получение антител против амилоида бета

Изобретение раскрывает способ крупномасштабного получения антител против амилоидного белка бета в культуре клеток. В способе используют питательную среду для культивирования клеток, трансформированных геном, кодирующим целевой продукт. Одной из особенностей питательной среды является следующий признак: суммарная концентрация аминокислот больше, чем приблизительно 70 мМ; отношение суммарного молярного количества глютамина к суммарному количеству аспарагина меньше, чем приблизительно 2; отношение суммарного молярного количества глютамина к суммарному количеству всех аминокислот меньше, чем приблизительно 0.2; отношение суммарного молярного количества неорганических ионов к суммарному количеству всех аминокислот составляет приблизительно от 0.4 до 1 или совокупное суммарное количество глютамина и аспарагина на единицу объема находится в диапазоне приблизительно от 16 мМ до 36 мМ. Такая система культивирования обеспечивает высокие уровни продуцирования антител. Способы культивирования могут включать изменение температуры, обычно - снижение температуры, при достижении культурой 20-80% от максимальной плотности клеток, величины рН, осмоляльности, уровня химического активатора и их комбинации. В качестве альтернативы или дополнения раскрыты способы - варианты, в которых уровни лактата и/или аммония в культуре после достижения пиковых значений снижаются с течением времени. Изобретение обеспечивает высокий выход антител при одновременном снижении накопления нежелательных продуктов, в частности аммония и/или лактата. 4 н. и 44 з.п. ф-лы, 76 ил., 27 табл.

Формула изобретения

1. Способ крупномасштабного получения антитела против -А_бета в культуре клеток, включающий следующие этапы:

обеспечение культуры клеток, содержащей

клетки млекопитающего, которые содержат ген, кодирующий антитело против -А_бета, экспрессия которого происходит в условиях культивирования клеток;

и среду, содержащую глютамин и обладающую свойствами, выбранными из группы, состоящей из следующего: (i) суммарное количество аминокислот на единицу объема больше приблизительно 70 мМ; (ii) отношение суммарного молярного количества глютамина к суммарному количеству аспарагина меньше чем приблизительно 2; (iii) отношение суммарного молярного количества глютамина к суммарному количеству всех аминокислот меньше чем приблизительно 0,2; (iv) отношение суммарного молярного количества неорганических ионов к суммарному количеству всех аминокислот составляет приблизительно от 0.4 до 1; (v) совокупное суммарное количество глютамина и аспарагина на единицу объема больше чем приблизительно 16 мМ; и комбинаций указанных свойств;

поддержание указанной культуры в фазе начального роста при первом наборе условий культивирования в течение первого периода времени, достаточного для того, чтобы клетки размножились до получения плотности жизнеспособных клеток, лежащей в диапазоне приблизительно 20-80% от максимальной плотности жизнеспособных клеток, которую можно было бы получить при выращивании указанной культуры при указанном первом наборе условий культивирования;

изменение по меньшей мере одного из условий культивирования с получением второго набора условий культивирования, при этом указанное условие культивирования на указанном этапе изменения по меньшей мере одного из условий культивирования выбрано из группы, состоящей из (i) температуры, (ii) pH, (iii) осмоляльности, (iv) уровня химического активатора и их комбинаций;

поддержание указанной культуры при указанном втором наборе условий в течение второго периода времени для того, чтобы в культуре произошло накопление антитела против -А_бета.

2. Способ крупномасштабного получения антитела против -А_бета в культуре клеток, включающий следующие этапы:

обеспечение культуры клеток, содержащей

клетки млекопитающего, которые содержат ген, кодирующий антитело против -А_бета, экспрессия которого происходит в условиях культивирования клеток; и

среду, в которой отношение суммарного молярного количества глютамина к суммарному количеству аспарагина меньше чем приблизительно 2; указанная среда содержит глютамин; и

указанная среда обладает двумя свойствами, выбранными из группы, состоящей из следующего: (i) суммарное количество аминокислот в среде на единицу объема больше приблизительно 70 мМ; (ii) отношение суммарного молярного количества глютамина к суммарному количеству всех аминокислот меньше чем приблизительно 0,2; (iii) отношение суммарного молярного количества неорганических ионов к суммарному количеству всех аминокислот составляет приблизительно от 0,4 до 1; (iv) совокупное суммарное количество глютамина и аспарагина на единицу объема больше чем приблизительно 16 мМ; и комбинаций указанных свойств;

поддержание указанной культуры в фазе начального роста при первом наборе условий культивирования в течение первого периода времени, достаточного для того, чтобы клетки размножились до получения плотности жизнеспособных клеток, лежащей в диапазоне приблизительно 20-80% от максимальной плотности жизнеспособных клеток, которую можно было бы получить при выращивании указанной культуры при указанном первом наборе условий культивирования;

изменение по меньшей мере одного из условий культивирования с получением второго набора условий культивирования, при этом указанное условие культивирования на указанном этапе изменения по меньшей мере одного из условий культивирования выбрано из группы, состоящей из (i) температуры, (ii) pH, (iii) осмоляльности, (iv) уровня химического активатора и их комбинаций;

поддержание указанной культуры при указанном втором наборе условий в течение второго периода времени для того, чтобы в культуре произошло накопление антитела против -А_бета.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что исходная концентрация глютамина в указанной среде меньше или равна 10 мМ.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что исходная концентрация глютамина в указанной среде меньше или равна 4 мМ.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество глютамина на единицу объема в указанной среде меньше или равно 10 мМ.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество глютамина на единицу объема в указанной среде меньше или равно 4 мМ.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что глютамин обеспечивают только в исходной среде в начале культивирования клеток.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что исходная плотность указанных клеток млекопитающего составляет по меньшей мере 2·10⁵ клеток/мл.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что исходная плотность указанных клеток млекопитающего составляет по меньшей мере 2·10 ⁶ клеток/мл.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап обеспечения включает обеспечение по меньшей мере 1000 л культуры.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап обеспечения включает обеспечение по меньшей мере 10000 л культуры.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный первый набор условий включает первый диапазон температур, который составляет приблизительно от 30 до 42°С.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный первый набор условий включает первую температуру, которая составляет приблизительно 37º Цельсия.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный второй набор условий включает второй диапазон температур, который составляет приблизительно 25 - 41°С.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный второй набор условий включает второй диапазон температур, который составляет приблизительно 29 - 35°С.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный второй набор условий включает вторую температуру, которая составляет приблизительно 31°С.

17. Способ по п.1, который дополнительно включает следующий за первым указанным этапом изменения по меньшей мере одного из условий культивирования второй этап изменения условий, включающий изменение по меньшей мере одного из условий культивирования, в результате которого получают третий набор условий культивирования.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что второй этап изменения условий включает изменение по меньшей мере одного из условий культивирования, выбранного из группы, состоящей из (i) температуры, (ii) рН, (iii) осмоляльности, (iv) уровня химического активатора, и их комбинаций.

19. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанный третий набор условий включает третий диапазон температур, который составляет приблизительно 27 - 37°С.

20. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный первый период времени составляет 1-7 дней.

21. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный первый период времени составляет приблизительно 4 дня.

22. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный первый период времени и указанный второй период времени вместе составляют по меньшей мере 5 дней.

23. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе поддержания культуры в течение второго периода времени уровень лактата снижается после того, как уровень лактата в культуре достиг максимального уровня.

24. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе поддержания культуры в течение второго периода времени уровень аммония снижается после того, как уровень аммония в культуре достиг максимального уровня.

25. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное общее количество указанного получаемого антитела против -А_бета по меньшей мере в 1,5 раза выше чем количество антитела против -А_бета, получаемого при идентичных условиях и в остальном идентичной среде, которая не обладает указанным свойством.

26. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное общее количество указанного полученного антитела против -А_бета по меньшей мере в 2 раза выше, чем количество антитела против -А_бета, получаемого при идентичных условиях и в остальном идентичной среде, которая не обладает указанным свойством.

27. Способ по п.1, отличающийся тем, что в указанную культуру клеток добавляют дополнительные компоненты.

28. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанные дополнительные компоненты добавляют в множественные моменты времени.

29. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанные дополнительные компоненты выбраны из группы, состоящей из гормонов и/или других факторов роста, определенных ионов (таких как натрий, хлор, кальций, магний и фосфат-ион), буферов, витаминов, нуклеозидов или нуклеотидов, микроэлементов (неорганических соединений, обычно присутствующих в очень низких конечных концентрациях), аминокислот, липидов, глюкозы или других источников энергии.

30. Способ крупномасштабного получения антитела против -А_бета в культуре клеток, включающий следующие этапы:

обеспечение культуры клеток, содержащей

клетки млекопитающего, которые содержат ген, кодирующий антитело против -А_бета, экспрессия которого происходит в условиях культивирования клеток; и

среду определенного состава, содержащую глютамин и обладающую по меньшей мере двумя свойствами, выбранными из группы, состоящей из следующего:

i) начальная концентрация аминокислот больше чем 70 мМ; ii) отношение молярного количества глютамина к молярному количеству аспарагина меньше чем приблизительно 2; iii) отношение молярного количества глютамина к количеству всех аминокислот меньше чем приблизительно 0,2; iv) отношение молярного количества неорганических ионов к количеству всех аминокислот составляет приблизительно от 0,4 до 1; и v) совокупная концентрация глютамина и аспарагина больше чем приблизительно 16 мМ;

поддержание указанной культуры в фазе начального роста при первом наборе условий культивирования в течение первого периода времени, достаточного для того, чтобы клетки размножились до получения плотности жизнеспособных клеток, лежащей в диапазоне приблизительно 20-80% от максимальной плотности жизнеспособных клеток, которую можно было бы получить при выращивании указанной культуры при указанном первом наборе условий культивирования;

изменение по меньшей мере одного из условий культивирования с получением второго набора условий культивирования, при этом указанное условие культивирования на указанном этапе изменения по меньшей мере одного из условий культивирования выбрано из группы, состоящей из (i) температуры, (ii) рН, (iii) осмоляльности, (iv) уровня химического активатора, и их комбинаций;

поддержание указанной культуры при указанном втором наборе условий в течение второго периода времени для того, чтобы в культуре произошло накопление антитела против -А_бета.

31. Способ крупномасштабного получения антитела против -А_бета в культуре клеток, включающий следующие этапы;

обеспечение культуры клеток, содержащей

клетки млекопитающего, которые содержат ген, кодирующий антитело против -А_бета, экспрессия которого происходит в условиях культивирования клеток; и

среду определенного состава, содержащую глютамин и отличающуюся тем, что i) начальная концентрация аминокислот больше чем 70 мМ; ii) отношение молярного количества глютамина к молярному количеству аспарагина меньше чем приблизительно 2; iii) отношение молярного количества глютамина к количеству всех аминокислот меньше чем приблизительно 0,2; iv) отношение молярного количества неорганических ионов к количеству всех аминокислот составляет приблизительно от 0,4 до 1; и v) совокупная концентрация глютамина и аспарагина больше чем приблизительно 16 мМ;

поддержание указанной культуры в фазе начального роста при первом наборе условий культивирования в течение первого периода времени, достаточного для того, чтобы клетки размножились до получения плотности жизнеспособных клеток, лежащей в диапазоне приблизительно 20-80% от максимальной плотности жизнеспособных клеток, которую можно было бы получить при выращивании указанной культуры при указанном первом наборе условий культивирования;

изменение по меньшей мере одного из условий культивирования с получением второго набора условий культивирования, при этом указанное условие культивирования на указанном этапе изменения по меньшей мере одного из условий культивирования выбрано из группы, состоящей из (i) температуры, (ii) pH, (iii) осмоляльности, (iv) уровня химического активатора, и их комбинаций;

поддержание указанной культуры при указанном втором наборе условий в течение второго периода времени для того, чтобы в культуре произошло накопление антитела против -А_бета.

32. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная среда включает среду, содержащую глютамин, которая обладает свойством, выбранным из группы, состоящей из следующего:

(i) начальная концентрация аминокислот больше чем 70 мМ; (ii) начальное отношение молярного количества глютамина к молярному количеству аспарагина меньше чем приблизительно 2; (iii) начальное отношение молярного количества глютамина к количеству всех аминокислот меньше чем приблизительно 0.2; (iv) начальное отношение молярного количества неорганических ионов к количеству всех аминокислот составляет приблизительно от 0,4 до 1; (v) совокупная концентрация глютамина и аспарагина больше чем приблизительно 16 мМ; и комбинаций указанных свойств.

33. Способ по любому из пп.1-2 или 30-32, отличающийся тем, что

уровень лактата ниже чем уровень лактата, наблюдаемый при идентичных условиях и в остальном идентичной среде, которая не обладает указанным свойством;

уровень аммония ниже чем уровень аммония, наблюдаемый при идентичных условиях и в остальном идентичной среде, которая не обладает указанным свойством; и

общее количество получаемого антитела против -А_бета по меньшей мере также высоко, как количество антитела против -А_бета, получаемое при идентичных условиях и в остальном идентичной среде, которая не обладает указанным свойством.

34. Способ по п.1, отличающийся тем, что в указанную культуру в ходе получения антитела против -А_бета не добавляют дополнительных компонентов.

35. Способ по п.1, отличающийся тем, что в указанной культуре вместо глютамина используют глицилглютамин.

36. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество гистидина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, тирозина и пролина на единицу объема в указанной культуре больше чем приблизительно 25 мМ.

37. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество гистидина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, тирозина и пролина на единицу объема в указанной культуре больше чем приблизительно 35 мМ.

38. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная среда обладает свойством, выбранным из группы, состоящей из следующего:

(i) суммарное общее количество гистидина на единицу объема больше чем приблизительно 1,7 мМ;

(ii) суммарное общее количество изолейцина на единицу объема больше чем приблизительно 3,5 мМ;

(iii) суммарное общее количество лейцина на единицу объема больше чем приблизительно 5,5 мМ;

(iv) суммарное общее количество метионина на единицу объема больше чем приблизительно 2,0 мМ.

(v) суммарное общее количество фенилаланина на единицу объема больше чем приблизительно 2,5 мМ;

(vi) суммарное общее количество пролина на единицу объема больше чем приблизительно 2,5 мМ;

(vii) суммарное общее количество триптофана на единицу объема больше чем приблизительно 1,0 мМ; и

(viii) суммарное общее количество тирозина на единицу объема больше чем приблизительно 2,0 мМ.

39. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество серина на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 10 мМ.

40. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество аспарагина на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 8 мМ.

41. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество аспарагина на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 12 мМ.

42. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество фосфора на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 5 мМ.

43. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество глютамата на единицу объема в указанной среде меньше чем приблизительно 1 мМ.

44. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество пантотената кальция на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 20 мг/л.

45. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество никотинамида на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 25 мг/л.

46. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество пиридоксина и пиридоксала на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 35 мг/л.

47. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество рибофлавина на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 2,0 мг/л.

48. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное общее количество тиамина гидрохлорида на единицу объема в указанной среде больше чем приблизительно 35 мг/л.

Описание изобретения к патенту

Текст описания приведен в факсимильном виде.