способ выделения и приготовления суспензии лейкозных клеток из селезенок мышей инбредной линии akr/jy

Формула изобретения

Способ выделения и приготовления суспензии лейкозных клеток из селезенок мышей инбредной линии AKR/JY, включающий обработку кожи антисептическим средством, спленэктомию, декапсуляцию и гомогенизацию селезенки, фильтрацию полученной взвеси и ее разбавление в стерильной охлажденной искусственной внеклеточной среде до необходимой концентрации лейкозных клеток, фасование приготовленной суспензии в ампулы для хранения и транспортировки, отличающийся тем, что декапсуляцию, измельчение и гомогенизацию пульпы селезенки производят в растворе полиглюкина, содержащем 25,72 мг/л озона и охлажденном до (24,0±1,0)°С, фильтрацию и разбавление суспензии лейкозных клеток выполняют в растворе полиглюкина, содержащем 25,72 мг/л озона и охлажденном до (15,0±2,0)°С.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое техническое решение относится к области медицины, а именно технологии выделения и приготовления суспензии лейкозных клеток из селезенок мышей высоколейкозных линий, и может быть использовано в экспериментальной онкогематологии для сохранности редко встречающихся субтипов лейкоза мышей.

Положительные результаты перевивки лейкозов возможны только при условии максимальной сохранности исходного уровня специфической функциональной полноценности трансплантируемых лейкозных клеток. Наличие микроорганизмов и их токсинов, а также тканевых агрегатов в перевиваемом материале вызывает повреждение перевивных лейкозных клеток, снижает качество приготовленной суспензии и приводит к отрицательным результатам перевивки определенного вида (субтипа) лейкоза мыши.

Известен способ выделения и приготовления суспензии лейкозных клеток из селезенок линейных мышей, при котором все манипуляции проводят в асептических условиях, для чего перед вскрытием брюшной стенки кожу и волосяной покров в проекции лапаротомного разреза обрабатывают антисептическим средством (спирт, йод) [Практикум по иммунологии. Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / И.А.Кондратьева [и др.]- 2-е изд., испр. и доп. - М.: Издат. Центр «Академия», 2004. - с.17-24]. Данный способ не обеспечивает полного обеззараживания инфекции на теле подопытного животного, которая попадает в суспензию перевивных лейкозных клеток и подавляет (частично или полностью) их специфическую функциональную полноценность.

Известен способ выделения лейкозных клеток в охлажденной искусственной внеклеточной среде стерильного физраствора [Раушенбах М.О. Экспериментальные исследования лейкозов / М.О.Раушенбах. - М.: Издат.«Медгиз», 1956. - 184 с.]. Недостатком данной среды является способность вызывать необратимую агрегацию лейкозных клеток и фрагментов тканей с образованием устойчивых скоплений, а также отсутствие в ее составе антисептиков и консервантов, способных дезинфицировать и защитить перевивные клетки от необратимых повреждений в процессе длительного пребывания вне организма при положительной температуре.

В современной медицине для повышения антимикробной активности организма все шире используют озонированные официнальные жидкости. Это связано с дезинфицирующим, дезинтоксикационным, бактериостатическим, бактерицидным, вирусоцидным и фунгицидным действием озона («Методики применения озона в медицине» (методические рекомендации) И.П.Шмакова и др. Киев, 2004 г., с.-23). Озонированный раствор полиглюкина, который обладает дезинфицирующим и дезагрегирующим действием, а также свойствами клеточного консерванта, в технологии выделения и приготовления суспензии лейкозных клеток не применялся (Исследование бактерицидных свойств и стерильности озонированных официнальных жидкостей / А.И. Корабельников, А.Е.Тажиева, И.А.Корабельникова // Приложение к НМЖ Озонотерапия. - 2003. - С.41; Криоконсерванты / А.М.Белоус, М.И.Шраго, Н.С.Пушкарь. - К.: Наук. думка, 1974. - 200 с.; Лекарственные средства (пособие для врачей) / М.Д.Машковский. - М.: Издат. «Новая волна», 14 изд, 2-й том. - 2000).

За прототип предлагаемого изобретения выбран известный способ выделения и приготовления суспензии лейкозных клеток из селезенок линейных мышей, включающий обработку кожи антисептическим средством, спленэктомию, декапсуляцию и гомогенизацию селезенки, фильтрацию полученной взвеси и ее разбавление в стерильной охлажденной искусственной внеклеточной среде до необходимой концентрации лейкозных клеток, фасование приготовленной суспензии в ампулы для хранения и транспортировки. После приготовления суспензии перевивной материал должен быть использован в кротчайшие сроки или заморожен (Практикум по иммунологии. Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / И.А.Кондратьева [и др.] - 2-е изд., испр. и доп. - М.: Издат. Центр «Академия», 2004. - с.17-19). Этот способ является наиболее близким техническим решением к предлагаемому. Недостатком известного способа является то, что большинство выделенных из селезенок лейкозных клеток вне организма теряют специфическую функциональную полноценность - способность перевивать определенный вид (субтип) лейкоза здоровой мыши высоколейкозной линии.

Задачей предлагаемого изобретения является обеспечение максимальной сохранности специфической функциональной полноценности трансплантируемых лейкозных клеток.

Поставленная задача решается тем, что на этапах выделения и приготовления суспензии перевивных лейкозных клеток используют охлажденный озонированный раствор полиглюкина.

Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как в процессе проведения патентно-информационные исследований не выявлено источников информации, порочащих новизну предлагаемого способа.

Предлагаемый нами способ заключается в поэтапном выделении из селезенок линейных мышей и приготовлении суспензии лейкозных клеток в охлажденном озонированном растворе полиглюкина.

Проведенные нами исследования показывают, что озонированный раствор полиглюкина сохраняет биологические свойства большинства выделенных из селезенок мышей лейкозных клеток и высокий положительный результат перевивания определенного вида (субтипа) лейкоза, в то время как применение в тех же условиях физраствора без антисептической поддержки озона и отсутствии клеточного консерванта не сохраняет биологические свойства большинства перевивных клеток с последующим высоким отрицательным результатом моделирования определенного вида (субтипа) лейкоза мышей.

Экспериментальные исследования выполнены на базе ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росмедтехнологий».

Эффективность способа проверена в 16 опытах на мышах инбредной линии AKR/JY. Результаты исследования приведены в таблице.

Выводы

Выделение и приготовление суспензии лейкозных клеток предлагаемым способом в охлажденном озонированном растворе полиглюкина сохраняет биологические свойства большинства лейкозных клеток вне организма при положительной температуре длительное время и обеспечивает высокий процент перевивания определенного вида (субтипа) лейкоза мыши инбредной линии.

Пример.

Способ осуществляют в асептических условиях в стерильной маске, стерильных перчатках, стерильными глазными хирургическими инструментами (ножницы, пинцеты, скальпели), на стерильном препаровальном столике с иглами, стерильным гомогенизатором тканей, использованием 4-слойного капронового фильтра, стерильной конической пробирки объемом 10 мл, официнального препарата «Полиглюкин» в 400 мл стеклянном флаконе, содержащего 25,72 мг/л озона, игл-воздушек, системы для переливания крови, кровезаменителей и инфузионных растворов однократного применения, водяного термометра, открытого сверху сосуда, в который из смесителя подается проточная вода с температурой от 24,0±1,0°С до 15,0±2,0°С, генератора озона с системой полимерных трубок и деструктором озона, ампул объемом 5-10 мл для фасовки приготовленной суспензии лейкозных клеток.

Подготовительные этапы.

Озонирование раствора полиглюкина. Метод осуществляют следующим образом: генератор озона подключают к источнику кислорода и в электросеть, устанавливают на панели прибора концентрацию озона в озоно-кислородной смеси (ОКС) на выходе из озонатора от 10 до 30 мг/л. В пробку устанавливают три иглы, через одну из которых подается ОКС, второй забирается озонированный полиглюкин (ОП), а через третью отработанная ОКС удаляется

Таблица Сравнительные результаты перевивки суспензии лейкозных клеток, выделенных и приготовленных известным и предлагаемым способами
№ №	Вид лейкоза	Результат перевивки суспензии лейкозных клеток, выделенных и приготовленных различными способами
Способ-прототип	Предложенный способ
1.	миелобластный лейкоз	отрицательный	миелобластный лейкоз
2.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
3.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
4.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
5.	пролимфоцитарный лейкоз	отрицательный	пролимфоцитарный лейкоз
6.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный	отрицательный
7.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
8.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
9.	миелобластный лейкоз	отрицательный	миелобластный лейкоз
10.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
11.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный
12.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
13.	В-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный	В-клеточный лимфобластный лейкоз
14.	Т-клеточный лимфобластный лейкоз	отрицательный	Т-клеточный лимфобластный лейкоз
15.	В-клеточный лимфобластный лейкоз	В-клеточный лимфобластный лейкоз	В-клеточный лимфобластный лейкоз
16.	пролимфоцитарный лейкоз	отрицательный	пролимфоцитарный лейкоз

в деструктор. Конец длинной иглы устанавливают над дном флакона. Барботаж полиглюкина ОКС начинают за 15 мин до эксперимента и затем продолжают все время инфузии, что обеспечивает постоянство КО в ОП. Эффективность антимикробной активности ОП зависит от концентрации озона в растворе. В ходе исследований пробы ОП создавали вокруг внесенных «музейных» культур как грамположительной, так и грамотрицательной микрофлоры зоны стерильности диаметром от 8 до 10 мм, в среднем 9,4±0,7 мм, то есть оказывали отчетливый бактерицидный эффект и стерильность через 24 часа.

Охлаждение флакона с раствором полиглюкина. Температура ОП во время эксперимента снижается от 24,0±1,0°С до 15,0±2,0°С. Для этого флакону с полиглюкином придают положение «пробкой вверх» и устанавливают в стакан, в который из смесителя подается проточная вода установленной температуры.

После усыпления (эфир, хлороформ) половозрелой мыши (массой 18-22 г, температурой тела 38±1°С) с развитым лейкозом (от 4 до 10 мес от начала опыта) тушку кладут на препаровальный столик на правый бок, фиксируют к столику стерильными иглами, затем спиртом обрабатывают левый бок. В районе «талии» животного ножницами делают поперечный разрез кожи длиной 2-2,5 см слева от середины туловища, затем разрез мышц, пинцетом извлекают из брюшной полости селезенку темно-бордового цвета массой 700±300 мг, отрезают ее соединительные тяжи и помещают в стерильную чашку Петри, в которую по полимерной магистрали капельно поступает ОП, охлажденный до 24,0±1,0°С. В этих условиях селезенку освобождают от остатков соединительной ткани (декапсулируют), после чего пульпу селезенки ножницами фрагментируют на мелкие кусочки и гомогенизируют. Гомогенизат фильтруют через один или два капроновых 4-слойных фильтра в пробирку, в которую по полимерной магистрали капельно поступает озонированный раствор полиглюкина, охлажденный до 15,0±2,0°С и разбавляют им до концентрации от 1×10⁶ до 1×10 ⁷ кл/мл. После этого приготовленную суспензию лейкозных клеток фасуют в ампулы для хранения и транспортировки. Сохранность специфической функциональной полноценности трансплантируемых лейкозных клеток определяют по результатам перевивки заданного ида (субтипа) спонтанного лейкоза.

Проведенные исследования показывают, что из 32 случаев перевивки заданного вида лейкоза положительные результаты при использовании способа-прототипа получены в 3 или 18,75% случаях, тогда как применение предложенного способа дало положительные результаты в 14 или 87,5% случаях. Различия достоверны (Р<0,05).

Предлагаемая технология выделения и приготовления суспензии лейкозных клеток из селезенок линейных мышей дает стабильный высокий положительный результат перевивки заданного субтипа лейкоза и может быть использована в учреждениях медико-биологического профиля в экспериментальной онкогематологии для сохранности редко встречающихся субтипов лейкоза мышей.