фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний

Формула изобретения

Фармацевтическая композиция для лечения злокачественных опухолевых заболеваний на основе дихлорацетата натрия, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит теофиллин, при этом отношение дихлорацетата натрия к теофиллину составляет от 1:1 до 10:1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и касается лекарственного средства, предназначенного для лечения различных форм онкологических заболеваний.

Известно, что ранний канцерогенез происходит в гипоксическом микроокружении, при этом метаболизм клеток при опухолевой трансформации, переключаются на анаэробный гликолиз (1). При этом индуцируется фактор HIF (Hypoxia-inducible factor), который, в свою очередь, вызывает индукцию экспрессии нескольких видов транспортеров глюкозы и большинства ферментов гликолиза (2). HIF индуцирует экспрессию киназы пируватдегидрогеназы (PDK) (3). Лактоацидоз способствует опухолевому росту путем ремоделирования-деструкции внеклеточного матрикса, увеличения метастатического потенциала и подвижности клеток и активации ангиогенеза. Хотя в некоторых случаях опухоли васкуляризуются и перестают быть в значительной степени в гипоксических условиях (с возможным сохранением обедненных кислородом зон из-за недостаточности васкуляризации), выбор клетками аэробного гликолиза сохраняется. Это может свидетельствовать о том, что такое изначальное адаптивное метаболическое приспособление обеспечивает выживаемость и селекцию раковых клеток - трансформация в гликолитический фенотип способствует устойчивости к апоптозу (3, 4, 5). Митохондриальный мембранный потенциал и продукция активных форм кислорода (АФК) зависят от цепи переноса электронов (ЭТЦ), деполяризация и возрастание АФК ассоциированы с открыванием пор МТР (6) и высвобождением проапоптотических факторов, в частности, цитохрома С и апоптоз-индуцирующего фактора.

В ряде клеточных линий показана гиперполяризация митохондрий (7) по сравнению с нормальными клетками (8), в ряде других опухолевых линий, по нашим наблюдениям, возможны флуктуации уровня АФК. Снижение поступления пирувата, по-видимому, приводит к падению продукции АФК и закрытию редокс-зависимых каналов, к митохондриальной гиперполяризации и, как следствие, к устойчивости к апоптозу. Необходимо также учитывать, что апоптоз - энергозависимый активный процесс, требующий аденозин трифосфата (АТФ), в этой связи более эффективное энергообеспечение будет также способствовать апоптозу.

Наиболее близким аналогом (прототип) заявленного лекарственного средства является известный (9, 10), проходящий в настоящее время мультицентровые клинические исследования лекарственный препарат Dicloracetate Sodium (DCA) - он же дихлорацетат натрия (ДХА), который используется в качестве средства для лечения лактоацидоза и различных видов опухолевых заболеваний (11). Его противоопухолевая активность в качестве индуктора апоптоза опухолевых клеток доказана в экспериментальных работах (12, 13). Проведенные исследования (14, 15) доказывают индукцию апоптоза ДХА в глиобластоме, в клеточных культурах рака эндометрия, простаты и немел коклеточного рака легких. Кроме того, убедительно доказана способность ДХА индуцировать апоптоз в культурах клеток рака молочной железы. При этом было показано, что в культуре клеток аденокарциномы молочной железы крысы переключение гликолитического фенотипа при воздействии ДХА коррелировало с ингибированием пролиферации без какого-либо увеличения гибели клеток. Согласно опубликованным данным, положительный эффект от применения препарата у 90 больных отмечается в 67% случаев, причем в исследование включались только пациенты с метатастатическими формами рака, у которых традиционные методы терапии были неэффективны.

Известен также применяемый с 1889 года в качестве спазмолитического, бронхолитического, противоастматического, вазодилатирующего, кардиотонического, диуретического, средства препарат теофиллин (метилксантин), проявляющий эффект по активации окислительного фософорилирования и увеличению содержания АТФ (16), а также индуцирующий апоптоз опухолевых клеток, активируя его р53-зависимый механизм (12, 13).

Задача настоящего изобретения заключается в расширении ассортимента эффективных лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний.

Технический результат заключается в повышении эффективности известного лекарственного средства.

Указанный технический результат достигается за счет того, что фармацевтическая композиция для лечения злокачественных опухолевых заболеваний на основе дихлорацетата натрия дополнительно содержит теофиллин (далее - ТФ), при этом соотношение дихлорацетата натрия к теофиллину составляет от 1:1 до 10:1.

Такие диапазоны соотношений определяются колебаниями оптимальных терапевтических концентраций действующих активных компонентов. (55-110 ммоль/л для ТФ и 50-520 ммоль/л для ДХА)

Заявленное лекарственное средство (торговая марка - Теохлонал (далее - ТХ)) - представляет собой фармацевтическую композицию (гомогенизированная смесь) из двух активных фармацевтических субстанций - дихлорацетата натрия (ДХА) и теофиллина (ТФ) и, при необходимости, фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ).

Вспомогательными веществами при изготовлении лекарственных препаратов на основе заявленной композиции могут быть, например: а) в таблетках: целлюлоза микрокристаллическая, крахмал картофельный, тальк, стеариновая кислота, титана диоксид, лактоза (сахар молочный), эмульсия кэ 10-16, полисорбат-80; б) в капсулах: кукурузный крахмал, полисорбат-80 (пластификатор), краситель пищевой е 133, краситель пищевой е 17, желатин, в) в суспензии для приема внутрь: сахароза, натрия гидроксид, метилпарагидроксибензоат, этанол 96%, натрия цитрат, кислота лимонная моногидрат, ароматы фруктовые (банана, мандарина, апельсина и пр.), ванилиновая отдушка, малиновая отдушка, эфиры полигликостеариловой кислоты, метилгидроксипропилцеллюлоза, карбомер, натрия цикломат, натрия сахарин, г) в растворе для приема внутрь: лимонной кислоты моногидрат, натрия гидрофосфата дигидрат, натрия хлорид, бензалкония хлорид.

Учитывая действие ДХА, выражающееся в индукции апоптоза при увеличении внутриклеточного содержания пирувата, а также эффект теофиллина (ТФ) по активации окислительного фософорилирования и увеличению содержания АТФ, была исследована проапототическая активность Теохлонала (ТХ - комбинация ДХА и ТФ) на клеточных линиях HeLa и Jurkat, при этом особое внимание уделялось функционированию митохондрий и митохондриальному звену.

Исследования доказали, что противоопухолевая активность ДХА, проявляющаяся в индуцировании апоптоза опухолевых клеток, усиливается при добавлении ТФ, то есть совместное биологическое действие известных (ДХА и ТФ) компонентов композиции обеспечивает синергетический эффект.

Эффективность терапевтического действия композиции существенно превышает действие отдельно взятого ДХА. По данным in vitro ТХ индуцирует гибель опухолевых клеток в диапазоне концентрации 10-32 ммоль/л, в 4-1.2 раз меньшей, концентраций ДХА. Таким образом, ТХ обладает большей эффективностью и позволяет значительно уменьшать терапевтическую дозу, что способствует устранению возможных побочных эффектов (периферическая нейропатия и гепатотоксичность), что является дополнительным техническим результатом.

Кроме того, следует отметить, что по сравнению с препаратами цитостатического антиметаболитного действия (винкристином, метатрексатом) при сходной противоопухолевой активности активные субстанции (ДХА и ТФ) по отдельности, а также их композиция (ТХ) обладают значительно (в сотни раз) более низкой токсичностью (9).

Для пояснения сущности изобретения представлены следующие графические материалы:

- фиг.1 - диаграмма цитотоксичности теофиллина (ТФ), дихлорацетат (ДХА), теохлонала (ТХ). Для наглядности результаты (величины оптического поглощения формазаном) представлены в % от контроля с инверсией шкалы;

- фиг.2 - диаграмма индукции апоптоза препаратами ТФ, ДХА и ТХ;

- фиг.3 - диаграмма эффектов препаратов на линии Hela, выраженные в % от контроля. 24 ч инкубация. Ряд «ДХА и ТЕОФ» соответствует простому суммированию независимого действия ДХА и ТФ;

- фиг.4 - таблица, в которой приведена статистическая значимость различий ТХ с ТФ и ДХА.

Ниже приводятся данные исследований, подтверждающие выводы о более высокой эффективности композиции по сравнению с действием отдельных, входящих в ее состав, компонентов.

Объекты исследования: клеточные линии Т-лимфобластной лейкемии Jurkat (лимфобластоподобная), эпителиоидной карциномы шейки матки HeLa.

Режим воздействия: инкубации в течение 24 часов с дихлорацетатом (отдельно), теофилином (отдельно), теохлоналом (комбинация), индуктором апоптоза (положительным контролем).

Действующие вещества и диапазоны концентраций: теофиллин (ТФ) (0,05-13,42 мМ/л); дихлорацетат (ДХА) (0,25-64 мМ/л); теохлонал (ТХ) (соотношение ДХА и ТФ по массе 4:1).

Оценка цитотоксичности, метаболической активности производилась с использованием МТТ-теста, основанного на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в окрашенный формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Растворение формазана с помощью диметилсульфоксида (ДМСО) позволяет осуществить фотометрию и фиксировать изменение оптического поглощения раствора, коррелирующее с метаболической активностью клеточной линии. МТТ-тест является индикатором функции митохондрий в жизнеспособных клетках, нарушение метаболической функции клеток, как правило, сопряжено с последующим снижением их жизнеспособности. В соответствии с этим МТТ-тест может применяться для оценки цитотоксичности какого-либо воздействия на клетки, а также для определения пролиферативной активности.

Полученные данные (фиг.1) подтверждают наличие цитотоксических дозозависимых эффектов у каждого из трех препаратов. При этом, IС₃₅ (индекс концентрации, при которой цитотоксичность составляет 35%) 0,5 мМ/л ТХ составляет около 16 мМ/л, что в 4 раза меньше IС₃₅ (64 мМ/л) для ДХА.

Далее был проведен анализ механизма цитотоксичности - исследование индукции апоптоза указанными препаратами. Для этого клетки инкубировали с препаратами в указанном концентрационном диапазоне, отмывали и инкубировали с зондами пропидий йодид и аннексин V, после чего анализировали на проточном цитометре FACS CALIBUR.

Из полученных данных (фиг.2) следует, что:

1) В диапазонах концентраций 10-32 ммоль/л (что соответствует суточной дозе с учетом биодоступности) ТХ достоверно эффективнее индуцирует апоптоз, чем ДХА в 1,74 раза при 16 мМ/л и в 1,2 при 32 мМ/л;

2) ТХ достоверно эффективнее индуцирует апоптоз чем ТФ в 1,72 раза при 16 мМ/л и в 2,14 при 64 мМ/л.

Выводы на основании проведенных исследований:

- IС₃₅ Теохлонала в ~4 раза меньше соответствующих пороговых концентраций дихлорацетата и теофиллина.

- основным механизмом индукции клеточной гибели ТХ и ДХА следует считать индукцию апоптоза, при этом в диапазоне концентраций 10-32 мМ/л ТХ достоверно эффективнее ДХА и ТФ.

Полученные данные позволяют утверждать о наличии цитотоксического эффекта для всех трех препаратов, статистически значимыми являются действие ДХА в диапазоне концентраций 0,5-64 мМ/л (р<0,05); ТФ 0,42-13,42 мМ/л (р<0,05); ТХ 10-32 мМ/л (р<0,05). Теохлонал обладает минимальной их всех веществ IC ₇₅ 0,5 мМ/л, превосходя по своему действию ДХА (IC ₇₅ около 4 мМ/л) и теофиллин (IC₇₅ в диапазоне 1,68-3,35 мМ/л).

Кроме того, эффект теохлонала превосходит простое суммирование действия ДХА и теофиллина (см. фиг.3) различия рядов «ДХА и ТФ» и «ТХ»), т.е. компоненты теохлонала обладают синергетическим эффектом при одновременном действии. В таблице (фиг.4) приведена статистическая достоверность различия ДХА, ТФ и ТХ: различия достоверны для концентрации ДХА 0,5-16 мМ/л (р<0,05) и ТФ 0,1-1,68 мМ/л (р<0,05).

Таким образом, Теохлонал обладает специфичным механизмом индукции клеточной гибели, имеет большую эффективность по сравнению с ДХА и ТФ и позволяет значительно уменьшать терапевтическую дозу, что способствует устранению возможных побочных эффектов.

Ниже приведены конкретные примеры заявленной фармацевтической композиции, подтверждающие возможность осуществления изобретения с получением вышеуказанного технического результата, и описаны способы их получения.

Пример 1.

Таблетки 0,5 (покрытые оболочкой) при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия	49,0
- теофиллин	49,0
- вспомогательные вещества
(целлюлоза микрокристаллическая,
крахмал картофельный, тальк, стеариновая
кислота, титана диоксид, лактоза, эмульсия
кэ 10-16, полисорбат-80)	остальное

Пример 2.

Таблетки 0,5 (покрытые оболочкой) при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия	78,4
- теофиллин	19,6
- вспомогательные вещества
(целлюлоза микрокристаллическая,
крахмал картофельный, тальк;
стеариновая кислота, титана диоксид,
лактоза, эмульсия кэ 10-16, полисорбат-80)	остальное

Пример 3.

Капсулы 0.5 при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия	89,0
- теофиллин	9,0
- вспомогательные вещества
(кукурузный крахмал, полисорбат-80
(пластификатор), краситель пищевой е
133, краситель пищевой е 17, желатин)	остальное

Пример 4.

Водный раствор Теохлонала для перорального применения содержит Теохлонал в виде сухого вещества в количестве от 0,001 г/мл до 0,5 г/мл (включая лекарственную форму для детей), при этом сухое вещество содержит дихлорацетат натрия и теофиллин при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия	65,4
- теофиллин	32,6
- вспомогательные вещества
(лимонной кислоты моногидрат,
натрия гидрофосфата дигидрат,
натрия хлорид, бензалкония хлорид)	остальное

Пример 5.

Суспензия Теохлонала для перорального применения содержит Теохлонал в виде сухого вещества в количестве от 0,001 г/мл до 0,5 г /мл (включая лекарственную форму для детей), при этом сухое вещество содержит дихлорацетат натрия и теофиллин при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия	78,4
- теофиллин	19,6
- вспомогательные вещества
(эфиры полигликостеариловой кислоты,
метилгидроксипропилцеллюлоза, карбомер,
натрия цитрат, кислота лимонная моногидрат,
ванилиновая отдушка, малиновая отдушка,
натрия цикломат, натрия сахарин,
консерванты: кислота сорбиновая, натрия бензоат)	остальное

Пример 6.

Суспензия Теохлонала для перорального применения содержит Теохлонал в виде сухого вещества в количестве от 0,001 г/мл до 0,5 г/мл (включая лекарственную форму для детей), при этом сухое вещество содержит дихлорацетат натрия и теофиллин при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия	89.1
- теофиллин	8,9
- вспомогательные вещества (сахароза,
натрия гидроксид,
метилпарагидроксибензоат, этанол 96%,
карбомер, лимонная кислота, аромат банана)	остальное

Пример 7.

Раствор Теохлонала для внутримышечных и внутривенных инъекций: 1-3 мл раствора содержит 0,05 г/мл-0.25 г/мл Теохлонала в виде сухого вещества, при этом сухое вещество Теохлонала содержит дихлорацетат натрия и теофиллин при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия	50,0
- теофиллин	50,0

Пример 8.

Раствор Теохлонала для внутримышечных и внутривенных инъекций: 1-3 мл раствора содержит 0,05 г/мл-0.25 г/мл Теохлонала в виде сухого вещества, при этом сухое вещество Теохлонала содержит дихлорацетат натрия и теофиллин при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия	75,0
- теофиллин	25,0

Пример 9.

Раствор Теохлонала для внутримышечных и внутривенных инъекций:

1-3 мл раствора содержит 0,05 г/мл-0.25 г/мл Теохлонала в виде сухого вещества, при этом сухое вещество Теохлонала содержит дихлорацетат натрия и теофиллин при следующих соотношениях компонентов, вес.%:

- дихлорацетат натрия	90,9
- теофиллин	9,1

Использованная литература.