олигонуклеотид с двойственной специфичностью и способы, в которых он используется

Формула изобретения

1. Олигонуклеотид с двойной специфичностью для синтеза молекулы нуклеиновой кислоты в реакции удлинения по матрице, который представлен следующей общей формулой: 5'-X_p-Y_q-Z _r-3',

где Х_р представляет 5'-участок специфичности с высокой Т_пл, имеющий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, по существу комплементарную участку матричной нуклеиновой кислоты, с которым ему надлежит гибридизоваться, Y_q представляет разделяющий участок, содержащий по меньшей мере три универсальных основания, Z _r представляет 3'-участок специфичности с низкой Т _пл, имеющий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, по существу комплементарную участку матричной нуклеиновой кислоты, с которым ему надлежит гибридизоваться, p, q и r представляют число нуклеотидов, причем p представляет собой целое число от 15 до 40, q представляет собой целое число от 3 до 10 и г представляет собой целое число от 3 до 15, а X, Y и Z - это дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды; Т_пл 5'-участка специфичности с высокой Т_пл выше, чем Т_пл 3'-участка специфичности с низкой Т_пл, разделяющий участок имеет из трех участков самую низкую Т_пл, причем Т_пл 5'-участка специфичности с высокой Т_пл находится в пределах от 40 до 80°С, Т_пл 3'-участка специфичности с низкой Т_пл находится в пределах от 10 до 40°С, а разделяющий участок имеет Т_пл в пределах от 3 до 15°С; разделяющий участок образует подобную пузырьку структуру без спаривания оснований при условиях, когда 5'-участок специфичности с высокой Т_пл и 3'-участок специфичности с низкой Т_пл отжигаются с матричной нуклеиновой кислотой, обеспечивая разделение 5'-участка специфичности с высокой Т_пл и 3'-участка специфичности с низкой Т_пл, посредством чего специфичность отжига олигонуклеотида определяется двояко 5'-участком специфичности с высокой Т _пл и 3'-участком специфичности с низкой Т_пл , так что повышается общая специфичность отжига олигонуклеотида.

2. Олигонуклеотид с двойной специфичностью по п.1, отличающийся тем, что универсальное основание в разделяющем участке выбрано из группы, состоящей из дезоксиинозина, инозина, 7-деаза-2'-дезоксиинозина, 2-аза-2'-дезоксиинозина, 2'-ОМе инозина, 2'-F-инозина, дезокси-3-нитропиррола, 3-нитропиррола, 2'-ОМе 3-нитропиррола, 2'-F-3-нитропиррола, 1-(2'-дезокси- -D-рибофуранозил)-3-нитропиррола, дезокси-5-нитроиндола, 5-нитроиндола, 2'-ОМе 5-нитроиндола, 2'-F-5-нитроиндола, дезокси-4-нитробензимидазола, 4-нитробензимидазола, дезокси-4-аминобензимидазола, 4-аминобензимидазола, дезокси-небуларина, 2'-F-небуларина, 2'-F-4-нитробензимидазола, ПНК-5-нитроиндола, ПНК-небуларина, ПНК-инозина, ПНК-4-нитробензимидазола, ПНК-3-нитропиррола, морфолин-5-нитроиндола, морфолин-небуларина, морфолин-инозина, морфолин-4-нитробензимидазола, морфолин-3-нитропиррола, фосфоамидат-5-нитроиндола, фосфоамидат-небуларина, фосфоамидат-инозина, фосфоамидат-4-нитробензимидазола, фосфоамидат-3-нитропиррола, 2'-О-метоксиэтил-инозина, 2'-О-метоксиэтил-небуларина, 2'-О-метоксиэтил-5-нитроиндола, 2'-О-метоксиэтил-4-нитро-бензимидазола, 2'-О-метоксиэтил-3-нитропиррола и их комбинаций.

3. Олигонуклеотид с двойной специфичностью по п.2, отличающийся тем, что универсальным основанием является дезоксиинозин, 1-(2'-дезокси-( -D-рибофуранозил)-3-нитропиррол или 5-нитроиндол.

4. Олигонуклеотид с двойной специфичностью по п.3, отличающийся тем, что универсальным основанием является дезоксиинозин.

5. Олигонуклеотид с двойной специфичностью по п.1, отличающийся тем, что разделяющий участок содержит прилегающие друг к другу нуклеотиды, имеющие универсальные основания.

6. Олигонуклеотид с двойной специфичностью по п.1, отличающийся тем, что 5'-участок специфичности с высокой Т_пл длиннее, чем 3'-участок специфичности с низкой Т_пл.

7. Олигонуклеотид с двойной специфичностью по п.1, отличающийся тем, что 3'-участок специфичности с низкой Т_пл имеет гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, полностью комплементарную участку на матричной нуклеиновой кислоте, с которым ему надлежит гибридизоваться.

8. Олигонуклеотид с двойной специфичностью по п.1, отличающийся тем, что p представляет собой целое число от 15 до 25.

9. Способ синтеза молекулы нуклеиновой кислоты с использованием олигонуклеоида с двойной специфичностью по любому из пп.1-8 в реакции удлинения по матрице, включающий следующие этапы:

(а) отжиг олигонуклеотида с двойной специфичностью с молекулой матричной нуклеиновой кислоты, причем разделяющий участок образует подобную пузырьку структуру без спаривания оснований при условиях, когда 5'-участок специфичности с высокой Т_пл и 3'-участок специфичности с низкой Т_пл отжигаются с матричной нуклеиновой кислотой, причем отжиг производится в условиях, когда 5'-участок специфичности с высокой Т _пл и 3'-участок специфичности с низкой Т_пл отжигаются с матричной нуклеиновой кислотой, причем этот отжиг осуществляют при температуре от 40 до 75°С; и

(б) удлинение олигонуклеотида с двойной специфичностью, чтобы синтезировать молекулу нуклеиновой кислоты, комплементарную матричной нуклеиновой кислоте.

10. Способ согласно п.9, где синтез последовательности целевой нуклеиновой кислоты достигается повторением процесса реакции удлинения по матрице, в которой за этапами отжига и удлинения олигонуклеотида с двойной специфичностью следует этап денатурации.

11. Способ избирательной амплификации последовательности целевой нуклеиновой кислоты с ДНК или смеси нуклеиновых кислот, который включает амплификацию последовательности целевой нуклеиновой кислоты путем проведения по меньшей мере двух циклов отжига праймера, удлинения праймера и денатурации с использованием набора праймеров, который содержит по меньшей мере один олигонуклеотид с двойной специфичностью по любому из пп.1-8; при этом разделяющий участок образует подобную пузырьку структуру без спаривания оснований при условиях, когда 5'-участок специфичности с высокой Т _пл и 3'-участок специфичности с низкой Т_пл отжигаются с целевой нуклеиновой кислотой; при этом отжиг в реакции амплификации производится в условиях, когда 5'-участок специфичности с высокой Т_пл и 3'-участок специфичности с низкой Т_пл отжигаются с матричной нуклеиновой кислотой, причем этот отжиг осуществляют при температуре от 40 до 75°С.

12. Способ согласно п.11, отличающийся тем, что амплификацию проводят в соответствии с полимеразной цепной реакцией.

13. Способ одновременной амплификации двух или более целевых нуклеотидных последовательностей с использованием в одной реакции двух или более пар праймеров, который включает амплификацию целевых нуклеотидных последовательностей путем проведения по меньшей мере двух циклов отжига праймеров, удлинения праймеров и денатурации, с использованием двух или более пар праймеров, где по меньшей мере один праймер из пары праймеров представляет собой олигонуклеотид с двойной специфичностью по любому из пп.1-8, причем разделяющий участок образует подобную пузырьку структуру без спаривания оснований при условиях, когда 5'-участок специфичности с высокой Т _пл и 3'-участок специфичности с низкой Т_пл отжигаются с целевой нуклеотидной последовательностью; при этом отжиг в реакции амплификации производится в условиях, когда 5'-участок специфичности с высокой Т_пл и 3'-участок специфичности с низкой Т_пл отжигаются с целевой нуклеотидной последовательностью, причем этот отжиг осуществляют при температуре от 40 до 75°С.

14. Способ согласно п.13, отличающийся тем, что амплификацию проводят в соответствии с полимеразной цепной реакцией.

15. Способ секвенирования молекулы целевой нуклеиновой кислоты с использованием олигонуклеотида с двойной специфичностью по любому из пп.1-8 из ДНК или смеси нуклеиновых кислот, который включает следующие этапы:

(а) синтез молекулы комплементарной нуклеиновой кислоты, которая комплементарна молекуле нуклеиновой кислоты, которую следует секвенировать, путем проведения по меньшей мере двух циклов отжига праймера, удлинения праймера и денатурации, с использованием в качестве секвенирующего праймера олигонуклеотида с двойной специфичностью; причем разделяющий участок образует подобную пузырьку структуру без спаривания оснований при условиях, когда 5'-участок специфичности с высокой Т_пл и 3'-участок специфичности с низкой Т_пл отжигаются с молекулой целевой нуклеиновой кислоты; при этом отжиг в реакции синтеза производится в условиях, когда 5'-участок специфичности с высокой Т_пл и 3'-участок специфичности с низкой Т_пл отжигаются с молекулой матричной нуклеиновой кислоты, причем этот отжиг осуществляют при температуре от 40 до 75°С; и

(б) определение нуклеотидной последовательности синтезированной молекулы комплементарной нуклеиновой кислоты.

16. Способ согласно п.15, отличающийся тем, что подлежащая секвенированию молекула целевой нуклеиновой кислоты содержится в геномной ДНК или в популяции к ДНК.

17. Способ детектирования молекулы нуклеиновой кислоты с генетическим разнообразием в реакции удлинения по матрице олигонуклеотида с двойной специфичностью по любому из пп.1-8, который включает следующие этапы:

(а) отжиг олигонуклеотида с двойной специфичностью с молекулой матричной нуклеиновой кислоты, причем разделяющий участок образует подобную пузырьку структуру без спаривания оснований при условиях, когда 5'-участок специфичности с высокой Т_пл и 3'-участок специфичности с низкой Т_пл отжигаются с матричной нуклеиновой кислотой; при этом отжиг производится в условиях, когда 5'-участок специфичности с высокой Т_пл и 3'-участок специфичности с низкой Т_пл отжигаются с матричной нуклеиновой кислотой, когда 5'-участок специфичности с высокой Т_пл и/или 3'-участок специфичности с низкой Т_пл имеют одно или более чем одно основание, не подходящее для спаривания с его участком-мишенью; причем этот отжиг осуществляют при температуре от 40 до 75°С;

(б) удлинение олигонуклеотида с двойной специфичностью, чтобы синтезировать молекулу нуклеиновой кислоты, комплементарную матрице;

(в) детектирование наличия удлинения по матрице олигонуклеотида с двойной специфичностью.

18. Способ согласно п.17, где синтез последовательности целевой нуклеиновой кислоты достигается повторением процесса реакции удлинения по матрице, в которой за этапами отжига и удлинения олигонуклеотида с двойной специфичностью следует этап денатурации.

19. Способ согласно п.17, где молекулой нуклеиновой кислоты с генетическим разнообразием является нуклеиновая кислота вируса, обладающего генетическим разнообразием.

20. Способ детектирования целевой нуклеотидной последовательности в образце нуклеиновой кислоты с помощью реакции удлинения по матрице олигонуклеотида с двойной специфичностью по любому из пп.1-8, который включает следующие этапы:

(а) удлинение олигонуклеотида с двойной специфичностью как зонда, иммобилизованного на подложке, включающее по меньшей мере один цикл гибридизации, удлинения по матрице и денатурации, причем гибридизацию осуществляют путем приведения олигонуклеотида с двойной специфичностью в контакт с образцом нуклеиновой кислоты, где разделяющий участок образует подобную пузырьку структуру без спаривания оснований при условиях, когда 5'-участок специфичности с высокой Т_пл и 3'-участок специфичности с низкой Т_пл отжигаются с целевой нуклеотидной последовательностью; при этом гибридизация производится в условиях, когда 5'-участок специфичности с высокой Т_пл и 3'-участок специфичности с низкой Т_пл гибридизуются с целевой нуклеоиновой кислотой, причем этот отжиг осуществляют при температуре от 40 до 75°С; и

(б) анализ наличия удлинения по матрице.

21. Способ получения олигонуклеотида с двойной специфичностью, включающий следующие этапы:

(а) выбор последовательности целевой нуклеиновой кислоты;

(б) конструирование последовательности олигонуклеотида, содержащего (i) гибридизующуюся последовательность, по существу комплементарную целевой нуклеиновой кислоте и (ii) разделяющий участок, содержащий по меньшей мере три универсальных основания, так что разделяющий участок внедряется в гибридизующуюся последовательность, с получением в этом олигонуклеотиде трех участков; и

(в) определение положения разделяющего участка в этом олигонуклеотиде, чтобы обеспечить для участка, расположенного в 5'-направлении от разделяющего участка, более высокую Т _пл; чем у участка, расположенного в 3'-направлении от разделяющего участка, и обеспечить для разделяющего участка наиболее низкую Т_пл среди трех участков, таким образом приводя к олигонуклеотиду, имеющему три различных участка, отличающихся друг от друга величинами Т_пл, из которых (i) 5'-участок специфичности с высокой Т_пл этого олигонуклеотида имеет гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, по существу комплементарную целевой нуклеиновой кислоте, (ii) 3'-участок специфичности с низкой Т_пл этого олигонуклеотида имеет гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, по существу комплементарную целевой нуклеиновой кислоте; и (iii) разделяющий участок этого олигонуклеотида между 5'-участком специфичности с высокой Т_пл и 3'-участком специфичности с низкой Т_пл, содержит по меньшей мере три универсальных основания; Т_пл 5'-участка специфичности с высокой Т_пл выше, чем Т_пл 3'-участка специфичности с низкой Т_пл, и разделяющий участок имеет самую низкую Т _пл среди трех участков, посредством чего специфичность отжига олигонуклеотида с целевой нуклеиновой кислотой определяется двояко и 5'-участком специфичности с высокой Т_пл , и 3'-участком специфичности с низкой Т_пл; где число нуклеотидов в 5'-участке специфичности с высокой Т _пл составляет от 15 до 40, число нуклеотидов в 3'-участке специфичности с низкой Т_пл составляет от 3 до 15, и число нуклеотидов в разделяющем участке составляет от 3 до 10; и Т_пл 5'-участка специфичности с высокой Т _пл находится в диапазоне от 40 до 80°С, Т_пл 3'-участка специфичности с низкой Т_пл находится в диапазоне от 10 до 40°С, а Т_пл разделяющего участка находится в диапазоне от 3 до 15°С.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что универсальное основание в разделяющем участке выбрано из группы, состоящей из дезоксиинозина, инозина, 7-деаза-2'-дезоксиинозина, 2-аза-2'-дезоксиинозина, 2'-ОМе инозина, 2'-F инозина, дезокси-3-нитропиррола, 3-нитропиррола, 2'-ОМе 3-нитропиррола, 2'-F3-нитропиррола, 1-(2'-дезокси- -D-рибофуранозил)-3-нитропиррола, дезокси-5-нитроиндола, 5-нитроиндола, 2'-ОМе 5-нитроиндола, 2'-F 5-нитроиндола, дезокси-4-нитробензимидазола, 4-нитробензимидазола, дезокси-4-аминобензимидазола, 4-аминобензимидазола, дезокси-небуларина, 2'-F-небуларина, 2'-F-4-нитробензимидазола, ПНК-5-нитроиндола, ПНК-небуларина, ПНК-инозина, ПНК-4-нитробензимидазола, ПНК-3-нитропиррола, морфолин-5-нитроиндола, морфолин-небуларина, морфолин-инозина, морфолин-4-нитробензимидазола, морфолин-3-нитропиррола, фосфоамидат-5-нитроиндола, фосфоамидат-небуларина, фосфоамидат-инозина, фосфоамидат-4-нитробензимидазола, фосфоамидат-3-нитропиррола, 2'-О-метоксиэтил-инозина, 2'-О-метоксиэтил-небуларина, 2'-О-метоксиэтил-5-нитроиндола, 2'-O-метоксиэтил-4-нитро-бензимидазола, 2'-O-метоксиэтил-3-нитропиррола и их комбинаций.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что универсальным основанием является дезоксиинозин, 1-(2'-дезокси- -D-рибофуранозил)-3-нитропиррол или 5-нитроиндол.

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что универсальным основанием является дезоксиинозин.

25. Способ по п.21, отличающийся тем, что разделяющий участок содержит прилегающие друг к другу нуклеотиды, имеющие универсальные основания.

26. Способ по п.21, отличающийся тем, что 5'-участок специфичности с высокой Т_пл длиннее, чем 3'-участок специфичности с низкой Т_пл.

27. Способ по п.21, отличающийся тем, что 3'-участок специфичности с низкой Т_пл имеет гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, полностью комплементарную участку на матричной нуклеиновой кислоте, с которым ему надлежит гибридизоваться.

28. Способ по п.21, отличающийся тем, что число нуклеотидов в 5'-участке специфичности с высокой Т_пл составляет от 15 до 25.

Описание изобретения к патенту

Текст описания приведен в факсимильном виде.