способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе

Формула изобретения

Способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе, включающий фиксацию, промывку и обезвоживание, отличающийся тем, что после обезвоживания, не высушивая, образцы переносят в смесь дегидранта и камфена, затем последовательно пропитывают в двух порциях расплавленного камфена при температуре 51-60°С, после пропитывания камфеном образец высушивают на воздухе.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и может быть использовано при проведении научно-исследовательских работ, связанных с изучением стереоультраструктуры образцов биологических тканей.

Известны способы подготовки образцов биологических тканей к исследованию методом сканирующей электронной микроскопии путем высушивания с помощью метода перехода критической точки, методом замораживания-высушивания, высушивания в вакууме и путем высушивания на воздухе (Микроскопическая техника: Руководство / под ред. Д.С.Саркисова и Ю.Л.Перова. - М.: Медицина, 1996. - с.247-250).

Однако для осуществления этих методов необходимы специальные дорогостоящие оборудование и реактивы, иначе приводит к грубой деформации структуры образца.

Известен способ изготовления костных препаратов, включающий фиксацию, удаление костного мозга, эндоста и высушивание. Препарат перед высушиванием пропитывают наполнителем с ацетоном в течение 60-65 мин, промывают ацетоном, выдерживают до полной полимеризации наполнителя, протравливают этилатом калия при постоянном перемешивании в течение 60-120 мин (А.с. 1538185 СССР, МПК 5 G09В 23/28. Способ изготовления костных препаратов / Курганский НИИ экспериментальной и клинической ортопедии и травматологии (СССР). - Заявл. 02.07.86, опубл. 23.01.90, Бюл.3).

Однако данный способ является трудоемким, связан с использованием дорогостоящих и токсичных реактивов.

Известно применение органического соединения камфен (3,3-диметил-2-метиленбицикло-[1,2,2]-гептан) для сохранения и транспортировки хрупких объектов в археологии. Данное соединение характеризуется низкой температурой плавления (t_пл 51-52°С), растворимостью в ряде органических растворителей и способностью к возгонке при комнатной температуре (Brückle, I. Cyclododecane: technical note on some uses in paper and objects conservation / I. Brückle, J. Thornton, K. Nichols, G. Stricklerjaic // 1999, Vol.38, N 2, A.4. - P.162-175).

Однако он не применялся для сохранения нативной структуры образцов биологических тканей.

Задача изобретения - предотвращение деформации структур биологических объектов в процессе высушивания, упрощение процедуры и снижение ее себестоимости.

Поставленная задача достигается тем, что в способе подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе, включающем фиксацию, промывку и обезвоживание, после обезвоживания, не высушивая, образцы переносят в смесь дегидранта и камфена, затем последовательно пропитывают в двух порциях расплавленного камфена при t 51-60°C, после пропитывания камфеном образец высушивают на воздухе.

Изобретение иллюстрируется подробным описанием, примером его практического использования и электронной сканограммой, увеличение х1800, на которой фибробласты (ФБ) прикреплены к волокнистому остову наружного слоя надкостницы диафиза большеберцовой кости собаки.

Способ осуществляется следующим образом.

Для подготовки образцов тканей перед исследованием методом сканирующей электронной микроскопии берут образцы ткани и погружают в фиксирующую жидкость. Образцы отмывают от фиксатора и дегидратируют. Затем образцы, не высушивая, помещают в смесь дегидранта и камфена, затем в расплавленный камфен. После извлечения образцов из камфена их высушивают на воздухе при комнатной температуре в беспыльных условиях. Далее образцы монтируют на подложки и напыляют токопроводным слоем. Подготовленные образцы исследуют в сканирующем электронном микроскопе. Время каждого этапа подготовки образцов к микроскопическому исследованию подбирают индивидуально, в зависимости от размера образца.

Практическое использование способа иллюстрируется следующим примером. Для исследования взяли образцы надкостницы 1-1,5 мм диафиза большеберцовой кости собаки и фиксировали в течение 24 часов в смеси 2%-ных растворов формальдегида и глутаральдегида. Затем их промывали сначала в проточной (2 часа), в дистиллированной воде (2 часа), в фосфатном буфере (2 часа) и обезвоживали поэтапно в 70% (24 часа) и по 2 часа в 80%, 90%, 96%, 100% этиловом спирте, пропитывали в смеси камфен/дегидрант (в соотношении: 1/1, 2/1, 3/1 по 2 часа), при t=51°C, пропитывали в течение 12 часов расплавленным камфеном. Далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре, после чего осуществляли монтаж объектов на держатели образцов или промежуточную подложку.

После напыления серебром в ионном напылителе IB-6 препараты исследовали при помощи сканирующего электронного микроскопа JSM-840 (Япония). В подготовленном образце сохранены структура волокнистого и фибриллярного остова, форма клеток и микрорельеф клеточной поверхности (Фиг.1).

Предложенный способ используется в ФГУ РНЦ «ВТО» им. академика Г.А.Илизарова в научном экспериментально-клиническом отделе морфологических исследований. Он позволяет предотвращать деформацию структур биологических объектов в процессе высушивания, упрощает процедуру и снижает ее себестоимость.