способ получения трехмерного хондротрансплантата

Формула изобретения

Способ получения трехмерного хондротрансплантата путем культивирования хондроцитов в питательной среде, отличающийся тем, что пластинки роста новорожденных мини-свиней помещают в раствор Хенкса с канномицином 1 г/л на 5 мин, затем пластинки роста промывают, измельчают, переносят в пробирки со средой RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствора 1,5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл, инкубируют при 37°С в течение 8 ч, суспензию центрифугируют при 2000 об/мин 10 мин, изолированные хондробласты культивируют при 37°С, при 90% влажности и 5% СO₂ в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и гентамицином 1 г/л, и аскорбиновой кислотой 50 мг/мл, по достижению концентрации 50-60 млн проводят пассирование клеток с помощью смеси растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора ЭДТА, далее клетки центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин, затем клеточный агрегат перемещают в планшет с питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, культивируют 4-6 недель до получения хондротрансплантата размером 2×2×2±мм³ .

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для коррекции дистрофических и травматических изменений хрящевой ткани, а также для коррекции процессов роста при идиопатическом сколиозе на ранних стадиях развития патологии.

Известны способы получения трехмерного хондротрансплантата на основе синтетического коллагена с микропорами (Guoping Chen, Takashi Sato, Takashi Ushido et. al. Tissiue engineering of cartilage using a hybrid scaffold of synthetic polymer end collagen. // Tissue Engineering. 2004. Vol.10. N.3. P.323-330). Культивировали артикулярные хондроциты взрослых бычков в альгинатном геле до начала синтеза протеогликанов, затем помещали на пористую мембрану, содержащую протеогликаны. Хондроциты сохраняли свой фенотип и синтезировали коллаген II типа и матрикс.

Трехмерный трансплантат получали из хондроцитов носовой перегородки молодых бычков (Koichi Masuda, Robert L., San Michael J., et. al. A novel tow-step method for the formation of tissue-engineered cartilage by muture bovine chondrocyte (ABC-method) // J. of Orthopeadic Research. 2003. Vol.21. N.1. P.139-148). Хондроциты извлекали из носовой перегородки молодых бычков, культивировали до получения монослоя, затем помещали на подложку из биодеградирующего материала - олигополиэтиленгликоля, на которой формировался хондротрансплантат.

Хондроциты суставного хряща человека культивировали в виде суспензии и затем помещали в круговой биореактор, в котором клетки подвергались вращению в течение 12 недель (Marlovits S., Tichy В., Truppe М., et. al. Collagen expression in tissue engineered cartilage of aged human articular chondrocytes in a rotating bioreactor. // Jnt. J. Artif. Organ. 2003. Apr., Vol.26. N.4. P.319-330). Клетки спонтанно агрегировались и формировали экстрацеллюлярный матрикс.

Основными недостатками данных методов получения хондротрансплантата являются: использование высокодифференцированных хондробластов артикулярного хряща, чьи потенции пролиферации и формирования матрикса ограничены, что может привести к апоптозу хондроцитов и несовместимости трансплантата; применение матриц - носителей, представляющих собой слабо резорбируемые материалы, являющиеся инородными телами, препятствующими адаптации и метаболической кооперации трансплантируемых и материнских хондробластов.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения хрящевых трансплантатов из хондроцитов лошади без применения матриц-носителей (Ponomarev I., Nilke J. Verfahren zur herstellung deidimensionaler tragrfreier gewebestrukturen und naeh diesen verfahren herges tellte gewebestrukturen. // Deutschen Patent und Markenamtes. Patent N. 2004001225. 2004). Биотрасплантаты хряща из коленных суставов лошади извлекаются в стерильных условиях и помещаются в пробирки с 0.9% NaCl. В условиях ламинарного шкафа двукратно промытый в чашке Петри стерильным раствором фосфатного буфера биоптат измельчается скальпелем на кусочки размером 1×1 мм², которые затем переносятся в пробирку объемом 50 мл со средой DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma) с добавлением 10% телячьей сыворотки, антибиотиков, а также коллагеназы (240 ед.актив./ мл Fa. Worthington, NJ) и гиалуронидазой (600 ед.актив./мл, Sigma). Пробирки с пробами помещаются в термостат и инкубируются в течение ночи при 37°С. На следующий день полученная из биоптата суспензия процеживается через стерильное сито (размер пор 70 мкм) и центрифугируется 10 мин при 4000 оборотах в мин. Осадок ресуспензируется в PBS, и проводится подсчет витальных хондроцитов. Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью красителя в счетной камере Горяева. Культивирование хондроцитов проводится в инкубаторе при 37°С, 90% влажности и 5% СО₂ в культуральных плоскодонных флаконах в среде DMEM, с добавлением 10% FBS, гентамицина 1 г/л и 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты. Смена среды проводится каждые 3 дня. По достижении оптимальной концентрации (60 млн) производится пассирование с использованием 0.25% раствора трипсин-ЭДТА, клетки центрифугируются при 4000 оборотах в мин в течение 10 минут, в результате чего образуется плотный агрегат, который помещается в 6-луночную планшетку в среду DMEM с добавление 20% FBS. В условиях термостата агрегат подвергается мануальной механической стимуляции при помощи стеклянной палочки путем давления. В зависимости от размера агрегата частота механический стимуляции варьируется от ежедневной до 1-2 раз в неделю. Интенсивность «давления» на агрегат контролируется визуально.

Основными недостатками данного метода являются: использование высокодифференцированных хондроцитов артикулярного хряща, у которых потенции пролиферации и дифференцировки и последующего формирования матрикса ограничены; механическое воздействие скорее усиливает процесс диффузии к хондроцитам, чем стимулирует синтетические процессы; кроме того, метод может быть применен только для лечения патологий суставов лошадей.

Задача изобретения - разработать способ получения хондротрансплантата, обладающего способностью к органоспецифической хондрогенной дифференцировке.

Поставленная задача решается за счет того, что культивируют низкодифференцированные хондроциты позвоночника новорожденных мини-свиней в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствора 1.5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл; центрифугируют при 2 тыс об/мин, полученный клеточный агрегат культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS без мануальной механической стимуляции.

Техническим результатом использования способа получения хондротрансплантата для коррекции процессов роста и дегенеративно-деструктивных изменений хрящевой ткани является предотвращение прогрессирования деформации позвоночника на ранних стадиях процесса; предупреждение развития остеоартроза и остехондроза; сокращение послеоперационного периода, резкое сокращение количества послеоперационных койко-дней и исключение многоэтапных, дорогостоящих операций на позвоночнике и суставах. Замещение дефекта хрящевой ткани органспецифическим трансплантатом позволит купировать развитие остеоартроза, асимметрию роста и остеохондроза на ранних стадиях патологии, что улучшит качество жизни больного.

Технический результат достигается за счет того, что используют пластинки роста тел позвонков новорожденных мини-свиней, которые содержат низкодифференцированные хондробласты с высокой потенцией к органоспецифической дифференцировке; подбирают время инкубирования и концентрацию антибиотика так, чтобы сохранить жизнеспособность выделяемых клеток; используют среду, которая содержит оптимальное количество метаболитов для поддержания жизнеспособности выделяемых клеток; подбирают условия центрифугирования, способствующие максимальному сохранению жизнеспособности выделяемых клеток.

Способ осуществляется следующим образом. Стерильно выделенные пластинки роста тел позвонков новорожденных мини-свиней помещают в раствор Хенкса с канномицином 1 г/л на 5 минут. В условиях ламинарного шкафа, после двукратного промывания в чашке Петри стерильным раствором фосфатного буфера пластинки роста измельчают скальпелем на кусочки 1×1 мм², которые переносят в пробирки со средой RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствором 1.5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл, инкубируют при 37°С в течение 8 часов, объем раствора превышает в 10 раз объем обрабатываемой ткани. Далее, суспензию пропускают через стерильное сито (70 мкм) и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут. Клетки ресуспензируют в среде PBS, производят подсчет витальных хондробластов при помощи красителя трипанового синего в счетной камере Горяева. Культивирование изолированных хондробластов производят в инкубаторе при 37°С, при 90% влажности и 5% СО₂ в культуральных плоскодонных флаконах в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и гентамицином 1 г/л, и аскорбиновой кислотой 50 мг/мл. Среда сменяется через каждые 3 дня. По достижении необходимой концентрации (50-60 млн) производят пассирование клеток с помощью смеси растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора ЭДТА, далее, клетки центрифугируют при 2000 оборотов в мин в течение 10 минут. Клеточный агрегат перемещают в 6-луночный планшет с питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, культивируют 4-6 недель. Смену среды осуществляют 2 раза в неделю, с интервалом 2-3 дня до получения хондротрансплантата размером 2×2×2±мм ³.

Пример конкретного выполнения способа получения трехмерного хондротрансплантата. Стерильно выделенные пластинки роста тел позвонков из всего позвоночника 7-дневных мини-свиней помещают в раствор Хенкса с канномицином 1 г/л на 5 минут. В условиях ламинарного шкафа, после двукратного промывания в чашке Петри стерильным раствором фосфатного буфера пластинки роста измельчают скальпелем на кусочки 1×1 мм² , которые переносят в пробирки со средой RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и раствором 1.5% коллагеназы с активностью 240 ЕД/мл, инкубируют при 37°С в течение 8 часов. Если объем выделенной ткани составляет 5 мл, приливают 50 мл реакционной смеси. Далее, суспензию пропускают через стерильное сито (70 мкм) и центрифугируют при 2000 оборотов в мин в течение 10 минут. Клетки ресуспензируют в среде PBS, выделяют 2 млн витальных хондробластов при помощи красителя трипанового синего в счетной камере Горяева. Культивирование изолированных хондробластов производят в инкубаторе при 37°С, при 90% влажности и 5% СО₂ в культуральных плоскодонных флаконах в среде RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и гентамицином 1 г/л, и аскорбиновой кислотой 50 мг/мл. Среду сменяют через каждые 3 дня. По достижении необходимой концентрации в 50 млн производят пассирование клеток с помощью смеси растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора ЭДТА, далее, клетки центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 минут. Клеточный агрегат перемещают в 6-луночный планшет с питательной средой RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, культивируют 5 недель. Смену среды осуществляют с интервалом в 3 дня до получения хондротрансплантата размером 2×2×2±мм ³.

На чертежах представлено:

Фиг.1 трехмерный хондротрансплантат. Гематоксилин-эозин. 20×40.

Фиг.2 трехмерный хондротрансплантат. Альциановый синий. 20×40.

Фиг.3 трехмерный хондротрансплантат. Иммунохимическая реакция на коллаген 2 типа. 10×20.

Фиг.4. Экспрессия гена агрекана хондроцитами трехмерного хондротрансплантата. Результат мультиплексной ПЦР с праймерами для гена GAPDH (нижняя полоса) и гена агрекана (верхняя полоса). 1 - маркер; 2, 3, 4, - хондроциты трехмерного трансплантата.

Фиг 5. Комплекс Гольджи с развитым ламеллярным и вакуолярным компонентами хондроцитах трехмерного хондротрансплантата; х17000

Полученный трехмерный хондротрансплантат представлен клетками, имеющими фенотип хондроцитов и межклеточным матриксом (Фиг.1) Тканеспецифичность полученного хондротрансплантата характеризует синтез коллагена II типа, сульфатированных гликозаминогликанов, экспрессию гена агрекана и ультраструктурную организацию полученных хондроцитов. Исследование тканеспецифичности трансплантата проводили следующими методиками:

1) окрашивания клеток гистологического среза трехмерного трансплантата альциановым синим (Фиг.2),

2) исследованием типа синтезируемого коллагена - иммуногистохимическая реакция с антителами на коллаген II типа (Фиг.3),

3) исследованием экспрессии гена агрекана хондроцитов трехмерного хондротрансплантата (Фиг.4),

4) методом ультраструктурного анализа (Фиг.5).