штамм бактерии arthrobacter oxydans - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы aoxi
Классы МПК: | C12N1/21 модифицированные введением чужеродного генетического материала |
Автор(ы): | Чернухин Валерий Алексеевич (RU), Беличенко Ольга Алексеевна (RU), Тарасова Галина Владимировна (RU), Гончар Данила Александрович (RU), Акишев Александр Григорьевич (RU), Дедков Владимир Сергеевич (RU), Михненкова Наталья Александровна (RU), Дегтярев Сергей Харитонович (RU) |
Патентообладатель(и): | Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2009-05-15 публикация патента:
20.09.2010 |
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к штамму бактерий Arthrobacter oxydans 25K. Штамм бактерий Arthrobacter oxydans 25К выделяют из почвы. Данный штамм обеспечивает получение сайт-специфической эндонуклеазы Aoxl, узнающей и расщепляющей обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5'-GGCC-3/3'-CCGG-5', в которых два центральных цитозина метилированы в положении С5, с образованием четырехнуклеотидных 5'-выступающих концов. Представленное изобретение позволяет получить бактериальный штамм, продуцирующий сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5'-^GG (m5C)C-3/3'-C(m5C)GG^-5'. 2 ил.
Формула изобретения
Штамм бактерий Arthrobacter oxydans 25K KKM НПО «СибЭнзим» 7М89 - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5'-GGCC-3'/3'-CCGG-5', в которых два центральных цитозина метилированы в положении С5, с образованием четырехнуклеотидных 5'-выступающих концов.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма, используемого для выделения новой сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей обе цепи метилированной нуклеотидной последовательности ДНК 5'-^GG (m5C)C-3', где m5C - 5-метилцитозин.
Эндонуклеаза, обладающая данной специфичностью, может быть использована для сайт-специфического гидролиза ДНК, содержащей С5-метилцитозиновые основания.
К настоящему времени известны несколько сайт-специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих ДНК, только при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозина.
Известен штамм Glacial ice bacterium I, продуцирующий эндонуклеазу GlaI, которая узнает и расщепляет метилированную нуклеотидную последовательность 5'-G(m5C) GC-3', где m5C - 5-метилцитозин [1].
Известны штаммы Bacillus simplex 23 [2], Bacillus subtilis 230 [3] и Glacial ice bacterium 24 [4], продуцирующие сайт-специфические эндонуклеазы BlsI, BisI и Glul, которые узнают и расщепляют метилированную нуклеотидную последовательность 5'-GCNGC-3', при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозиновых оснований.
Недостатком известных штаммов является то, что продуцируемые ими эндонуклеазы рестрикции не способны узнавать и расщеплять обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5'-^GG (m5C)C-3'/3'-C(m5C)GG^-5'.
Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом является штамм Haemophilus aegyptius, продуцирующий рестриктазу HaeIII, которая узнает последовательность нуклеотидов 5'-GGCC-3' и расщепляет ее перед цитозином с образованием тупых концов [5]. Недостатком известного штамма является то, что продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза не расщепляет узнаваемую последовательность, если центральные цитозины метилированы в положении С5.
Однако в настоящее время не описаны штаммы бактерий, являющихся продуцентами сайт-специфических эндонуклеаз и узнающих ДНК 5'-GGCC-3' только при наличии в ней С5-метилцитозинов.
Технической задачей изобретения является получение бактериального штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5'-^GG (m5C)C-3'/3'-C(m5C)GG^-5'.
Поставленная техническая задача решается путем получения штамма Arthrobacter oxydans 25K - продуцента сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей метилированную последовательность нуклеотидов:
5'- G G(m5C)C-3'
3'-С(m5C) GG -5',
где m5C - 5-метилцитозин (стрелками указаны позиции расщепления ДНК).
Предлагаемый штамм выделен из природного материала (почвы) в результате целенаправленного систематического поиска.
Полученный штамм Arthrobacter oxydans 25K депонирован в Коллекции культур микроорганизмов НПО "СибЭнзим" под регистрационным номером 7М89, а продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза названа Aoxl.
Штамм Arthrobacter oxydans 25K характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические признаки. На агаризованной среде Луриа-Бертрани (ЛБ) образует оранжево-красные, гладкие, блестящие, полупрозрачные, выпуклые, круглые колонии 1-2 мм в диаметре. В жидкой питательной среде со встряхиванием образует гомогенную муть. Клетки палочковидные, размером 0,3-0,7 мкм в диаметре и 1-3 мкм в длину. Спор не образуют. Грамположительные.
Физиолого-биохимические признаки. Облигатно аэробные. Каталазоположительные. Растут при температуре от 4 до 33°С, при pH от 6 до 9.
Штамм идентифицирован на основе анализа морфологических и биохимических свойств по определителю [6], а также с помощью анализа первичной структуры фрагмента 16S РНК по программе BLAST [7] как вид бактерии Arthrobacter oxydans 25K. Продуцируемая заявляемым штаммом сайт-специфическая эндонуклеаза Aoxl названа согласно номенклатуре [8].
Хранение штамма осуществляется в лиофильно высушенном состоянии или в растворе 30% глицерина при температуре - 60°С.
Для культивирования штамма применяют среду следующего состава (г/л): пептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 5. Культивирование проводят при 28°С с аэрацией до достижения стационарной стадии роста.
Выход целевого фермента составляет 100 ед/г сырой биомассы.
Полученная сайт-специфическая эндонуклеаза Aoxl (рестриктаза) характеризуется следующими свойствами:
1. Узнает и расщепляет метилированную последовательность нуклеотидов 5'-^GG (m5C)C-3'/3'-C(m5C)GG^-5', где m5C - 5-метилцитозин.
2. Расщепляет связи перед первым гуанином в обеих цепях узнаваемой последовательности.
3. Не расщепляет вышеприведенную последовательность, не содержащую двух центральных С5-метилцитозиновых оснований.
4. Оптимальная температура действия 37°С.
5. Оптимальное значение pH для действия фермента 7,5-8,5.
6. Оптимальная концентрация соли при расщеплении ДНК 50-100 мМ NaCl.
7. Для проявления активности AoxI требуются ионы Mg2+, оптимальная концентрация - 5-10 мМ.
Определяющим отличием предлагаемого штамма от всех известных в настоящее время штаммов-продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз является то, что данный штамм продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи метилированной нуклеотидной последовательности ДНК 5'-^GG(m5C)C-3'/3'-C(m5C)GG^-5', где m5C - 5-метилцитозин. Таким образом, сайт-специфическая эндонуклеаза AoxI представляет собой новый, не имеющий аналогов фермент.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей вышеназванную последовательность нуклеотидов в указанной позиции, никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Выращивание штамма и выделение фермента
Для получения биомассы клетки штамма-продуцента переносят на агаризованную среду ЛБ в чашку Петри и инкубируют в течение ночи при 28°С. Свежевыращенные колонии переносят стерильной бактериологической петлей в колбы, содержащие жидкую питательную среду ЛБ, и культивируют на качалках при 28°С при перемешивании - 150 об/мин, до достижения стационарной фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин при 4°С на центрифуге "Beckman" (США) в роторе JA-10. Выход биомассы составляет 5 г/л среды. Дезинтеграцию клеток, выделение и очистку фермента проводят по известной методике [9].
Пример 2
Сайт-специфический гидролиз С5-метилированной плазмидной ДНК эндонуклеазой AoxI
Расщепление ДНК проводят в оптимальных условиях (37°С, реакционный буфер - 10 мМ TrisHCl, pH 8.0, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT) в течение 60 мин. Продукты расщепления плазмидной ДНК разделяют путем электрофореза в 1% агарозном геле.
В качестве субстратов для выявления специфичности расщепления используют различные метилированные и неметилировнные плазмидные и фаговые ДНК: фагов лямбда и Т7, плазмид pHspAI1 (содержит метилированные последовательности 5'-G(m5C)GC-3 /3 -CG(m5C)G-5' [1]), pFsp4HI3 (содержит метилированные последовательности 5'-G(5mC)NGC-3'/3'-CGN(5mC)G-5' [4]) и полученной нами плазмиды pMHaeIII (содержит метилированные последовательности 5'-GG(5mC)C-3'/3'-C(5mC)GG-5').
Плазмида pMHaeIII была получена путем встраивания в плазмиду pUC19 ПЦР-фрагмента (992 п.н.) геномной ДНК Haemophilus aegyptius no сайтам гидролиза эндонуклеаз рестрикции PstI и BamHI. Данный ПЦР-фрагмент был получен с использованием следующих праймеров (Р1 и Р2):
Р1: 5'-GACCGCACTTATAGAAATCAATTTGTTTAG-3'
Р2: 5'-TGCTCTGCCAGGATCCTTACTTTTATTTGAC-3'
Данный ПЦР-фрагмент включает ген ДНК-метилтрансферазы М.HaeIII, метилирующей первый цитозин в обеих цепях последовательности 5'-GGCC-3' в положении С5.
Благодаря встроенному гену, кодирующему М.HaeIII плазмида pMHaeIII, содержит метилированные последовательности 5'-GG(5mC)C-3'/3'-C(5mC)GG-5'.
На фиг.1 представлена электрофореграмма продуктов расщепления ДНК фагов и Т7, а также плазмид pFsp4HI3, pHspAI1, pMHaeIII и pUC19 эндонуклеазой AoxI.
Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.1:
1 - ДНК фага лямбда;
2 - ДНК фага лямбда, обработанная эндонуклеазой AoxI;
3 - ДНК фага Т7;
4 - ДНК фага Т7, обработанная эндонуклеазой AoxI;
5 - ДНК pFsp4HI3;
6 - ДНК pFsp4HI3, обработанная эндонуклеазой AoxI.
7 - ДНК pHspAI1;
8 - ДНК pHspAI1, обработанная эндонуклеазой AoxI;
9 - ДНК pMHaeIII;
10 - ДНК pMHaeIII, обработанная рестриктазой HaeIII;
11 - ДНК pMHaeIII, обработанная эндонуклеазой AoxI;
12 - ДНК pUC19;
13 - ДНК pUC19, обработанная рестриктазой AoxI;
14 - ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой HaeIII;
М - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb (производство НПО СибЭнзим).
Как видно из фиг.1, AoxI не расщепляет ДНК фагов лямбда и Т7, а также ДНК плазмид pHspAI, pFsp4HI3 и pUC19, в которых отсутствует метилированная последовательность 5'-GG(5mC)C-3'/5'-GG(5mC)C-3'.
Рестриктаза HaeIII расщепляет неметилированные последовательности 5'-GGCC-3' в плазмиде pUC19. Теоретически рассчитанные длины фрагментов ДНК при этом расщеплении: 587, 458, 434, 298, 267, 257, 174, 102, 80, 18, 11 п.н.
HaeIII не расщепляет плазмиду pMHaeIII вследствие метилирования центральных цитозинов в последовательности 5'-GGCC-3'. В противоположность этому эндонуклеаза AoxI, наоборот, не расщепляет ДНК pUC19, но расщепляет pMHaeIII. Теоретически рассчитанные длины фрагментов ДНК, образующиеся при полном расщеплении плазмиды pMHaeIII по последовательности 5'-GGCC-3': 1283, 587, 458, 434, 298, 267, 257, 174, 102, 80, 18, 11 п.н., что соответствует полученной картине гидролиза ДНК.
Пример 3
Определение позиции гидролиза ДНК эндонуклеазой AoxI
Для подтверждения правильности определения узнаваемой последовательности и определения позиции гидролиза ДНК в сайте узнавания проводили гидролиз синтетических олигонуклеотидных дуплексов, образованных из олигонуклеотидов следующей структуры:
3М: 5'-ACGGATCGAGGAGCGGGCCCTCGTGAATTCACG-3'
4М: 5'-CGTGAATTCACGAGGGCCCGCTCCTCGATCCGT-3'
3M(m5C): 5'-ACGGATCGAGGAGCGGG(m5C)CCTCGTGAATTCACG-3'
4M(m5C): 5'-CGTGAATTCACGAGGG(m5C)CCGCTCCTCGATCCGT-3'
Олигонуклеотиды 3М и 3M(5mC) комплементарны олигонуклеотидам 4М и 4(5mC).
Олигонуклеотидные дуплексы 3М*/4М и 3M(5mC)*/4M(5mC) имеют сходную последовательность нуклеотидов и отличаются друг от друга только наличием или отсутствием метальных групп в первом цитозине последовательности 5'-GGCC-3'.
Определение места гидролиза ДНК рестриктазой AoxI осуществляли путем сравнения длин фрагментов, образуемых при расщеплении рестриктазой HaeIII неметилированного дуплекса 3М*/4М и AoxI метилированного дуплекса 3M(5mC)*/4M(5mC). В качестве маркера длин фрагментов использовали продукты частичного расщепления этих же дуплексов экзонуклеазой ExoIII из E.coli.
На фиг.2 изображен радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления радиоактивно меченных дуплексов 3М*/4М и 3M(5mC)*/4M(5mC) в 20% полиакриламидном геле, содержащем 7-молярную мочевину.
Олигонуклеотиды, меченные радиоактивным фосфором 32P по 5'-концу, обозначены знаком *.
Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.2:
1 - дуплекс 3М*/4М;
2 - дуплекс 3M(5mC)*/4M(5mC);
3 - дуплекс 3М*/4М, обработанный эндонуклеазой AoxI;
4 - дуплекс 3M(5mC)*/4M(5mC), обработанный рестриктазой HaeIII;
5 - дуплекс 3М*/4М, обработанный рестриктазой HaeIII;
6 -дуплекс 3M(5mC)*/4M(5mC), обработанный экзонуклеазой ExoIII;
7 - дуплекс 3M(5mC)*/4M(5mC), обработанный эндонуклеазой AoxI;
Из фиг.2 видно, что фрагмент ДНК, образующийся при гидролизе дуплекса 3М*/4М рестриктазой HaeIII на дорожке 5, длиннее на два нуклеотида фрагмента, образующегося при гидролизе дуплекса 3M(5mC)*/4M(5mC) эндонуклеазой AoxI.
На основе полученных результатов можно сделать вывод, что в палиндромной последовательности 5'-GG(5mC)C-3'/3'-GG(5mC)C-5' эндонуклеаза AoxI расщепляет ДНК перед первым гуанином с образованием с образованием четырехнуклеотидных 5'-выступающих концов.
Выход сайт-специфической эндонуклеазы AoxI определяют по электрофоретической картине расщепления ДНК плазмиды pMHaeIII.
За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК данной плазмиды в течение 1 часа при температуре 37°С в 20 мкл реакционной смеси. Выход фермента составляет 100 ед/г сырой биомассы, концентрация 200 ед/мл.
Фермент хранится при - 20°С в буфере, содержащем 50% глицерин, 0,08% тритон
XI 00, 0,2 М NaCl, 10 мМ трисHCl (pH 7,5), 7 мМ -меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА.
Таким образом, получен новый штамм, продуцирующий сайт-специфическую эндонуклеазу AoxI, узнающую и расщепляющую обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК, которая содержит четыре С5-метилцитозиновых оснований в сайте узнавания 5'-GG(5mC)C-3'/3'-C(5mC)GG-5', с образованием четырехнуклеотидных 5'-выступающих концов. Данная сайт-специфическая эндонуклеаза может быть использована для выявления и анализа метилированной ДНК.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. // Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5'-GCGC-3'. // Биотехнология. - 2006. - № 4. - С.31-35.
2. Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж Е.В., Соколова О.О., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнает последовательности ДНК 5'-G(5mC)NGC-3' и расщепляет ее с образованием 3'-выступающих концов. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова. - 2007. - Т.3. - № 1. - С.28-33.
3. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции BisI из Bacillus subtilis T30 узнает метилированную последовательность ДНК 5'G(m5C)^NGC-3' // Биотехнология. - 2005. - № 3. - С.22-26.
4. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Гончар Д.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфическая эндонклеаза Glul узнает метилированную последовательность ДНК 5'-G(5mC)NG(5mC)-3'/3'-(5mC)GN(5mC)G-5' // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова. - 2007. - Т.3. - № 2. - С.13-17.
5. Roberts R.J., Vineze Т., Posfai J., Macelis D. 2003. REBASE - restriction enzymes and methylases. Nucl. Acids Res. 31, 418-420.
6. Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Дж.Хоулта и др.: (9-е издание в 2 томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А.Заварзина. - М., 1997.
7. Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. Applications of network BLAST server. // Meth. Enzymol - 1996. -. V.266 - P.131-141.
8. Smith, H.O., Nathans, D. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. // J. Mol. Biol. - 1973. - Vol.81. - P.419-423.
9. Bickle, T.A., Pirrotta, V. and Imber, R. A simple, general procedure for purifying restriction endonucleases. // Nucleic Acids Res. - 1977. - V.4 - P.561-2572.
Класс C12N1/21 модифицированные введением чужеродного генетического материала