штамм gordona terrae вкпм ас-1741 для разложения нефти и нефтепродуктов

Формула изобретения

Штамм бактерий Gordona terrae ВКПМ Ac-1741 для разложения нефти и нефтепродуктов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и нефтепродукты, которая может быть использована, например, для очистки загрязненных поверхностей.

Загрязнение нефтью и нефтепродуктами окружающей среды является актуальной экологической проблемой современного мира. Добыча, транспортировка, переработка и хранение углеводородов неизбежно влечет утечки значительных количеств токсичного поллютанта во внешнюю среду и его накопления. Решение данной проблемы включает использование метаболического потенциала нефтеокисляющих микроорганизмов.

Наиболее близким аналогом является штамм Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1668, выделенный из нефтезагрязненных почв республики Башкортостан (патент RU 2257409, МПК С12N 1/20, В09С 1/20, C02F 3/34). Штамм используется для очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений. Согласно способу очистка осуществляется путем внесения в объект окружающей среды (вода, почва) культуральной жидкости с конечным содержанием бактериальных клеток 1·10⁶ кл/мл с добавлением 0,2% нитроаммофоски.

Известен штамм Rhodococcus globerulus Н-42, выделен при воздействии космических излучений на штамм Rhodococcus globerulus TCH-OK (патент RU 2300561 С1, МПК С12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/100). Штамм используется для разложения нефти и нефтепродуктов.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении нового штамма, обеспечивающего высокоэффективную очистку загрязненных поверхностей от нефти и нефтепродуктов, являющихся единственными источниками углерода и энергии в процессе очистки.

Указанный технический результат достигается новым штаммом Gordona terrae ВКПМ Ac-1741, выделенным из озера Беленовское Оренбургского района Оренбургской области из альго-бактериальной ассоциации зеленой водоросли Chlamydomonas Reinhardtii Dang.

Выделенный штамм Gordona terrae ИКВС 19 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИ Генетики и имеет регистрационный номер Ас-1741.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков.

Химический состав клеточной стенки анализировали методом тонкослойной газожидкостной хроматографии (Методы почвенной микробиологии и биохимии. Под ред. Д.Т. Звягинцева, М.: МГУ, 1991, с.131-133).

Биохимическую идентификацию проводили с использованием дифференциально-диагностических сред, описанных в «Справочнике по микробиологическим и вирусологическим методам исследования» под ред. Биргера М.О., Москва, 1982 и в «Определителе бактерий Берджи» под ред. Дж.Хоулта и др., изд. «Мир», 1997.

Хранение штамма осуществляется на 0,7% МПА при температуре 4°С в течение 3-х месяцев. Более длительное хранение осуществляется путем периодического (раз в 3 месяца) пересева на свежую питательную среду или путем лиофильного высушивания штамма с последующим хранением в запаянных ампулах при температуре 4°С.

Условия и среды для размножения штамма: посев исходной культуры на 1,5% МПА, или модифицированный агар Чапека, или среду Раймонда, содержащую нефть или нефтепродукты в качестве единственного источника углерода, с последующим выращиванием в условиях термостата при t 25-27°С в течение 48 часов.

Штамм Gordona terrae ВКПМ Ac-1741 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

При выращивании на обычных питательных средах при температуре 25-27°С штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 на поверхности плотной питательной среды растет в течение двух суток с образованием характерных изолированных колоний бледно-оранжевого цвета. На модифицированном агаре Чапека растет в течение двух суток с образованием характерных слизистых изолированных колоний ярко-оранжевого цвета. При дальнейшем культивировании наблюдается слизистый «сливной» рост. Пигмент, не диффундирующий в среду. При выращивании в мясопептонном бульоне штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 растет в течение двух суток и вызывает равномерное помутнение среды, к шестым суткам культивирования образуется осадок оранжевого цвета.

На минеральной среде Раймонда, содержащей нефть или нефтепродукты в качестве единственного источника углерода, штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 к третьим суткам образует бактериальную пленку на границе раздела «среда-нефтепродукт». Эта бактериальная пленка на границе «среда-нефтепродукт» к шестым суткам утолщается, в толще среды образуется слегка опалесцирующая муть. Визуально наблюдается изменение структуры нефти: нефтяная пленка становиться неровной, появляются «окна», под слоем нефти формируется беловато-кремовое кольцо, образованное бактериями. При встряхивании нефть распадается на мелкие хлопья коричневого цвета, что не наблюдается при встряхивании нативной нефти.

В состав клеточной стенки штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 входит мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза, миколовые кислоты, что соответствует 4-му типу клеточной стенки (Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии/ Нестеренко О.А., Квасников Е.И., Ногина Т.М. - Киев: Наук. Думка, 1985, стр.336).

Физиолого-биохимические признаки.

По типу питания штамм является прототрофом. Обладает бродильным типом метаболизма, продуцирует уреазу, желатиназу, амилазу; фосфатаза - отрицательный, протеолитические ферменты отсутствуют, восстанавливает нитраты в нитриты, усваивает натриевые соли -кетоглутаровой кислоты, не разлагает тирозин, не растет на среде с моноэтаноламином, растет на среде, содержащей 7% натрия хлорид; не образует кислоту из мальтозы, лактозы; образует кислоту из галактозы, сахарозы, фруктозы, сорбита, маннита; чувствителен к лизоциму.

Штамм обладает высоким уровнем каталазной активности, что обеспечивает устойчивость заявляемого штамма к активным формам кислорода, которые образуются в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов (Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный С.В. Механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами // Успехи соврем. биологии, 2006 г. - Т.3. - С.285-296).

Уровень каталазной активности продуцируемой Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 определяется фотометрически по методике (Бухарин О.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В. и др. Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 P. // Билл. эксперим. биологии, 2000 г. - Т.130, № 7. - С.80-82).

Накопление численности клеток по сравнению с исходным количеством (1·10⁶ кл/см ³) при росте на минеральной питательной среде Раймонда, содержащей нефть в качестве единственного источника углерода и энергии, происходит к 6 суткам и составляет 7·10⁷ кл/см³. Таким образом, количество клеток по сравнению с исходным увеличивается в 70 раз. При потреблении нефти или нефтепродукта на 50% и более происходит постепенное снижение численности штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741, что связано с уменьшением количества углерода в среде, при условии использования нефти и нефтепродуктов в качестве единственного источника углерода.

Эффективность нефтепотребления штамма к 6 суткам составляет от 50% до 90% зависимости от вида углеводорода. Эффективность нефтепотребления определяли на среде Раймонда визуально по степени деградации нефти, а также по результатам химанализа с использованием флуориметрического метода.

Применение на практике данного штамма обуславливается его физиолого-биохимическими особенностями. Заявляемый штамм предназначен для ликвидации последствий загрязнения воды и почвы нефтью и нефтепродуктами.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Культуру штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 выращивали на агаризированной среде Чапека следующего состава: нитрат натрия 2 г, двузамещенный фосфат калия 1 г, сульфат марганца 7-водный 0,5 г, хлорид калия 0,5 г, сульфат железа (II) 7-водный 0,01 г, сахароза 30 г, дрожжевой экстракт 2 г, агар-агар 15 г, дистиллированная вода 1000 мл. Приготовленную среду разливали по флаконам, автоклавировали при 1 атм в течение 20 мин. Питательную среду остужали до 45-50°С, разливали по стерильным чашкам Петри в объеме 10 мл. Давали питательной среде застыть. На застывшую поверхность агаризованной среды Чапека засевали бактериологической петлей (d 0,4 мм) культуру штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 среды. Посевы выращивали в термостате при температуре 25-27°С в течение 48 часов. Из выращенной культуры готовили взвесь по стандарту мутности БАК-5 (ГИСК им. Л.А.Тарасевича).

Пример 2.

Культуру штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 выращивали и готовили из нее взвесь аналогично примеру 1.

1 см³ приготовленной взвеси вносили в опытную среду Раймонда следующего состава: хлорид аммония 2 г, сульфат магния 7-водный 0,2 г, однозамещенный фосфат калия 2 г, двузамещенный фосфат натрия 3 г, хлорид кальция 6-водный 0,01 г, карбонат натрия 0,1 г, сульфат марганца 5-водный 1% раствор 2 мл, сульфат железа (II) 1% раствор 1 мл, вода дистиллированная 1000 мл. В качестве единственного источника углерода добавляли стерильное дизельное топливо из расчета 1 см³ на 1 дм³ среды. Исходная концентрация штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 в среде Раймонда составляла 1·10⁶ кл/см³. Время инкубации - 35 суток при температуре 25-27°С.

Готовили контроль для учета испаряемости дизельного топлива. Для этого в среду Раймонда добавляли дизельное топливо из расчета 1 см³ на 1 л среды. Время инкубации - 35 суток при температуре 25-27°С.

В процессе эксперимента рост численности бактерий учитывали чашечным методом путем посева инокулята, объемом 0,1 см³ на питательную агаризированную среду Чапека. Подсчет выросших колоний осуществляли с помощью установки для автоматического учета колоний микроорганизмов на чашках ProtoCOL HR (Great Britan).

Химический анализ на содержание нефтепродуктов проводили флуориметрическим методом на анализаторе жидкости «Флюорат - 02». Деструкцию нефтепродуктов бактериями рассчитывали по формуле:

Д=((с1-с2)/с 1)·100%, где

Д - деструкция нефтепродуктов, %;

с1 - начальное содержание нефтепродуктов, мг/дм³;

с2 - содержание нефтепродуктов в опыте, мг/дм³.

Максимальная интенсивность деструкции дизельного топлива была отмечена на 6 сутки - 95,6% (таблица 1).

Пример 3.

Аналогично примеру 2 проводили эксперимент со штаммом Gordona terrae ВКПМ Ас-1741. В качестве единственного источника углерода и энергии в минеральную среду Раймонда добавляли нефть Сорочинского месторождения (Оренбургская область).

По результатам химического анализа штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 к 12 суткам эксперимента потребил до 48%, к 35 суткам убыль нефти в опыте составила 78,8% (таблица 2).

Пример 4.

Культуру штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 выращивали аналогично примеру 1.

В качестве модели был использован образец загрязненной почвы с территории Бугурусланского месторождения (Оренбургская область). Для биообработки поверхности почвы готовили взвесь штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 в пресной воде с конечной концентрацией клеток 1·10⁶ кл/см³. Взвесью обрабатывали загрязненную почву. На почве при пересыхании обрабатываемой поверхности проводили полив и рыхление.

Готовили контроль из загрязненного углеводородами образца почвы, взятого с того же участка, что и в опыте, без внесения каких-либо дополнительных микроорганизмов.

По результатам химического анализа штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 к 6 суткам эксперимента потребил до 55,9%, к 35 суткам убыль нефти в опыте составила 78,0% (таблица 2).

В таблицах 1, 2, 3 приведены результаты тестирования деградирующей способности штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 в лабораторных экспериментах.

В таблице 1 представлены результаты лабораторного тестирования деградирующей способности штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 в отношении дизельного топлива.

Таблица 1
Объект	Сутки	Содержание дизельного топлива,	Степень очистки, %
мг/дм3	%
Gordona terrae ВКПМ Ас-1741	0	610	100	0
	6	26,8	3,6	95,6
	12	20,3	2,7	96,7
23	10,6	1,4	98,3
35	0,5	0,07	99,9
Контроль	0	610	100	0
6	605	99,2	0,8
12	605	99,2	0,8
23	580	95,1	4,9
35	550	90,2	9,8

В таблице 2 представлены результаты эксперимента по утилизации нефти Сорочинского месторождения штаммом Gordona terrae ВКПМ Ас-1741.

Таблица 2
Объект	Сутки	Содержание Сорочинской нефти,	Степень очистки, %
мг/дм3	%
Gordona terrae ВКПМ Ас-1741	0	750	100	0
6	722	96,3	3,7
12	390	52	48,0
23	162	21,6	78,4
35	159	21,2	78,8
Контроль	0	750	100	0
6	669	89,2	10,8
12	652	86,9	13,1
23	623	83,1	16,9
35	607	80,9	19,1

В таблице 3 представлены результаты эксперимента по утилизации нефти Бугурусланского месторождения штаммом Gordona terrae ВКПМ Ас-1741.

Таблица 3
Объект	сутки	Содержание Бугурусланской нефти,	Степень очистки, %
мг/дм3	%
Gordona terrae ВКПМ Ac-1741	0	750	100	0
6	331	44,1	55,9
12	322	42,9	57,1
23	201	26,8	73,2
35	165	22	78,0
Контроль	0	750	100	0
6	700	93,3	6,6
12	631	84,1	15,8
23	556	74,1	25,9
35	550	73,3	26,7

В таблице 4 представлены результаты эффективности потребления нефти и нефтепродукта штаммом Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 к 6 и 35 суткам эксперимента.

Таблица 4
Вид углеводорода	Начальное содержание углеводородов	Содержание углеводородак 6 суткам эксперимента	Эффективность очистки %	Содержание углеводорода к 35 суткам эксперимента	Эффективность очистки %
	мг/дм 3	%	мг/дм3	%	мг/дм3	%
Дизельное топливо	610	100	26,8	3,6	95,6	0,5	0,07	99,9
Нефть Сорочинского месторождения	750	100	722	96,3	3,7	159	21,2	78,8
Нефть Бугурусланского месторождения	750	100	331	44,1	55,9	165	22	78

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 к шестым суткам может быть достигнута эффективная деградация нефти и нефтепродуктов до 50-90% в зависимости от вида углеводорода, и этот штамм может быть использован для удаления нефтяных загрязнений с поверхности почвы и водоемов.