гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые средства тритерпеновой природы

Классы МПК:C07J53/00 Стероиды, в которых циклопента (а) гидрофенантреновый скелет модифицирован конденсированием с карбоциклическими кольцами или получением дополнительного кольца за счет образования непосредственной связи между двумя атомами углерода кольца
C07J63/00 Стероиды, в которых циклопента (а) гидрофенантреновый скелет модифицирован расширением только одного из колец на один или два атома
A61P35/00 Противоопухолевые средства
Автор(ы):, , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (Новосибирский государственный университет (НГУ) (RU),
Учреждение Российской академии наук Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова Сибирского отделения РАН (НИОХ СО РАН) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2010-12-20
публикация патента:

Изобретение относится к новому ряду химических соединений, а именно к гидрированной бетулоновой кислоте формулы (1) и ее амидам формулы (2-8):

class=fancy HREF="/images/patents/10/2448115/2448115-9.gif" TARGET="_blank" TITLE="8 Kb" TI="CF" HE="53" WI="67"> гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115

NR1R2=

гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115

гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115

Формула изобретения

Гидрированная бетулоновая кислота формулы (1) и ее амиды формулы (2-8)

гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115

NR1R2=

гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115

гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115

обладающие противоопухолевой активностью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новому ряду химических соединений, а именно к гидрированной бетулоновой кислоте формулы (1) и ее амидам формулы (2-8):

гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115

которые могут быть использованы в медицине в качестве лекарственных средств, обладающих противоопухолевым действием.

Современные схемы лечения различного типа злокачественных опухолей используют хирургические методы в комплексе в высокодозной агрессивной терапией, серьезным недостатком которой является высокая токсичность современных противоопухолевых препаратов в отношении жизненно-важных органов и систем организма. Сопутствующие побочные эффекты снижают эффективность, а в ряде случаев ограничивают применение противоопухолевых средств. Другой проблемой в лечении онкологических заболеваний является проблема остаточного опухолевого клона. Опухолевые клетки, пережившие химиотерапию, обычно проявляют лекарственную устойчивость к широкому кругу препаратов и вызывают рецидив заболевания в более тяжелой форме. В связи с этим актуальной задачей является поиск новых противоопухолевых препаратов, обеспечивающих высокую избирательность и эффективность лечения.

Важным направлением медицинской химии, позволяющим получать новые, эффективные противоопухолевые препараты, является использование синтетических трансформаций растительных метаболитов. Наиболее приемлемым считается исследование растительных метаболитов, о биологической активности которых имеются достоверные сведения и которые являются доступными в настоящее время или станут доступными в ближайшем будущем по мере формирования сырьевой базы. К данному классу соединений относятся тритерпеновые кислоты, широкий спектр биологической активности которых (противовоспалительная, противовирусная, противоопухолевая, иммуностимулирующая и т.д.) приковывает к ним пристальный интерес исследователей.

Задачей изобретения является создание новых эффективных, низкотоксичных лекарственных средств, обладающих противоопухолевым действием и получаемых из доступного растительного сырья.

Поставленная задача решается новыми соединениями тритерпеновой природы, а именно гидрированной бетулоновой кислотой формулы (1) и ее амидами формулы (2-8), которые могут использоваться в качестве противоопухолевых средств.

Из литературных источников известно, что производные тритерпенов, в частности, лупанового ряда перспективны как противовирусные и противоопухолевые препараты [Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А., Толстиков А.Г., Флехтер О.Б. // Биоорган. химия, 2006, 32, 291-307]. На примере производных бетулиновой кислоты показана связь структуры и противоопухолевой активности в отношении широкого спектра раковых клеток (IС50 10-6-10-9 М) [Mukherjee R., Kumar V., Srivastava S.K, Agarwal S.K., Burman A.C. // Anti-cancer agents in Medicinal Chemistry, 2006, V.6, P.271-279]. В этой же работе есть примеры того, что гидрированные аналоги зачастую показывают большую активность по сравнению с обычными производными бетулиновой кислоты. Анти-ВИЧ активность 3-O-глутарилдигидробетулина увеличивается минимум на три порядка при переходе от обычного производного бетулина [Kashiwada Y., Sekiya M., Ikeshiro Y., Fujioka Т., Kilgore N.R., Wild C.T., Allaway G.P., Lee K.-H. // Bioorgan. Med. Chem. Lett., 2004, 14, P.5851-5853]. Производные бетулоновой кислоты, содержащие фрагменты гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 -аминокислот, являются активными индукторами апоптоза в лейкозных клетках и клетках гепатокарциномы in vitro [Шинтяпина А.Б., Шульц Э.Э., Петренко Н.И., Узенкова Н.В., Толстиков Г.А., Пронкина Н.В., Кожевников B.C., Покровский А.Г. // Биоорган. химия, 2007, 33, 624]. Важной чертой амидов бетулоновой кислоты является то, что амид, например, содержащий фрагмент гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 -аланина, проявляет антиоксидантную активность и обладает способностью снижать органотоксическое действие противоопухолевых препаратов [Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. // Докл. АН, 2004, 399, с.274]. Обстоятельством, повышающим привлекательность тритерпенов, является их широкое распространение в природе и во многих случаях относительная простота технологии получения из многотоннажного растительного сырья.

Одним из соединений тритерпеновой природы с ярко выраженными физиологическими свойствами является дигидробетулоновая кислота формулы (1), которая получается окислением дигидробетулина формулы (9). Дигидробетулин формулы (9) получается гидрированием бетулина формулы (10) - широкодоступным сырьем, выделяемым из внешней коры березы семейства Betula [Krasutsky P.A. // Nat. prod. rep., 2006, 23, Р.919-942].

гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115

Для достижения поставленной цели мы провели ряд химических модификаций, представленных на схеме 1, Фиг.22. В качестве исходного соединения был взят бетулин (10), полученный экстракцией коры березы бензолом. Гидрирование бетулина (10) водородом в автоклаве над Ni-Ренея давал дигидробетулин (9), который окисляли раствором Физера. Следующим этапом было получение хлорангидрида дигидробетулоновой кислоты (1), который далее использовался без промедления. Взаимодействие хлорангидрида дигидробетулоновой кислоты (1) с двойным избытком соответствующего амина легко приводило к целевым соединениям формулы (2-8) с противоопухолевой активностью.

ИК-спектры записывали на приборе "VECTOR 22" в KBr. Удельное вращение определяли на спектрометре polAAr 3005, концентрации растворов приведены в г/100 мл. Точки плавления определяли на приборе Termosystem FP 900 фирмы Mettler Toledo и на столике Кофлера S 30 A/G (Германия).

Элементный состав полученных веществ определяли из элементного анализа и из масс-спектров высокого разрешения, записанных на приборе DFS (Double Focusing Sector) фирмы Thermo Electron Corporation.

Спектры ЯМР 1Н и 13С регистрировали на спектрометрах AV-400 (рабочие частоты 400.13 MHz для 1Н и 100.61 MHz для 13С) и DRX-500 (500.13 MHz и 125.76 MHz соответственно) фирмы Bruker для растворов веществ в СDСl 3. В качестве внутреннего стандарта использовали сигналы растворителя (гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 H 7.24 и гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 C 76.9 м.д). Строение полученных соединений устанавливали на основании анализа спектров ЯМР 1Н с привлечением спектров двойного резонанса 1Н- 1Н, а также анализа спектров ЯМР 13С с использованием стандартных методик записи спектров в режиме J-модуляции (JMOD), с внерезонансным и селективным подавлением протонов, двумерных спектров гетероядерной 13C-1H корреляции на прямых константах спин-спинового взаимодействия (С-Н COSY, 1JC,H 135 Гц) и двумерных и одномерных спектров гетероядерной 13С-1Н корреляции на дальних константах спин-спинового взаимодействия (COLOC, LRJMD, 2,3JC,H 10 Гц).

Было исследовано влияние заявляемой гидрированной бетулоновой кислоты формулы (1) и ее амидов (2-8) на жизнеспособность клеток карциномных линий человека. Значения CCID гидрированной бетулоновой кислоты (1) и ее амидов (2-8) для различных карциномных линий клеток человека приведены в таблице 1. В качестве препаратов сравнения использовали бетулоновую кислоту (БА) и ее соответствующие амиды (БА1-БА7) (Фиг.23, схема 2 Бетулоновая кислота (БА) и ее производные (БА1-БА7)).

В результате было показано, что заявляемые соединения (1-8) проявляют высокую противоопухолевую активность по отношению ко всем использованным опухолевым клеточным культурам, а именно СЕМ-13, U-937, МТ-4. Показано, что значения ССID 50 для соединений (1-8) имеют сходный порядок величины для всех опухолевых клеток и лежат в диапазоне 2.9-69.5 µM. Полученные данные по противоопухолевой активности соединений (1-8) позволяют рассматривать их как перспективные лекарственные агенты. Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение луп-20(29)-ен-3гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ,28-диола (бетулина, 10)

Измельченную кору березы (344 г) кипятят в бензоле (1.6 л) с обратным холодильником 8 ч, далее горячий раствор декантирют. В оставшуюся кору добавляют еще 1 л бензола, кипятят 1 ч, горячий раствор снова декантирют. Выпавший из бензола осадок отфильтровывают, высушивают и получают 52 г бетулина-сырца. После перекристаллизации в изопропаноле получают 38 г бетулина с т.пл. 260-262°С (лит. т.пл. 258-260°C [Hayek // Phytochem. 1989, 28, P.22.]). Выход бетулина на исходную кору составляет 11%.

Пример 2. Получение лупан-3гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ,28-диола (дигидробетулина, 9)

Гидрирование бетулина (10) проводят аналогично известной методике [Ruzicka L., Brener М., Rey Е. // Helv. Chim. Acta, 1941, 24, P.515-529]. В 5 л автоклав с мешалкой помещают 132 г бетулина (10), 13.2 г Ni-Ренея и 2.5 л этанола, далее все перемешивают в атмосфере водорода (100 атм) при 180°С в течение 14 ч. Освобождаются от катализатора горячим фильтрованием в диоксане, после отгонки растворителя получают 124 г дигидробетулина (9) (выход - 93%). Т.пл. 282-284°С (из спирта). Лит. т.пл. 278-280°С [Ruzicka L., Brener М., Rey Е. // Helv. Chim. Acta, 1941, 24, Р.515-529].

Пример 3. Получение 3-оксо-лупан-28-овой кислоты (дигидробетулоновой кислоты, 1)

Суспензию 10 г (22.5 ммоля) дигидробетулина (9) в 165 мл ледяной уксусной кислоте и 110 мл ацетона охлаждают при 0°С и в течение 1 ч при перемешивании прибавляют свежеприготовленный раствор Физера (11 г, 0.11 моля хромового ангидрида в 12 мл ледяной уксусной кислоты и 15 мл Н2О). Выдерживают при комнатной температуре 3 ч. По окончании реакции добавляют 50 мл метанола, прибавляют 300 мл бензола и 300 мл 10% раствора NaCl. Бензольный слой отделяют, а водный экстрагируют 2×150 мл бензола. Объединенные экстракты промывают 3×200 мл 10% раствором NaCl, сушат MgSO4 , осушитель отфильтровывают, бензол отгоняют приблизительно до 100 мл и выливают в 200 мл 5% раствора KОН. Осадок калиевой соли дигидробетулоновой кислоты (1) отфильтровывают и высушивают. Сухую соль растворяют в 50 мл этанола, не растворившуюся часть отфильтровывают, фильтрат выливают в 250 мл 5% раствор НСl. Выделившуюся кислоту (1) отфильтровывают, промывают H2O, высушивают. В итоге получают 5.5 г (54% от теории) дигидробетулоновой кислоты (1). Точка плавления и спектры ЯМР 1Н и 13 С соответствуют литературным [Wahab A., Ottosen M., Bachelor F.W. // Can.J.Chem., 1991, 69, P.570-577].

Пример 4. Получение 3-оксо-лупано-28-ил хлорида (хлорангидрида дигидробетулоновой кислоты, 1)

К раствору 5.7 г (12.48 ммоля) дигидробетулоновой кислоты (1) в 70 мл безводного СН2Сl2 добавляют 2.3 мл (26.36 ммоля) оксалилхлорида и выдерживают при комнатной температуре 4 ч. После отгонки растворителя к остатку прибавляют столько же СН2Сl2 и повторно упаривают. Остаток обрабатывают безводным эфиром, осадок отфильтровывают, промывают эфиром, получают 4.6 г хлорангидрида ДГБК с т.пл. 225-232°С (выход - 91%). Хлорангидрид сразу же вводят в дальнейшую реакцию.

Пример 5. Получение амидов гидрированной бетулоновой кислоты (2-8). Общая методика

К раствору 0.5 г (1.05 ммоля) хлорангидрида дигидробетулоновой кислоты (1) в 40 мл сухого CH2Cl2 при перемешивании прибавляют 2.2 ммоля соответствующего амина. Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре 18-20 ч, затем разбавляют CH2 Cl2 до 100 мл, промывают 3×20 мл Н2 О, высушивают MgSO4, осушитель отфильтровывают, растворитель отгоняют. Остаток перекристаллизовывают либо делят колоночной хроматографией на силикагеле фракции 60-200 мкм фирмы Merk. Элюенты приведены для каждого продукта. Данные спектров ЯМР 13 С для синтезированных амидов дигидробетулоиовой кислоты (2-8) в СDСl3 (гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 , м.д.) приведены в таблице 2.

гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115

гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115

Примечания: а) для атомов С(2гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ,6гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ) наблюдается широкий сигнал при 46.2 м.д., ХС сигнала С(4гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ) 24.62 м.д.; b) для атомов С(2гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ,6гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ) наблюдается широкий сигнал при 45.6 м.д.; с) для атомов С(2гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ,6гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ) соединений (4-6) наблюдаются очень широкие сигналы около 45 м.д.; d) для атомов С(2гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ,6гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ) соединения (7) и атомов С(2гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ,7гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ) соединения (8) сигналы наблюдать не удается; для соединения (7) ХС дублетных сигналов ароматической части следующие: 128.43 С(10гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ) и 126.94 С(11гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ) м.д.

Пример 6. Влияние гидрированиой бетулоновой кислоты (1) и ее амидов (2-8) на жизнеспособность опухолевых клеток Т-клеточного лейкоза человека МТ-4

Клетки линии МТ-4 (клетки Т-клеточного лейкоза человека) культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина), в атмосфере 5%-ного СО2 при 37°С.

Жизнеспособность клеток после инкубации с соединениями (1-8) определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (100 мкл клеток с концентрацией 500 тыс. клеток/мл). Затем к клеткам добавляли раствор соединений (1-8) в ДМСО до конечной концентрации в среде от 0.1 до 100 мкг/мл. В качестве препарата сравнения использовали бетулоновую кислоту (БА) и ее соответствующие амиды (БА1-БА7). Клетки инкубировали в присутствии соединений еще в течение 3-х суток в тех же условиях. По окончании инкубации, без смены среды, к клеткам добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл ДМСО, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана, и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн 570 и 630 нм, где А570 - поглощение формазана, а А630 - фон клеток.

Данные представляли в виде количества живых клеток относительно контроля. За 100% принимали количество клеток в контроле, где клетки инкубировали в отсутствие соединения, но в присутствии растворителя ДМСО.

Данные по обработке лейкозных клеток МТ-4 соединениями (1-8) приведены на Фиг 1-7.

На Фиг.1 показана жизнеспособность клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением (2) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (2). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА1)

На Фиг.2 - жизнеспособность клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением (3) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (3). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА2).

На Фиг.3 - жизнеспособность клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением (4) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (4). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА3).

На Фиг.4 - жизнеспособность клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением (5) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (5). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА4).

На Фиг.5 - жизнеспособность клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением (6) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (6). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА5).

На Фиг.6 - жизнеспособность клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением (7) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (7). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА6).

На Фиг.7 - жизнеспособность клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением (8) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (8). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА7).

Из данных, приведенных на Фиг.1-7, видно, что обработка лейкозных клеток МТ-4 соединениями (1-8) вызывает их эффективную гибель уже при концентрации соединений 10-6 М. Значения CCID50 - концентрация соединения, при которой наблюдается гибель 50% клеток, а также CCID80 и CCID90 (концентрации, при которых наблюдается гибель 80 и 90% клеток, соответственно) приведены в таблице 1.

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что соединения (1-8) обладают таким же или более выраженным противоопухолевым эффектом по сравнению с ранее описанными аналогичными производными бетулоновой кислоты (БА1-БА7), за исключением соединения (4), противоопухолевый эффект которого на клетках МТ-4 менее выражен по сравнению с аналогичным производным бетулоновой кислоты.

Пример 7. Влияние гидрированной бетулоновой кислоты (1) и ее амидов (2-8) на жизнеспособность опухолевых клеток Т-клеточного лейкоза человека СЕМ-13

Клетки линии СЕМ-13 (линия клеток Т-клеточного лейкоза человека) культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина), в атмосфере 5%-ного СО2 при 37°С.

Жизнеспособность клеток после инкубации с соединениями (1-8) определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (100 мкл клеток с концентрацией 500 тыс. клеток/мл). Затем к клеткам добавляли раствор соединения (1) в ДМСО до конечной концентрации в среде от 0.1 до 100 мкг/мл. В качестве препарата сравнения использовали аналогичные производные бетулоновой кислоты (2). Клетки инкубировали в присутствии исследуемых соединений еще в течение 3-х суток в тех же условиях. По окончании инкубации, без смены среды, к клеткам добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл ДМСО, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана, и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн 570 и 630 нм, где А570 - поглощение формазана, а А 630 - фон клеток.

Подсчет значений CCID проводили как описано в примере 5. Значения CCID50 - концентрация соединения, при которой наблюдается гибель 50% клеток, а также CCID80 и CCID90 (концентрации, при которых наблюдается гибель 80 и 90% клеток, соответственно) приведены в таблице 1. Все исследованные соединения (1-8) обладают таким же или более выраженным противоопухолевым эффектом по сравнению с ранее описанными аналогичными производными бетулоновой кислоты (БА1-БА7), за исключением соединения (4), противоопухолевый эффект которого на клетках СЕМ-13 менее выражен по сравнению с аналогичным производным бетулоновой кислоты.

Жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединениями (2-8) иллюстрируется Фиг.8-14.

Фиг.8 - жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединением (2) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (2). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА1)

Фиг.9 - жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединением (3) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (3). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА2).

Фиг.10 - жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединением (4) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (4). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА3).

Фиг.11 - жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединением (5) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (5). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА4).

Фиг.12 - жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединением (6) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (6). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА5).

Фиг.13 - жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединением (7) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (7). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА6).

Фиг.14 - жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединением (8) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (8). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА7).

Пример 8. Влияние гидрированной бетулоновой кислоты (1) и ее амидов (2-8) на жизнеспособность опухолевых клеток человека U-937

Клетки линии U-937 (опухолевая линия моноцитов человека) культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина), в атмосфере 5%-ного СО2 при 37°С.

Жизнеспособность клеток после инкубации с соединениями (1-8) определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (100 мкл клеток с концентрацией 400 тыс. клеток/мл). Затем к клеткам добавляли раствор исследуемых соединений в ДМСО до конечной концентрации в среде от 0.1 до 100 мкг/мл. В качестве препарата сравнения использовали бетулоновую кислоту (2). Клетки инкубировали в присутствии соединений еще в течение 3-х суток в тех же условиях. По окончании инкубации, без смены среды, к клеткам добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл ДМСО, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана, и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн 570 и 630 нм, где А570 - поглощение формазана, а А630 - фон клеток.

Подсчет значений CCID проводили как описано в примере 5. Значения CCID50 - концентрация соединения, при которой наблюдается гибель 50% клеток, а также CCID80 и CCID90 (концентрации, при которых наблюдается гибель 80 и 90% клеток, соответственно) приведены на Фиг.15-22.

Фиг.15 - жизнеспособность клеток линии U-937 после инкубации с соединением (2) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (2). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА1).

Фиг.16 - жизнеспособность клеток линии U-937 после инкубации с соединением (3) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (3). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА2).

Фиг.17 - жизнеспособность клеток линии U-937 после инкубации с соединением (4) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (4). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА3).

Фиг.18 - жизнеспособность клеток линии U-937 после инкубации с соединением (5) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (5). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА4).

Фиг.19 - жизнеспособность клеток линии U-937 после инкубации с соединением (6) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (6). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА5).

Фиг.20 - жизнеспособность клеток линии U-937 после инкубации с соединением (7) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (7). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА6).

Фиг.21 - жизнеспособность клеток линии U-937 после инкубации с соединением (8) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (8). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА7).

Таким образом, соединения (1-8) обладают более выраженным противоопухолевым эффектом в отношении исследованных опухолевых клеток U-937 по сравнению с бетулоновой кислотой и ее аналогичными производными (БА1-БА8), для которой ранее было показано наличие выраженной противоопухолевой активности.

Пример 9. Влияние гидрированной бетулоновой кислоты (1) и ее амидов (2-8) на жизнеспособность опухолевых линий клеток человека

Значения CCID - концентрация соединений (1-8), при которой наблюдается гибель карциномных клеток, - приведены в таблице 1. CCID50 - концентрация соединения, при которой наблюдается гибель 50% клеток, а также CCID80 и CCID90 (концентрации, при которых наблюдается гибель 80 и 90% клеток, соответственно). Таким образом, соединения (1-8) обладают таким же или более выраженным противоопухолевым эффектом в отношении исследованных опухолевых клеток МТ-4, СЕМ-13 и U-937 по сравнению с бетулоновой кислотой и ее аналогичными производными (БА1-БА8), для которой ранее было показано наличие выраженной противоопухолевой активности.

Таблица 1
Гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противопухолевые средства тритерпеновой природы
гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 CCID50, µМ гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115
Кислота и ее амидыСЕМ-13 U-937 MT-4
(1) 4.4 3.8 3.5
(2) 17.2 6.0 8.2
(3) 14.3 22.82.9 3.826.6
(4) 13.0 7.8 33.4
(5) 6.9 6.0 7.2
(6) 12.4 23.55.9 7.716.8
(7) 26.036.2 69.510.9 26.0
(8) 10.6 11.9 11.9
гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 CCID80, µМ гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115
(1) 186.1 87.6 100.7
(2) 101.2 >190 61.1
(3) 121.7 190.2 123.6
(4) >185.6 >185.6 157.7
(5) 77.8 >180.9 48.8
(6) >167.7 21.8 115.7
(7) >144.7 >144.7 118.7
(8) >185.9 >185.9 66.9
гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 CCID90, µM гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115
(1) >219 >219 >219
(2) 175.5 >190 118.4
(3) >190 >190 >190
(4) >185.6 >185.6 >185.6
(5)180.9 >180.9 110.3
(6) >167.7 >167.7 >167.7
(7)>144.7 >144.7 >144.7
(8)>185.9 >185.9 117.1

Таблица 2
Гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противопухолевые средства тритерпеновой природы
С-атомамид (2) aамид (3) bамид (4) cамид (5) cамид (6) cамид (7) dамид (8) d
С-1 39.48 т 39.48 т39.48 т 39.46 т 39.45 т39.50 т 39.50 т
С-233.97 т 33.97 т33.98 т 33.95 т 33.94 т34.00 т 33.98 т
С-3217.92 с 217.83 с217.91 с 217.85 с 217.82 с217.97 с 217.91 с
С-4 47.14 с47.15 с 47.15 с 47.12 с47.12 с 47.18 с 47.15 с
С-5 54.90 д 54.90 д54.90 д 54.88 д 54.86 д54.93 д 54.90 д
С-619.49 т 19.48 т19.49 т 19.47 т 19.45 т19.52 т 19.51 т
С-733.63 т 33.64 т33.62 т 33.60 т 33.60 т33.67 т 33.65 т
С-840.45 с 40.47 с40.47 с 40.45 с 40.44 с40.49 с 40.52 с
С-949.83 д 49.78 д49.80 д 49.79 д 49.76 д49.83 д 49.88 д
С-1036.74 с 36.74 с36.75 с 36.73 с 36.72 с36.77 с 36.76 с
С-1121.57 т 21.53 т21.54 т 21.53 т 21.51 т21.56 т 21.59 т
С-1227.02 т 26.99 т27.01 т 26.99 т 26.95 т27.03 т 27.04 т
С-1336.57 д 36.55 д36.54 д 36.51 д 36.55 д36.56 д 36.51 д
С-1441.88 с 41.89 с41.88 с 41.86 с 41.88 с41.90 с 41.98 с
С-1529.73 т 29.65 т29.65 т 29.61 т 29.63 т29.65 т 29.80 т
С-1632.17 т 32.08 т32.15 т 32.13 т 32.20 т32.13 т 31.92 т
С-1754.89 с 54.74 с54.79 с 54.75 с 54.87 с54.80 с 55.21 с
С-1852.21 д 52.02 д52.06 д 52.04 д 52.06 д52.07 д 52.50 д
С-1942.67 д 42.59д42.60 д 42.59 д 42.58 д42.66 д 42.76 д
С-2029.66 д 29.61 д29.63 д 29.61 д 29.60 д29.65 д 29.73 д
С-2123.39 т 23.34 т23.35 т 23.33 т 23.32 т23.37 т 23.43 т
С-2235.98 т 35.91 т35.97 т 35.95 т 35.99 т35.96 т 36.23 т
С-2326.44 к 26.44 к26.44 к 26.43 к 26.41 к26.47 к 26.46 к
С-2420.85 к 20.86 к20.86 к 20.84 к 20.84 к20.90 к 20.84 к
С-2515.77 к 15.77 к15.78 к 15.76 к 15.75 к15.80 к 15.80 к
С-2615.77 к 15.77 к15.77 к 15.76 к 15.74 к15.80 к 15.74 к
С-2714.27 к 14.26 к14.26 к 14.24 к 14.25 к14.28 к 14.34 к
С-28173.27 с 173.69 с 173.50 с173.41 с 173.85 с 173.47 с173.88 с
С-29 14.52 к14.50 к 14,51 к 14.49 к14.47 к 14.52 к 14.56 к
С-30 22.77 к 22.76 к22.77 к 22.75 к 22.73 к22.79 к 22.82 к
С-3гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 ,5гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 26.06 т 66.82 т 55.06 т52.90 т 43.64 т 52.16 тгидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115
С-7гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 45.76 к 52.08 к 155.34 c76.12 д гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115
С-8гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 11.73 к 61.38 т 142.26 сгидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115
С-9гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115 14.45 к 126.66 д гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые   средства тритерпеновой природы, патент № 2448115

Класс C07J53/00 Стероиды, в которых циклопента (а) гидрофенантреновый скелет модифицирован конденсированием с карбоциклическими кольцами или получением дополнительного кольца за счет образования непосредственной связи между двумя атомами углерода кольца

способ получения а-секотритерпеновых с-3(28) моно-и диамидов и их секоинтермедиатов -  патент 2525546 (20.08.2014)
способ получения бетулина -  патент 2524778 (10.08.2014)
способ получения бетулина (варианты) -  патент 2523545 (20.07.2014)
способ синтеза производного эфира и глицирретиновой кислоты и соединение сложного эфира дезоксиглицирретиновой кислоты -  патент 2522455 (10.07.2014)
способ получения производных 3,28-дисульфата бетулина -  патент 2520971 (27.06.2014)
способ получения бетулина из бересты -  патент 2501805 (20.12.2013)
способ получения ацетата 16 ,17 -циклогексанопрегн-5-ен-3 -ол-20-она -  патент 2495047 (10.10.2013)
средство, обладающее антиоксидантной, противовоспалительной, нейропротекторной, гиполипидемической, гипохолестеринемической, гипогликемической, гепатопротекторной, иммуносупрессорной активностями -  патент 2487884 (20.07.2013)
способ получения натриевой соли 3-сульфата аллобетулина -  патент 2482126 (20.05.2013)
способ получения натриевой соли 3-сульфата аллобетулина -  патент 2482125 (20.05.2013)

Класс C07J63/00 Стероиды, в которых циклопента (а) гидрофенантреновый скелет модифицирован расширением только одного из колец на один или два атома

способ получения а-секотритерпеновых с-3(28) моно-и диамидов и их секоинтермедиатов -  патент 2525546 (20.08.2014)
способ получения бетулина -  патент 2524778 (10.08.2014)
способ получения бетулина (варианты) -  патент 2523545 (20.07.2014)
способ синтеза производного эфира и глицирретиновой кислоты и соединение сложного эфира дезоксиглицирретиновой кислоты -  патент 2522455 (10.07.2014)
способ получения производных 3,28-дисульфата бетулина -  патент 2520971 (27.06.2014)
способ получения 3-ацетата-28-сульфата бетулина -  патент 2477285 (10.03.2013)
средство, представляющее собой 3-o- -d-глюкуронопиранозил- -d-глюкуронопиранозид олеан-9( 11),12( 13)-диен-30-овой кислоты, проявляющее анти-вич-1 активность, и способ его получения -  патент 2475246 (20.02.2013)
способ получения мороновой кислоты -  патент 2472803 (20.01.2013)
способ получения 3,28-дисульфата бетулина -  патент 2468031 (27.11.2012)
способ получения бетулина -  патент 2465281 (27.10.2012)

Класс A61P35/00 Противоопухолевые средства

способ лечения рака толстой кишки -  патент 2529831 (27.09.2014)
способ оценки эффекта электромагнитных волн миллиметрового диапазона (квч) в эксперименте -  патент 2529694 (27.09.2014)
новые (поли)аминоалкиламиноалкиламидные, алкил-мочевинные или алкил-сульфонамидные производные эпиподофиллотоксина, способ их получения и их применение в терапии в качестве противораковых средств -  патент 2529676 (27.09.2014)
производные 1, 2-дигидроциклобутендиона в качестве ингибиторов фосфорибозилтрансферазы никотинамида -  патент 2529468 (27.09.2014)
фармацевтическое средство, содержащее эпитопные пептиды hig2 и urlc10, для лечения рака, способы и средства для индукции антигенпрезентирующей клетки и цитотоксического т-лимфоцита (цтл), антигенпрезентирующая клетка и цтл, полученные таким способом, способ и средство индукции иммунного противоопухолевого ответа -  патент 2529373 (27.09.2014)
модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения -  патент 2529034 (27.09.2014)
модулирующие jak киназу хиназолиновые производные и способы их применения -  патент 2529019 (27.09.2014)
лечение опухолей с помощью антитела к vegf -  патент 2528884 (20.09.2014)
способ лечения местнораспространенного неоперабельного рака поджелудочной железы -  патент 2528881 (20.09.2014)
новые бензолсульфонамидные соединения, способ их получения и применение в терапии и косметике -  патент 2528826 (20.09.2014)
Наверх