защитное действие доминантно-негативного мутантного белка krp от ингибирования активного комплекса циклин-cdk krp дикого типа

Формула изобретения

1. Изолированный, мутантный полипептид CKI (ингибитор циклин-зависимой киназы, или CDK) растений, содержащий аминокислотную последовательность CKI, имеющую, по меньшей мере, одну модификацию относительно полипептида CKI дикого типа растений, указанный полипептид CKI дикого типа, содержащий (а) циклин-связывающую область для придания аффинности связывания для циклина и (b) CDK-связывающую область для придания аффиности связывания для CDK;

где, по меньшей мере, одна указанная модификация находится внутри CDK-связывающей области, соответствующей аминокислотам 145-168 Brassica napus KRP1 (BnKRP1) для придания относительно полипептида CKI дикого типа модифицированной аффинности связывания мутантного полипептида CKI для CDK;

где, по меньшей мере, одна указанная модификация выбрана из группы, включающей аминокислотные замены, вставки (инсерции) и делеции по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа;

где мутантный полипептид CKI существенно сохраняет относительно полипептида CKI дикого типа аффинность связывания для циклина; и где мутантный полипептид CKI может конкурировать с указанным CKI дикого типа за связывание с CDK-связывающей областью.

2. Мутантный полипептид CKI растений по п.1, где указанный полипептид CKI дикого типа растений является членом семейства KIP-родственных белков (KRP).

3. Мутантный полипептид CKI растений по п.2, где указанный член семейства KRP означает полипептид CKI Brassica napus, Arabidopsis thaliana, Glycine max, кукурузы, пшеницы, риса, люцерны, хлопка или тополя.

4. Мутантный полипептид CKI растений по п.2, где указанный член семейства KRP означает полипептид KRP1 Arabidopsis или Brassica.

5. Мутантный полипептид CKI растений по п.2, где, по меньшей мере, одна указанная модификация находится внутри области, соответствующей аминокислотам 145-168 Brassica KRP1 (BnKRP1).

6. Мутантный полипептид CKI растений по п.5, который содержит, по меньшей мере, две модификации внутри области, соответствующей аминокислотам 145-168 KRP1 Brassica (BnKRP1).

7. Мутантный полипептид CKI растений по п.5, где, по меньшей мере, одна указанная модификация содержит замену аминокислоты.

8. Мутантный полипептид CKI растений по п.7, где замена аминокислоты означает замену неаланина на аланин, неконсервативную замену.

9. Мутантный полипептид CKI растений по п.7, который содержит, по меньшей мере, две аминокислотные замены, причем каждая аминокислотная замена находится в положении, независимо выбранном из группы, состоящей из:

(a) положения, соответствующего аминокислоте 145 BnKRP1;

(b) положения, соответствующего аминокислоте 149 BnKRP1;

(c) положения, соответствующего аминокислоте 151 BnKRP1;

(d) положения, соответствующего аминокислоте 153 BnKRP1;

(e) положения, соответствующего аминокислоте 164 BnKRP1; и

(f) положения, соответствующего аминокислоте 165 BnKRP1.

10. Мутантный полипептид CKI растений по п.9, где одна или несколько и произвольно все из, по меньшей мере, двух аминокислотных замен являются заменами (заменой) неаланина на аланин или аминокислотной неконсервативной заменой (неконсервативными заменами).

11. Мутантный полипептид CKI растений по п.5, где, по меньшей мере, одна указанная модификация находится внутри KYNFDF-мотива.

12. Мутантный полипептид CKI растений по п.11, в котором указанные, по меньшей мере, две модификации внутри KYNFDF-мотива содержат замены аминокислот в положениях, соответствующих аминокислотам 151 и 153 BnKRP1.

13. Мутантный полипептид CKI растений по п.12, где, по меньшей мере, одна из аминокислотных замен в положениях, соответствующих аминокислотам 151 и 153 BnKRP1, означает замену неаланина на аланин или означает замену аминокислоты на противоположно заряженную аминокислоту.

14. Мутантный полипептид CKI растений по п.12, где каждая из аминокислотных замен в положениях, соответствующих аминокислотам 151 и 153 BnKRP1, означает замену неаланина на аланин или означает замену аминокислоты на противоположно заряженную аминокислоту.

15. Мутантный полипептид CKI растений по любому из пп.13 или 14, дополнительно содержащий аминокислотную замену в положении, соответствующем аминокислоте 149 BnKRP1.

16. Мутантный полипептид CKI растений по п.15, где аминокислотная замена в положении, соответствующем аминокислоте 149 BnKRP1, означает замену неаланина на аланин или неконсервативную замену.

17. Мутантный полипептид CKI растений по п.17, дополнительно содержащий аминокислотную замену, по меньшей мере, в одном из

(a) положений, соответствующих аминокислоте 164 BnKRP1 и

(b) положений, соответствующих аминокислоте 165 BnKRP1.

18. Мутантный полипептид CKI растений по п.17, где аминокислотная замена, по меньшей мере, в одном из (а) и (b) или каждом (а) и (b) означает замену неаланина на аланин или неконсервативную замену.

19. Мутантный полипептид CKI растений по п.5, который является мутантным полипептидом BnKRP1.

20. Мутантный полипептид BnKRP1 по п.19, который означает

(1) BnKRP1 F151A; F153A;

(2) BnKRP1 Y149A; F151A; F153A;

(3) BnKRP1 E164A; W165A; или

(4) BnKRP1 F151A; F153A; E164A; W165A.

21. Мутантный полипептид CKI по п.1, где, по меньшей мере, одна указанная модификация включает укорачивание CDK-связывающей области.

22. Мутантный полипептид CKI по п.21, который является мутантным полипептидом BnKRP1.

23. Рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид CKI по п.1.

24. Экспрессионный вектор, содержащий репликон и рекомбинантную нуклеиновую кислоту по п.23.

25. Экспрессионный вектор по п.24, который представляет собой экспрессионный вектор, дополнительно содержащий промоторную область, функционально присоединенную к рекомбинантной нуклеиновой кислоте.

26. Экспрессионный вектор по п.25, где промоторная область является функциональной в растительной клетке.

27. Экспрессионный вектор по п.26, где промоторная область содержит 35S-промотор CaMV или LFAH12-промотор.

28. Экспрессионный вектор по п.25, где промоторная область является транскрипционно активной в тканеспецифической и/или органоспецифической манере.

29. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантную нуклеиновую кислоту по п.23.

30. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.24.

31. Способ изготовления мутантного полипептида CKI, содержащий: культивирование клетки-хозяина по п.29 или 30 в условиях, подходящих для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид CK-I.

32. Способ по п.31, дополнительно содержащий восстановление указанного мутантного полипептида CKI.

33. Трансгенное растение, содержащее трансген, кодирующий мутантный полипептид CKI, указанное трансгенное растение, экспрессирующее полипептид CKI дикого типа, указанный полипептид CKI дикого типа, содержащий (а) циклин-связывающую область, придающую аффинность связывания для циклина, и (b) CDK-связывающую область, придающую аффинность связывания для CDK, где указанный мутантный полипептид CKI содержит аминокислотную последовательность CKI, имеющую, по меньшей мере, одну модификацию относительно ссылочного полипептида CKI, указанный ссылочный полипептид CKI выбран из группы, состоящей из

(1) растительного полипептида CKI дикого типа, экспрессированного трансгенным растением, и

(2) полипептида CKI дикого типа гетерологичного (1) и способного обеспечить функционирование CKI дикого типа внутри клетки трансгенного растения, существенно эквивалентное функционированию CKI дикого типа (1);

где, по меньшей мере, одна указанная модификация находится внутри CDK-связывающей области, соответствующей аминокислотам 145-168 Brassica napus KRP1 (BnKRP1), для придания относительно ссылочного полипептида CKI модифицированной аффинности связывания мутантного полипептида CKI с CDK,

где, по меньшей мере, одна указанная модификация выбрана из группы, включающей аминокислотные замены, вставки (инсерции) и делеции по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа;

и где мутантный полипептид CKI существенно поддерживает относительно ссылочного полипептида CKI аффинность связывания с циклином; и

где мутантный полипептид CKI может конкурировать с указанным CKI типа за связывание с CDK-связывающей областью.

34. Трансгенное растение по п.33, которое является однодольным растением или двудольным растением.

35. Трансгенное растение по п.33, где указанный ссылочный полипептид CKI является членом семейства КГР-родственных белков (KRP).

36. Трансгенное растение по п.35, где указанный член семейства KRP означает полипептид CKI Brassica napus, Arabidopsis thaliana, Glycine max, кукурузы, пшеницы, риса, люцерны, хлопка или CKI полипептид тополя.

37. Трансгенное растение по п.36, где указанный член семейства KRP означает полипептид KRP1.

38. Трансгенное растение по п.35, где, по меньшей мере, одна модификация или, по меньшей мере, две модификации находятся внутри области, соответствующей аминокислотам 145-168 KRP1 Brassica (BnKRP1).

39. Трансгенное растение по п.38, где, по меньшей мере, одна модификация или, по меньшей мере, две модификации содержат аминокислотную замену.

40. Трансгенное растение по п.39, где аминокислотная замена означает замену неаланина на аланин или замену аминокислоты на противоположно заряженную аминокислоту.

41. Трансгенное растение по п.39, где, по меньшей мере, одна модификация или, по меньшей мере, две модификации находятся внутри KYNFDF-мотива.

42. Трансгенное растение по п.41, где, по меньшей мере, одна модификация или, по меньшей мере, две модификации внутри KYNFDF-мотива содержат замены аминокислот в положениях, соответствующих аминокислотам 151 и 153 BnKRP1.

43. Трансгенное растение по п.42, где, по меньшей мере, одна из аминокислотных замен или каждая аминокислотная замена в положениях, соответствующих аминокислотам 151 и 153 BnKRP1, означает замену неаланина на аланин или противоположно заряженную аминокислоту.

44. Трансгенное растение по п.43, где мутантный полипептид CKI дополнительно содержит аминокислотную замену в положении, соответствующем аминокислоте 149 BnKRP1.

45. Трансгенное растение по п.44, где аминокислотная замена в положении, соответствующем аминокислоте 149 BnKRP1, означает замену неаланина на аланин или неконсервативную замену.

46. Трансгенное растение по пп.44-45, где мутантный полипептид CKI дополнительно содержит аминокислотную замену, по меньшей мере, в одном или каждом из

(a) положений, соответствующих аминокислоте 164 BnKRP1, и

(b) положений, соответствующих аминокислоте 165 BnKRP1.

47. Трансгенное растение по п.46, где аминокислотная замена, по меньшей мере, в одном из (а) и (b) или, по меньшей мере, каждом (а) и (b) означает замену неаланина на аланин или неконсервативную замену.

48. Трансгенное растение по п.46, где ссылочный полипептид CKI означает полипептид BnKRP1.

49. Трансгенное растение по п.48, где мутантный полипептид CKI означает

(1) BnKRP1 F151A; F153A;

(2) BnKRP1 Y149A; F151A; F153A;

(3) BnKRP1 E164A; W165A; или

(4) BnKRP1 F151A; F153A; E164A; W165A.

50. Трансгенное растение по п.33, где, по меньшей мере, одна модификация содержит укорачивание CDK-связывающей области.

51. Трансгенное растение по п.50, где ссылочный полипептид CKI означает полипептид BnKRP1.

52. Трансгенное растение по п.33, которое выбрано из группы, состоящей из Brassica napus, Arabidopsis thaliana, Glycine max, кукурузы, пшеницы, риса, люцерны, хлопка, тополя и камелины.

53. Трансгенное растение по п.52, где ссылочный полипептид CKI означает полипептид CKI Arabidopsis thaliana.

54. Способ получения трансгенного растения по любому из пп.38-53, содержащий введение в растение вектора, содержащего трансген, кодирующий мутантный полипептид CKI.

55. Способ модуляции клеточного деления в растительной клетке, экспрессирующей полипептид CKI дикого типа, указанный полипептид CKI дикого типа, содержащий (а) циклин-связывающую область, придающую аффинность связывания для циклина, и (b) CDK-связывающую область, придающую аффинность связывания для CDK, содержащий экспрессию внутри клетки мутантного CKI-полипептида по любому из пп.1-22.

56. Способ по п.55, дополнительно содержащий введение в растительную клетку рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный CKI-полипептид.

57. Способ по п.56, где рекомбинантная нуклеиновая кислота означает экспрессионный вектор.

58. Способ по любому из пп.55-57, где растительная клетка из растения, выбранного из группы, состоящей из Brassica napus, Arabidopsis thaliana, Glycine max и кукурузы (маиса).

59. Способ увеличения мощности растения, включающий экспрессию в растении мутантного CKI-полипептида, содержащего CKI по любому из пп.1-22, позволяющую указанному мутантному CKI-полипептиду ингибировать биологическую активность CKI дикого типа в растении так, чтобы увеличить мощность растения.

60. Способ увеличения массы корней растения, включающий экспрессию в растении мутантного CKI-полипептида, содержащего CKI по любому из пп.1-22, позволяющую указанному мутантному CKI-полипептиду ингибировать биологическую активность CKI дикого типа в растении так, чтобы увеличить массу корней растения.

61. Способ увеличения размера семян растения, включающий экспрессию в растении мутантного CKI-полипептида, содержащего CKI по любому из пп.1-22, позволяющую указанному мутантному CKI-полипептиду ингибировать биологическую активность CKI дикого типа в растении так, чтобы увеличить размер семян растения.

62. Способ усиления роста растений на раннем этапе, включающий экспрессию в растении мутантного CKI-полипептида, содержащего CKI по любому из пп.1-22, и позволяющую указанному мутантному CKI-полипептиду ингибировать биологическую активность CKI дикого типа в растении так, чтобы увеличить рост растений на раннем этапе.

63. Трансгенное растение по п.33, где мутантный полипептид CKI растений содержит, по меньшей мере, две аминокислотные замены, причем каждая аминокислотная замена находится в положении, независимо выбранном из группы, состоящей из:

(a) положения, соответствующего аминокислоте 145 BnKRP1;

(b) положения, соответствующего аминокислоте 149 BnKRP1;

(c) положения, соответствующего аминокислоте 151 BnKRP1;

(d) положения, соответствующего аминокислоте 153 BnKRP1;

(e) положения, соответствующего аминокислоте 164 BnKRP1; и

(f) положения, соответствующего аминокислоте 165 BnKRP1.

64. Способ по п.55, где мутантный полипептид CKI растений содержит, по меньшей мере, две аминокислотные замены, причем каждая аминокислотная замена находится в положении, независимо выбранном из группы, состоящей из:

(а) положения, соответствующего аминокислоте 145 BnKRP1;

(b) положения, соответствующего аминокислоте 149 BnKRP1;

(c) положения, соответствующего аминокислоте 151 BnKRP1;

(d) положения, соответствующего аминокислоте 153 BnKRP1;

(e) положения, соответствующего аминокислоте 164 BnKRP1; и

(f) положения, соответствующего аминокислоте 165 BnKRP1.

65. Способ по п.59, где мутантный полипептид CKI растений содержит, по меньшей мере, две аминокислотные замены, причем каждая аминокислотная замена находится в положении, независимо выбранном из группы, состоящей из:

(а) положения, соответствующего аминокислоте 145 BnKRP1;

(b) положения, соответствующего аминокислоте 149 BnKRP1;

(c) положения, соответствующего аминокислоте 151 BnKRP1;

(d) положения, соответствующего аминокислоте 153 BnKRP1;

(e) положения, соответствующего аминокислоте 164 BnKRP1; и

(f) положения, соответствующего аминокислоте 165 BnKRP1.

66. Способ по п.60, где мутантный полипептид CKI растений содержит, по меньшей мере, две аминокислотные замены, причем каждая аминокислотная замена находится в положении, независимо выбранном из группы, состоящей из:

(а) положения, соответствующего аминокислоте 145 BnKRP1;

(b) положения, соответствующего аминокислоте 149 BnKRP1;

(c) положения, соответствующего аминокислоте 151 BnKRP1;

(d) положения, соответствующего аминокислоте 153 BnKRP1;

(e) положения, соответствующего аминокислоте 164 BnKRP1; и

(f) положения, соответствующего аминокислоте 165 BnKRP1.

67. Способ по п.61, где мутантный полипептид CKI растений содержит, по меньшей мере, две аминокислотные замены, причем каждая аминокислотная замена находится в положении, независимо выбранном из группы, состоящей из:

(а) положения, соответствующего аминокислоте 145 BnKRP1;

(b) положения, соответствующего аминокислоте 149 BnKRP1;

(c) положения, соответствующего аминокислоте 151 BnKRP1;

(d) положения, соответствующего аминокислоте 153 BnKRP1;

(e) положения, соответствующего аминокислоте 164 BnKRP1; и

(f) положения, соответствующего аминокислоте 165 BnKRP1.

68. Способ по п.62, где мутантный полипептид CKI растений содержит, по меньшей мере, две аминокислотные замены, причем каждая аминокислотная замена находится в положении, независимо выбранном из группы, состоящей из:

(а) положения, соответствующего аминокислоте 145 BnKRP1;

(b) положения, соответствующего аминокислоте 149 BnKRP1;

(c) положения, соответствующего аминокислоте 151 BnKRP1;

(d) положения, соответствующего аминокислоте 153 BnKRP1;

(e) положения, соответствующего аминокислоте 164 BnKRP1; и

(f) положения, соответствующего аминокислоте 165 BnKRP1.

Описание изобретения к патенту

Текст описания приведен в факсимильном виде.