии, так как проведение этих исследований необходимо сразу после рождения ребенка. Авторы указывают на роль гипоксического фактора в развитии внутрижелудочковых кровоизлияний, хотя подтверждение действия данного фактора не аргументировано.

Известен способ оценки неврологических нарушений у новорожденных с церебральной гипоксией-ишемией различной степени тяжести по уровню нейротрофического фактора (BDNF) в сыворотке крови новорожденного (Созаева Д.И., Бережанская С.Б. Уровень нейротрофического обеспечения у новорожденных с церебральной ишемией // IX Российский конгресс. Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии. Материалы конгресса, Москва // 19-21 октября 2010, с.209.).

К недостаткам метода, прежде всего, следует отнести отсутствие специфичности изменений содержания BDNF при гипоксически-ишемическом поражении мозга. Снижение уровня данного полипептида имеет место при всех нейродегенеративных поражениях мозга (М.М.Одинак, Н.В.Цыган. Факторы роста нервной ткани в центральной нервной системе. "Наука", СПб, 2005, с.157.). В то же время динамика BDNF не позволяет диагностировать наличие гипоксического фактора, обусловливающего прогрессирование потери церебральной активности.

Прототипом изобретения выбран способ определения нейронспецифической енолазы (НСЕ) в качестве маркера повреждения клеточных мембран нейронов головного мозга. Она содержится в цитоплазме и дендритах нейронов и нейроэндокринных клетках (М.И.Баканов и соавт., 2003; С. Dunker et al., 2001; A. Rodrngues-Nucer et al., 2001; R.P.Berger et al., 2002; M. Tiainen et al., 2003; M.T.Wunderlich et al., 2004; С.Edward et al., 2005). Значительный выход данного фермента через поврежденные плазматические мембраны клеток мозга при перинатальных поражениях ЦНС свидетельствует о глубине и интенсивности структурно-функциональных и деструктивных нарушений цитомембран мозга. Однако этот фермент не является специфичным для поражения именно нервной ткани и чаще всего используется в онкологии для диагностики повреждения легких у взрослых. Кроме того, к недостаткам данного метода можно отнести необходимость приобретения дорогостоящих иммуноферментных тест-систем и соответствующего оборудования для выполнения исследования.

Задачей изобретения является разработка высокочувствительного биохимического метода прогнозирования гипоксических перинатальных повреждений ЦНС у новорожденных.

Поставленная задача решается тем, что в сыворотке крови пуповины у новорожденных детей спектрофотометрическим методом определяют концентрацию пероксинитрита, если его величина составит 133,6-258,0 нмоль/л, прогнозируют среднюю степень тяжести гипоксического поражения ЦНС, а при 259,0 нмоль/л и выше - тяжелую степень.

Новый технический результат, получаемый в результате использования изобретения, состоит в том, что получена возможность быстро и с высокой точностью прогнозировать степень тяжести перинатального поражения ЦНС и своевременно назначить патогенетическую терапию.

Следует отметить, что перинатальное поражение ЦНС у новорожденных в абсолютном большинстве обусловлено внутриутробной гипоксией. Также известно, что в результате снижения кислородного снабжения мозга, наблюдаемого при перинатальном его поражении, имеет место чрезмерная продукция одного из мощных свободных радикалов оксида азота (NО), в результате чего образуется пероксинитрит (ONOO^-). Последний проявляет сильные оксидантные свойства: инициирует перекисное окисление липидов, повреждение цепей ДНК, инактивацию ферментов, окисляет сульфгидрильные группы. К одному из существенных отрицательных действий пероксинитрита относят снижение сродства гемоглобина к кислороду, следствием чего является гипоксия (И.И.Степуро и соавт., 1997). Высокоактивный пероксинитрит способен разрушать клеточные структуры и вызывать апоптоз (И.С.Сидорова, Е.И.Боровкова и соавт., 2007; Т.А.Пушкарева и соавт., 2008). Кроме того, нарушение нормальной энергопродукции клеток и накопление пероксинитрита стимулирует возникновение "агрессивных форм" кислорода, способствуя развитию оксидативного стресса, что приводит в итоге к повреждению и гибели клеток.

Вышеизложенное позволяет оценить значение повышенного образования пероксинитрита в развитии кислородного дефицита, т.е. его специфическую роль в данном процессе.

Поскольку по нашим данным (Н.А.Друккер и соавт., Роль пероксинитрита в патогенезе гестоза // Материалы IV съезда акушеров-гинекологов России, Москва, 2008, с.79.) пероксинитрит играет существенную роль в поражении мозга, то изучение его продукции у детей при различных клинических проявлениях позволяет использовать этот показатель для объективной характеристики степени перинатального поражения ЦНС. При этом для определения пероксинитрита требуется до 1 часа, в связи с чем предложенный способ обеспечивает быструю диагностику данной патологии.

Подробное описание метода

У новорожденного ребенка после первого вдоха осуществляют забор 2 мл пуповинной крови. Крови позволяли свернуться в пробирке, оставляя ее на 30 минут. Затем центрифугировали в течение 15 минут при 1000×g.

В плазме крови определяем содержание белка, для чего в 0,02 мл плазмы добавляем 5 мл физраствора (т.е. разводим плазму в 250 раз). Полученный раствор колориметрируем на спектрофотометре при длине волны 280 нм против физраствора. Концентрацию белка рассчитываем по формуле (С_белка=Е×250 мг/мл, где Е - экстикция, 250 - фактор разведения).

На следующем этапе плазму разводим из расчета 1 мг белка в 1 мл плазмы, для чего в 7,1 мл физраствора добавляем 0,1 мл плазмы (т.е. разведение должно достигать 71-кратной величины).

Колориметрируем на спектрофотометре против физраствора при 302 нм. Расчет концентрации пероксинитрита (ONOO^-) производят по формуле

с= ×10³/l,68 нмоль/мг белка.

Расчет осуществляют с использованием молярных коэффициентов экстикции (И.И.Лобышева и соавт., 1999).

Если его концентрация пероксинитрита составит 133,6-258,0 нмоль/л, прогнозируют среднюю степень тяжести гипоксического поражения ЦНС, а при 259,0 нмоль/л и выше - тяжелую степень.

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример № 1: новорожденный женского пола, массой 3800 г, длиной 54 см, оценка по шкале Апгар на 1 минуте - 8 баллов, на 5 минуте - 9 баллов, врачом-неонатологом состояние расценено как удовлетворительное, во время осмотра клинических признаков патологии ЦНС не выявлено. При проведении нейросонографического исследования структурных изменений головного мозга, нарушений ликвородинамики не выявлено. Период новорожденности протекал без осложнений, к груди приложен на 1-е сутки, на 5-е выписан домой. В сыворотке крови, полученной из пуповины, содержание пероксинитрита составило 133 нмоль/л. Что позволило прогнозировать отсутствие гипоксического перинатального поражения ЦНС. Осмотр ребенка в возрасте 1 месяца жизни не выявил отклонений в неврологическом статусе. Малыш реагировал на осмотр комплексом оживления, мышечный тонус и сухожильные рефлексы соответствовали норме, поддерживал зрительный и эмоциональный контакт. Все вышеперечисленное позволило оценить его состояние как "здоров". Данный пример позволяет с помощью разработанного нами способа с высокой точностью осуществить прогноз: отсутствие гипоксического перинатального поражения ЦНС.

Пример № 2: новорожденный женского пола, массой 3650 г, длиной 51 см, оценка по шкале Апгар на 1 минуте - 8 баллов, на 5 минуте - 9 баллов, состояние врачом-неонатологом расценено как удовлетворительное, во время осмотра клинических признаков патологии ЦНС не установлено. Уровень плазменной концентрации пероксинитрита в крови пуповины соответствовал 133,6 нмоль/л, что позволяло прогнозировать среднюю тяжесть перинатального повреждения ЦНС. На 3 сутки состояние ребенка ухудшилось, у него отмечались некоторое беспокойство, срыгивания, тремор конечностей в покое и при плаче, что определило перевод в отделение патологии новорожденных. Степень выраженности клинических признаков поражения ЦНС соответствует средней степени тяжести. По данным нейросонографического исследования головного мозга имелись изменения гипоксически-ишемического характера. Проводилась посиндромальная терапия. На 21 сутки выписан домой. Данный пример позволяет прогнозировать перинатальное гипоксическое повреждение ЦНС средней тяжести.

Пример № 3: новорожденный мужского пола, массой 3350 г, длиной 52 см, оценка по шкале Апгар на 1 минуте - 8 баллов, на 5 минуте - 8 баллов, состояние врачом-неонатологом расценено как удовлетворительное, во время осмотра клинических признаков патологии ЦНС не установлено. Уровень плазменной концентрации пероксинитрита в крови пуповины соответствовал 258 нмоль/л, что позволяло прогнозировать среднюю тяжесть перинатального повреждения ЦНС. На 2 сутки состояние ребенка ухудшилось, у него отмечались выраженное беспокойство, тремор конечностей, гипертонус конечностей, что определило перевод в отделение патологии новорожденных. Степень выраженности клинических признаков поражения ЦНС соответствует средней степени тяжести. По данным нейросонографического исследования головного мозга имелись изменения гипоксически-ишемического характера. Проводилась посиндромальная терапия. На 27 сутки выписан домой. Данный пример позволяет прогнозировать перинатальное гипоксическое повреждение ЦНС средней тяжести.

Пример № 4: новорожденный мужского пола, массой 3050 г, длиной 50 см, оценка по шкале Апгар на 1 минуте - 7 баллов, на 5 минуте - 8 баллов, состояние врачом-неонатологом расценено как удовлетворительное, во время осмотра клинических признаков патологии ЦНС не установлено. Уровень пероксинитрита в плазме крови пуповины составил 259,0 нмоль/л. К концу первых суток состояние ухудшилось. Отмечалось беспокойство, частые вздрагивания, однократный приступ тонико-клонических судорог. На 2 сутки у ребенка снизилась двигательная активность, появилась мышечная гипотония, рефлексы новорожденного вызывались, но быстро угасали. В тяжелом состоянии переведен в отделение патологии новорожденных. По данным нейросонографического исследования головного мозга имелись выраженные гипоксически-ишемические изменения. Проводилась посиндромальная терапия. Выписан на 29 сутки. Данный пример позволяет прогнозировать гипоксически-ишемическое перинатальное поражение ЦНС тяжелой степени.

Предлагаемым способом было обследовано 30 доношенных новорожденных с перинатальным поражением ЦНС, переведенных из родильного стационара на лечение в отделение патологии новорожденных, и 10 здоровых новорожденных детей. У 18 детей плазменный уровень пероксинитрита в крови пуповины был в пределах 133,6-258 нмоль/л, что соответствовало средней степени тяжести поражения ЦНС. У 12 новорожденных плазменный уровень пероксинитрита был 259 нмоль/л и выше. У данных пациентов диагностирована тяжелая степень поражения ЦНС.

У всех здоровых новорожденных плазменный уровень пероксинитрита был ниже 133,6 нмоль/л.

Таким образом, исследование плазменного уровня пероксинитрита в крови пуповины у детей позволяет прогнозировать уже при рождении вероятность гипоксического перинатального поражения ЦНС. Точность заявляемого способа составляет 73%. Чувствительность - 71,4%, специфичность - 75%.

Исходя из вышеизложенного заявляемый способ прогнозирования гипоксического перинатального поражения ЦНС по сравнению с существующими методами имеет следующие преимущества.

1. Способ позволяет с высокой точностью прогнозировать перинатальное гипоксическое поражение ЦНС у новорожденных уже на этапе родильного дома (в первые часы жизни), когда клиническая симптоматика зачастую отсутствует, это позволяет своевременно назначить патогенетическую терапию.

2. Способ относится к экспресс-диагностике (время выполнения менее 1 часа).

3. Предлагаемый способ не требует применения дорогостоящих расходных материалов и оборудования.

4. Предлагаемый способ обладает высокой точностью и найдет широкое применение не только в отделениях неонатологического профиля, но и в других педиатрических стационарах.