иммобилизованный биокатализатор для микробиологического получения пектиназ

Формула изобретения

Иммобилизованный биокатализатор для микробиологического получения пектиназ, содержащий способные продуцировать пектиназы клетки мицелиального гриба, включенные в матрицу содержащего поливиниловый спирт гелевого носителя, отличающийся тем, что гелевый носитель представляет собой криогель поливинилового спирта с макропорами сечением 0,5-5,0 мкм, причем иммобилизованный биокатализатор получен на основе следующих компонентов, взятых в соотношении, мас.%:

клетки мицелиального гриба (по сухой массе)	0,001-0,1
поливиниловый спирт	8,4-2,5
водная фаза	до 100

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к иммобилизованным биокатализаторам на основе ферментов или клеток, помещенных в гелевый носитель, а также к процессам получения продуктов микробиологического синтеза с использованием иммобилизованных биокатализаторов, в данном случае - к получению пектиназ-ферментов, катализирующих гидролиз пектиновых веществ.

Изобретение наиболее эффективно может быть использовано в пищевой промышленности, поскольку подобные ферменты широко применяются при переработке овощей и фруктов, а также в процессах производства соков, вина, кофе, чая. Обработка пектиназами различного сырья, содержащего пектин, позволяет существенно увеличить сокоотделение, снизить вязкость жидких сред, обеспечить высокую эффективность последующих технологических стадий переработки сельскохозяйственного сырья, в частности фильтрации, стерилизации, расфасовки и др.

Пектиназы в промышленном масштабе получают микробиологическим способом. В качестве продуцентов пектиназ широко используются микроскопические грибы родов Aspergillus, Penicillium, Rhizopus и др. [Favela-Torres Е., Volke-Sepulveda Т., Viniegra-Gonzalez G. Production of hydrolytic depolymerising pectinases (2006) Food Technol. Biotechnol. V.44, p.221-227; Dhillon S.S., Gill R.K., Gill S.S., Singh M. (2004) Studies of the utilization of citrus peel for pectinase production using fungus Aspergillus niger. // Intern. J. Enviorin. Studies, V.61, p.199-210], которые считаются наиболее эффективными продуцентами с точки зрения уровня синтеза пектолитических ферментов и состава синтезируемых ферментативных комплексов. Микроскопические грибы синтезируют преимущественно внеклеточные пектиназы, что существенно упрощает процесс выделения и очистки указанных ферментов в сравнении с внутриклеточными пектиназами бактерий [Elegado F.B., Fujio Y. Purification and some properties of polygalacturonase from Rhizopus sp. LKN (1994) World. J. Microbiol. Biotechnol., V.10, р.256-259]. Это предопределяет использование именно клеток микроскопических грибов, являющихся биокатализаторами, осуществляющими синтез и секрецию ферментов с пектолитической активностью, для получения пектиназ в промышленных масштабах на питательных средах с пектинсодержащими субстратами, являющимися индукторами синтеза пектиназ.

В качестве основных критериев сравнительной оценки эффективности функционирования различных биокатализаторов, предназначенных для получения пектиназ, обычно применяют следующие показатели:

- суммарная пектолитическая активность (Ед.), которая может быть получена за все время использования биокатализатора, и

- продуктивность процесса, проводимого с использованием биокатализатора для получения пектиназ (Ед.мл^-1 ч^-1).

За единицу пектолитической активности принимают такое количество пектиназ, которое в течение 1 мин при температуре 50°С и рН 5,0 гидролизует полигалактуроновую кислоту с образованием 1 мкмоля редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы [Avigal G. Colorimetric assays for hexuronic acids and some keto sugars. In book: Methods in Enzymology. Carbohydrate metabolism (Eds. Colowick S.P., Kaplan N.O.), V.XLI (Part B). N.Y. Acad. Press, 1975, p.29-30].

Одним из перспективных приемов повышения эффективности процессов получения пектиназ является использование гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроскопических грибов, позволяющих создавать высокие концентрации клеток в объеме реактора и, таким образом, увеличивать продуктивность процесса, а также скорость накопления внеклеточных пектиназ в среде культивирования.

Известен способ получения пектиназ путем твердофазного культивирования иммобилизованных биокатализаторов на основе клеток микроскопических грибов Aspergillus niger [M.E.Acuna-Arguelles, M.Gutierrez-Rojas, G.Viniegra-Gonzalez, E.Faveva-Torres (1995) Production and properties of three pectinolytic activities produced by Aspergillus niger in submerged and solid-state fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol, V.43, p.808-814], Aspergillus foetidus [S.F.Cavalitto, J.A.Arcas, R.A.Hours (1996) Pectinase production profile of Aspergillus foetidus in solid state cultures at different acidities. Biotech. Lett., V.18, p.251-256], а также Aspergillus orizae, Aspergillus awamory, Trichoderma sp. и др. [Dartora A.B., Bertolin Т.Е., Ilibio D., Silveira M.M., Costa J.A.V. (2002) Evaluation of filamentous fungi and inducers for the production of endopolygalacturonase by solid state fermentation Z. Naturforch., V.57, р.666-670]. В качестве носителей иммобилизованных клеток в этом случае используют различные твердые субстраты, индуцирующие синтез пектиназ. Основой таких субстратов обычно служат частицы измельченных пектинсодержащих отходов переработки сельскохозяйственной продукции (свекловичный жом, апельсиновые и лимонные корки, пшеничные отруби, яблочный жом и др.). Далее субстрат увлажняют до содержания влаги 55-80% средой, содержащей источники азотного питания и микроэлементов, необходимые для микроорганизмов, а также посевной материал (суспензию спор) в концентрации 10⁷-10⁸ спор/г основного сухого вещества. При этом происходит адсорбционная иммобилизация спор на поверхности частиц носителя. Далее проводят культивирование клеток, иммобилизованных на твердом носителе, в условиях, наиболее благоприятных для метаболической активности соответствующих штаммов микроорганизмов. Средняя продуктивность процесса по пектолитической активности с такими иммобилизованными биокатализаторами составляет 0,14 Ед. мл^-1 ч^-1, а максимальная суммарная пектолитическая активность, накапливающаяся в среде за время использования иммобилизованных биокатализаторов (96 ч), достигает 40000 Ед.

Несмотря на простоту получения пектиназ с помощью таких иммобилизованных биокатализаторов, применение последних сопряжено с рядом значительных технологических сложностей и ограничений, так как этот вариант обладает следующими недостатками:

- для культивирования на твердой среде требуется наличие больших площадей для размещения емкостей с исходным основным твердым субстратом и осуществления твердофазного культивирования клеток с обеспечением их требуемой аэрацией;

- процесс характеризуется относительно большими временными и энергетическими затратами;

- при твердофазном культивировании клеток нельзя добиться однородного их роста по объему всего реактора с твердофазной средой, что усугубляется отсутствием перемешивания системы и отрицательно сказывается на показателях продуктивности биомассы;

- при использовании такого биокатализатора для получения пектиназ предполагается обводнение использованной твердой среды для экстракции внеклеточных ферментов из коржа, пронизанного грибным мицелием и образующегося в процессе культивирования клеток, с последующим его, так называемым "отжимом", в результате которого клетки, составляющие биокатализатор, теряют жизнеспособность и не могут быть использованы повторно;

- сам биокатализатор и остатки твердой питательной среды представляют собой массовый отход производства в каждом рабочем цикле биокатализатора.

Все это отрицательно сказывается на экономических показателях процесса производства пектиназ с использованием такого иммобилизованного биокатализатора, который не обеспечивает хорошей технологичности процесса в целом.

Иммобилизация клеток с применением более совершенных носителей позволяет осуществлять ферментацию в жидких питательных средах, многократно использовать одни и те же клетки, продуцирующие внеклеточные пектиназы, и увеличить, таким образом, длительность использования одного и того же биокатализатора, а также повысить суммарный выход получаемой пектолитической активности и сократить экономические расходы на регулярное наращивание биомассы клеток и ее последующую утилизацию.

Так, известен иммобилизованный биокатализатор на основе клеток гриба Aspergillus awamori, адсорбированных на нерастворимом носителе - пенополиуретане. Процесс проводят следующим образом: в жидкую среду для выращивания клеток, содержащую пектин (20 г/л), лактозу (20 г/л), (NH₄)₂SO₄ (0,7 г/л), KCl (0,05 г/л) и MgSO₄×H₂ O (0,001 г/л), помещают пенополиуретановую подложку в форме диска диаметром 4,5-5,0 см и толщиной 1,0-1,5 см, затем вносят споры гриба в концентрации (1,7-1,9)×10⁵ спор/мл, которые адсорбируются на поверхности пенополиуретановой подложки, а далее в процессе культивирования проращивают, формируя губчато-нитчатую мицелиальную биомассу на поверхности носителя. В ходе ферментации иммобилизованные указанным образом клетки секретируют внеклеточные пектиназы [Блиева Р.К., Родионова Н.А. Фракционирование и очистка пектинрасщепляющих ферментов, образуемых иммобилизованными клетками Aspergillus awamori // Прикл. биохим. микробиол., 1987, Т.23, с.561-567]. Средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 0,25 Ед. мл^-1 ч^-1 , а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время использования биокатализатора (1440 ч), достигает 48000 Ед [Блиева Р.К., Родионова Н.А., Мартинович Л.И. Образование пектинрасщепляющих ферментов иммобилизованными клетками Aspergillus awamori. // Микробиология, 1989, Т.58, с.246-250].

Данный иммобилизованный биокатализатор обладает рядом недостатков:

- основным условием применения такого биокатализатора для получения пектиназ является отсутствие в питательной среде каких-либо твердых частиц, содержащих пектиновые вещества (свекловичный жом, яблочный жом и др.), так как в этом случае при возникающем механическом воздействии на биомассу наблюдается разрушение самого иммобилизованного биокатализатора, в частности отслоение мицелия от пенополиуретановой подложки;

- для сохранения эффективного функционирования иммобилизованного биокатализатора при его использовании для получения пектиназ необходимо обязательное периодическое (через каждые 230 ч) обновление мицелия на подложке, для чего проводят частичное удаление биомассы мицелия с пенополиуретановой поверхности с последующим наращиванием в течение 48-96 ч новой активной биомассы на поверхности подложки.

Таким образом, при эксплуатации данного иммобилизованного биокатализатора необходима регулярная утилизация отработанной мицелиальной биомассы, а также экономические и временные затраты на ее регенерацию на носителе, что в целом существенно снижает технологичность процесса получения пектиназ.

Известны иммобилизованные биокатализаторы для получения пектиназ на основе клеток мицелиальных грибов, включенных в матрицу полимерного геля. В большинстве случаев в составе таких иммобилизованных биокатализаторов используют клетки мицелиальных грибов Aspergillus niger 26 или Aspergillus sp. В качестве носителя наиболее часто при этом применяют Са-альгинатный гель. Сам иммобилизованный биокатализатор представляет собой клетки мицелиального гриба, обладающие секреторной пектолитической активностью, включенные в сферические гранулы (диаметром 2-4 мм) ионо-тропного Са-альгинатного геля. Такой иммобилизованный биокатализатор получают на основе композиций, представляющих собой суспензию спор (от 2×10 ⁷ до 10⁹ спор/мл) в водном 0,1%-ном растворе Тритона Х-100 или 0,01% растворе Твин-80 в смеси с 2-3%-ным раствором альгината натрия, которую прокапывают в раствор 1,5-2,0%-ного хлорида кальция при комнатной температуре, выдерживают полученные гранулы в том же растворе 1-2 ч при 0-4°С, отделяют от раствора, промывают 3-4 раза дистиллированной водой и далее культивируют сформированный таким образом иммобилизованный биокатализатор в питательной среде для получения пектиназ. Максимальное значение средней продуктивности такого процесса по пектолитической активности составляет 0,57 Ед мл^-1 ч^-1 [Nighojkar S., Phanse Y., Sinha D., Nighojkar A., Kumar A. Production of polygalacturonase by immobilized cells of Aspergilus niger using orange peel as inducer (2006) Proc. Biochem., V.41, p.1136-1140], а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за время использования иммобилизованных биокатализаторов (648 ч), достигает 71700 Ед [Angelova М., Sheremetska P., Lekov М., Enhanced polymethylgalacturonase production from Aspergillus niger 26 by calcium alginate immobilisation. (1998) Proc. Biochem., V.33, p.299-305].

Несмотря на возможность длительной эксплуатации таких иммобилизованных биокатализаторов и довольно высокую получаемую при этом суммарную пектолитическую активность, основным недостатком данного технического решения, существенно ограничивающим его применение, являются недостаточные механическая прочность и операционная стабильность гранул иммобилизованного биокатализатора, которые сказываются на том, что:

- в ходе ферментации происходит изменение формы биокатализатора - его деформация под действием внешних факторов, в частности сжатия вследствие сдвиговых напряжений, возникающих при перемешивании среды, а также из-за давления кислорода извне гранул, подаваемого в реактор, и углекислого газа, выделяемого клетками внутри гранул (в результате ухудшаются процессы массопереноса в частицах носителя, что приводит к снижению продуктивности иммобилизованной культуры);

- имеет место постепенное разрушение матрицы Са-альгинатного геля в среде культивирования иммобилизованных клеток, содержащей фосфат-ионы, являющиеся, в свою очередь, обязательным компонентом питательных сред, используемых для синтеза пектиназ;

- происходит биохимическое разрушение матрицы носителя, представляющего собой природный полисахарид, под действием гидролитических ферментов, синтезируемых и выделяемых в среду самими иммобилизованными клетками мицелиальных грибов.

Для упрочнения гранул подобных иммобилизованных биокатализаторов предложена их дополнительная обработка сшивающим агентом, в частности глутаровым альдегидом. Так, гранулы, полученные включением спор мицелиальных грибов в Са-альгинатный гель аналогично тому, как это описано выше, переносят после экспонирования их в 1,5-2,0%-ном растворе хлорида кальция при 0-4°С в течение 1-2 ч в 0,3 М раствор глутарового альдегида и выдерживают в нем 0,5 ч, после чего 3-4 раза промывают дистиллированной водой. В результате происходит упрочнение гранул, но вследствие высокой токсичности глутарового альдегида по отношению к клеткам все основные характеристики (средняя продуктивность процесса с использованием биокатализатора и суммарно накапливающаяся в среде пектолитическая активность) снижаются в 4,8-8,0 раз [Nighojkar S., Phanse Y., Sinha D., Nighojkar A., Kumar A. Production of polygalacturonase by immobilized cells of Aspergillus niger using orange peel as inducer (2006) Proc. Biochem., V.41, p.1136-1140], что является существенным недостатком такого технического решения.

Согласно другому техническому решению тех же авторов [Nighojkar S., Phanse Y., Sinha D., Nighojkar A., Kumar A. Production of polygalacturonase by immobilized cells of Aspergilus niger using orange peel as inducer (2006) Proc. Biochem., V.41, p.1136-1140] упрочнение гранул биокатализатора, полученного включением клеток мицелиальных грибов в Са-альгинатный гель, достигается в результате частичной замены Са-альгинатного геля на гель поливинилового спирта, сшитого ионами бората. Это известное техническое решение реализуется следующим образом: к 20 мл смеси 10% раствора поливинилового спирта и 0,5% раствора альгината натрия добавляют 5 мл суспензии спор мицелиального гриба Aspergillus niger с концентрацией 10 ⁷ спор/мл. Для формирования гранул иммобилизованного биокатализатора полученную смесь прокапывают в насыщенный раствор борной кислоты, содержащий 0,3 М CaCl₂·2H₂O, и аккуратно перемешивают в течение 1 ч. Далее полученные гранулы переносят в 0,3 М раствор NaH₂PO₄×2H₂ O (рН 4,5) на 2 ч для придания им прочности, после чего их промывают водой и далее культивируют в питательной среде для получения пектиназ. Таким образом, в состав полученного иммобилизованного биокатализатора входят клетки мицелиального гриба, альгинат в комплексе с ионами кальция, поливиниловый спирт в комплексе с ионами бората и водная фаза. Точное содержание компонентов из опубликованной информации вычислить невозможно, т.к. неизвестно, в какой пропорции ионы кальция и бората связываются полимерными компонентами системы - альгинатом и поливиниловым спиртом, соответственно. Средняя продуктивность этого иммобилизованного биокатализатора по пектиназной активности составляет 0,012 Ед. мл^-1 ч^-1, а максимальная ферментативная активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время использования биокатализатора (72 ч), достигает 222 Ед.

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу иммобилизованного биокатализатора, принципу иммобилизации клеток мицелиальных грибов (включение в матрицу гелевого носителя) и полимерной основе носителя (содержащий поливиниловый спирт гелевый носитель) принято за прототип.

Это известное техническое решение имеет следующие недостатки:

1. В состав иммобилизованного биокатализатора-прототипа входят полианион-альгинат и полиол-поливиниловый спирт, предрасположенные к образованию нерастворимых полимерных комплексов, в свою очередь способных блокировать («закупоривать») транспортные каналы в клеточной стенке, через которые клеткой осуществляется секреция продуктов биосинтеза (в данном случае, пектиназ), что может быть одной из причин низкой продуктивности прототипа. Таким образом, присутствие поливинилового спирта в составе известного иммобилизованного биокатализатора является неблагоприятным фактором.

2. Полимерная матрица носителя иммобилизованного биокатализатора-прототипа представляет собой смешанный гель альгината кальция и поливинилового спирта, сшитого ионами бората. Процесс сшивания проводится в среде борной кислоты с низким значением рН, что отрицательно сказывается на жизнеспособности клеток и предопределяет низкий уровень суммарной пектиназной активности готового иммобилизованного биокатализатора.

3. Сам иммобилизованный биокатализатор не выдерживает эксплуатации более 72 ч вследствие того, что носитель теряет свою исходную прочность и разрушается в среде культивирования.

4. Кроме того, данный носитель (однофазный полимерный гидрогель) характеризуется недостаточной пористостью, что создает серьезные диффузионные ограничения в подаче питательных веществ к клеткам и отводе метаболитов в среду культивирования. Малый размер (не более 0,01-0,03 мкм) пор носителя у иммобилизованного биокатализатора-прототипа обусловлен тем, что при сшивании поливинилового спирта избытком боратных ионов образуется очень частая мелкопористая полимерная сетка [А.П.Синицын, Е.И.Райнина, В.И.Лозинский, С.Д.Спасов. (1994) Иммобилизованные клетки микроорганизмов. // 2-е изд., МГУ, М., с.144], диффузия высокомолекулярных растворимых веществ в которой стерически затруднена, что препятствует секреции макромолекул пектиназ из иммобилизованных клеток во внешнюю среду. Все эти обстоятельства предопределяют низкую среднюю продуктивность процесса по пектолитической активности.

Задачей предлагаемого технического решения является разработка высокопродуктивного иммобилизованного биокатализатора на основе клеток мицелиальных грибов, способных в иммобилизованном состоянии секретировать внеклеточные пектиназы в течение длительного времени культивирования.

Поставленная задача решается тем, что заявляемый иммобилизованный биокатализатор для микробиологического получения пектиназ содержит способные продуцировать пектиназы клетки мицелиального гриба, включенные в матрицу содержащего поливиниловый спирт гелевого носителя, который представляет собой криогель поливинилового спирта с макропорами сечением 0,5-5,0 мкм, причем иммобилизованный биокатализатор получен на основе следующих компонентов, взятых в соотношении, мас.%: клетки мицелиального гриба (по сухой массе) 0,001÷0,1; поливиниловый спирт 8,4÷12,5; водная фаза - до 100.

Применение в качестве носителя иммобилизованных клеток криогеля поливинилового спирта - гелевого материала, формируемого при замораживании-оттаивании раствора данного полимерного гелеобразователя [В.И.Лозинский (2002) Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Успехи химии, Т.71, с.559-585], обусловлено высокой пористостью образующейся гелевой матрицы, обеспечивающей незатрудненную диффузию субстратов и продуктов, соответственно, к и от иммобилизованных клеток, а также хорошими эксплуатационными характеристиками материала такого носителя.

Предлагаемое изобретение предусматривает формирование криогеля поливинилового спирта с одновременной иммобилизацией клеток мицелиальных грибов. После иммобилизации препарат помещается в среду культивирования, содержащую компоненты, необходимые для роста мицелия, т.е. образования полноценных жизнеспособных клеток, которые в таком иммобилизованном состоянии синтезируют и секретируют пектиназы. При этом заявляемый диапазон сечения макропор данного носителя найден экспериментально и обусловлен тем, что при сечении пор меньше 0,5 мкм наблюдается угнетение развития мицелия продуцента пектиназ в матрице криогеля поливинилового спирта, а при сечении пор более 5,0 мкм имеет место заметное прорастание гиф за пределы носителя, что при работе в реакторах с перемешиванием частиц иммобилизованного биокатализатора вызывает отрыв фрагментов мицелия, загрязняющих, тем самым, культуральную среду, содержащую целевой продукт.

Состав заявляемого иммобилизованного биокатализатора также найден экспериментально, причем, как оказалось, поливиниловый спирт в этом случае, в отличие от прототипа, не оказывает негативного влияния на биосинтетический и секреторный потенциал иммобилизованных клеток. Нижний предел концентрации заявляемого содержания поливинилового спирта определяется тем, что при меньшей, чем 8,4 мас.% концентрации этого гелеобразующего полимера, заметно снижаются физико-механическе характеристики иммобилизованного биокатализатора, а при более чем 12,5 мас.% содержании поливинилового спирта сильно повышается ее вязкость исходной системы, используемой для приготовления иммобилизованного биокатализатора, что затрудняет равномерное диспергирование биомассы в такой среде. Нижний предел концентрации клеток в заявляемом составе иммобилизованного биокатализатора определяется тем, что при использовании меньшей, чем 0,001 мас.% концентрации получаемый иммобилизованный биокатализатор обладает заметно меньшей пектолитической активностью, а верхний предел концентрации клеток определяется тем, что при использовании концентрации больше 0,1 мас.% происходит неполное включение всех клеток, введенных в смесь с раствором полимера, в формирующийся криогель поливинилового спирта и затем наблюдается их вымывание при помещении полученных гранул в культуральную среду для получения пектиназ. Таким образом, превышение указанного верхнего предела концентрации клеток нецелесообразно.

Получение биомассы клеток каждого конкретного мицелиального гриба для последующего включения в матрицу гелевого носителя проводится с применением известных биотехнологических приемов в соответствии с частными характеристиками конкретной культуры.

После получения клеток (для включения в криогель поливинилового спирта могут быть использованы как покоящиеся (споровый материал), так и вегетативные формы) их диспергируют в растворе поливинилового спирта с последующей криогенной обработкой (замораживанием, выдерживанием в замороженном состоянии и оттаиванием) полученной суспензии, что в результате приводит к образованию полимерного криогеля, содержащего включенные в его матрицу клетки мицелиального гриба, обладающего пектолитической активностью.

В ходе криогенной обработки получаемому биокатализатору известными способами может быть придана любая необходимая форма, в частности форма сферических гранул, частиц неправильной формы, гелевых блоков, дисков, листов, трубок и др. Для этого суспензия биомассы в растворе гелеобразователя замораживается либо в соответствующей форме, либо гранулируется с помощью специального устройства, например криогрануляционных установок [Патент РФ № 2036095 (1992); Патент РФ № 2104866 (1996)].

Получение пектиназ с помощью заявляемого иммобилизованного биокатализатора проводят путем культивирования иммобилизованных клеток в различного рода аэробных реакторах с жидкими питательными средами, традиционно применяемыми в процессах с клетками мицелиальных грибов, являющихся продуцентами внеклеточных пектиназ. Затем целевые ферменты, накопленные в культуральной среде, могут быть либо непосредственно использованы (например, в виде концентратов или высушенных препаратов) в соответствующих процессах обработки пектинсодержащих субстратов, либо, в случае необходимости (например, для получения образцов реагентной чистоты), выделены из культуральной жидкости известными приемами (например, с помощью высаливания, различных видов хроматографии, ультрафильтрации, изоэлектрофокусирования и др.).

Такой иммобилизованный биокатализатор для микробиологического получения пектиназ и такое сочетание признаков, как обладающие способностью секретировать пектиназы клетки мицелиального гриба, включенные в матрицу именно макропористого (сечение пор 0,5-5,0 мкм) криогеля поливинилового спирта, а также такой качественный и количественный состав заявляемого иммобилизованного биокатализатора, как клетки мицелиального гриба (0,001÷0,1 мас.%), способного секретировать внеклеточные пектиназы, гелеобразующий полимер - поливиниловый спирт (8,4÷12,5 мас.%) и водная фаза (до 100 мас.%), ранее известны не были и являются новым, то есть предлагаемое техническое решение отвечает критерию «новизна».

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus niger F-679 (ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназ

Для получения иммобилизованного биокатализатора к 100 г 11%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 10 мл суспензии клеток (покоящаяся форма) мицелиального гриба Aspergillus niger с концентрацией 5×10⁶ кл./мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования сферических гранул диаметром 1,4-1,6 мм. Гранулирование проводят с помощью криогрануляционной установки по Патенту РФ № 2036095 известным методом: замораживание осуществляют при -15°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 24 ч, оттаивание гранул проводят при 8°С. Получают 110 г гранул криогеля поливинилового спирта, содержащего клетки мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 1,5-2,5 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,018; поливиниловый спирт 10; водная фаза - до 100.

Ферментационный процесс получения пектиназ проводят в условиях, аналогичных прототипу (500-мл колба Эрленмейера, содержащая 100 мл питательной среды (рН 5,0) следующего состава, г/л: свекловичный пектин (15,0), NH₄SO₄ (5,0), MgSO₄ ×7H₂O (0,2), FeSO₄×7H₂ O (0,01); NaCl (5,0), KH₂PO₄ (0,1), температура культивирования 30°С). При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,41 Ед. мл^-1 ч^-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время ферментации (648 ч), достигает 191870 Ед.

Пример 2. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus foetidus F-531(ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназ

Для получения иммобилизованного биокатализатора к 47,5 г 12%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 2,5 мл суспензии клеток (вегетативная форма) мицелиального гриба Aspergillus foetidus F-531 с концентрацией 5×10⁸ кл./мл, полученных после смыва спор с поверхности твердой питательной среды 0,9% раствором NaCl и их экспонирования в этом растворе в течение 1 ч при комнатной температуре с целью инициации процесса вегетации спор, перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования гранул. Гранулирование проводят путем заливки полученной однородной массы в лунки 96-луночных иммунологических плашек со сферическим дном по 0,15 мл. Криогенную обработку проводят известным методом: замораживание осуществляют при -13°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 16 ч, оттаивание гранул проводят при 4°С. Получают 50 г гранул криогеля поливинилового спирта, содержащего споры мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 3,5-5,0 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,1; поливиниловый спирт 11,4; водная фаза - до 100.

Ферментационный процесс для получения пектиназ проводят в следующих условиях: 1-литровый реактор, снабженный термостатируемой рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры, содержащий среду следующего состава, г/л: цитрусовый пектин (8,0), глюкоза (10,0), NH₄NO₃ (7,5), KH₂ PO₄ (1,0), MgSO₄×7H₂O (0,5), FeSO₄×7H₂O (0,01), CaCl₂ (0,1); температура процесса 28±1°С. При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,43 Ед. мл^-1 ч^-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время его использования (744 ч), достигает 106500 Ед.

Пример 3. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus awamory F-9 (ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназ

Для получения иммобилизованного биокатализатора к 115 г 13%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 5 мл суспензии (3×10⁸ кл/мл) клеток (вегетативная форма) мицелиального гриба Aspergillus awamory F-9, полученной после смыва спор с поверхности твердой питательной среды стерильной водопроводной водой и их экспонирования в течение 30 мин при комнатной температуре с целью инициации выхода клеток из состояния покоящейся формы, и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для получения гранул. Гранулирование проводят путем заливки полученной однородной массы в 96-луночные иммунологические плашки с плоским дном (по 0,25 мл в лунку). Криогенную обработку проводят известным методом: замораживание осуществляют при -20°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 16 ч, оттаивание гранул проводят при 6°С. Получают 120 г криогеля поливинилового спирта, содержащего клетки мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 0,5-1,2 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,087; поливиниловый спирт, 12,5; водная фаза - до 100.

Ферментационный процесс для получения пектиназ проводят в следующих условиях: 2-литровый реактор, снабженный термостатируемой рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры, содержащий среду следующего состава, г/л: яблочный пектин (15,0), NH₄NO₃ (7,5), KH₂PO₄ (1,0), MgSO₄×7H ₂O (0,5), глюкоза (5,0); температура процесса 28±1°С. При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,14 Ед. мл ^-1 ч^-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время его использования (720 ч), достигает 164160 Ед.

Пример 4. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Penicillium funiculosum F-149 (ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназ

Для получения иммобилизованного биокатализатора к 1050 г 16%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 950 мл суспензии (5×10⁵ кл/мл) клеток (покоящаяся форма) мицелиального гриба Penicillium funiculosum F-149, полученных после смыва спор с поверхности твердой питательной среды 0,9% раствором NaCl и их хранения в этом растворе в течение 16 ч при температуре 8°С, и перемешивают до получения однородной массы. Затем ее выливают ровным слоем толщиной 0,5 см на противень, который помещают в морозильную камеру при -18°С, где препарат выдерживают в замороженном состоянии 18 ч, оттаивание проводят при 4°С. Получают криогель поливинилового спирта в виде листового материала, содержащего клетки мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 0,8-1,9 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,001; поливиниловый спирт 8,4; водная фаза - до 100.

Ферментационный процесс для получения пектиназ проводят в биореакторе с проточным режимом культивирования при непрерывном перемешивании среды (5-литровый реактор, снабженный термостатируемой рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры, содержащий среду следующего состава, г/л: пектат натрия (10,0), NH₄ NO₃ (7,5), КН₂РО₄ (1), MgSO ₄×7H₂O (0,05), глюкоза (5,0)), где иммобилизованный биокатализатор помещен в виде свернутого листа; температура процесса 28±1°С. При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,45 Ед мл^-1 ч^-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время использования биокатализатора (572 ч), достигает 830000 Ед.

Пример 5. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae F-814 (ВКПМ) для получения внеклеточных пектиназ

Для получения иммобилизованного биокатализатора к 500 г 12%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 100 мл суспензии (5×10 ⁷ кл/мл) клеток (покоящаяся форма) мицелиального гриба Rhizopus oryzae F-814 и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования гранул с помощью криогрануляционной установки (Патент РФ № 2036095) в следующих условиях: замораживание осуществляют при -13°С, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 28 ч, оттаивание гранул проводят при 4°С. Получают 600 г гранул криогеля поливинилового спирта, содержащего клетки мицелиального гриба, включенные в гелевую матрицу, сечение макропор которой, измеренное с помощью световой микроскопии тонких срезов, составляет 3,2-4,6 мкм. Приготовленный таким образом иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: клетки мицелиального гриба 0,04; поливиниловый спирт 10; водная фаза - до 100.

Ферментационный процесс для получения пектиназ проводят в следующих условиях: 2,5-литровый реактор, снабженный термостатируемой рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры, содержащий среду, состав которой указан в Примере 2; температура процесса 30±0,5°С. При использовании заявляемого биокатализатора средняя продуктивность процесса по пектолитической активности составляет 1,05 Ед. мл^-1 ч^-1, а максимальная пектолитическая активность, суммарно накапливающаяся в среде за все время использования биокатализатора (600 ч), достигает 315000 Ед.

Таким образом, заявляемое техническое решение приводит к получению иммобилизованного биокатализатора, имеющего следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:

1. Заявляемое техническое решение предусматривает применение синтетического полимера - поливинилового спирта - для формирования гелевого носителя, устойчивого к ферментативной атаке иммобилизуемыми клетками, что в результате способствует длительному (до 744 ч) сохранению иммобилизованным биокатализатором высокой механической прочности.

2. Включение клеток мицелиальных грибов, обладающих пектолитической активностью, в матрицу криогеля поливинилового спирта сохраняет их жизнеспособность и целевую ферментативную активность, что позволяет получать иммобилизованные биокатализаторы, обладающие высокой удельной и суммарной продуктивностями, и в то время как в случае прототипа наблюдалось заметное снижение этих показателей.

3. В заявляемом техническом решении, в отличие от аналогов, не используются для упрочнения носителя токсичные вещества, например глутаровый альдегид, что в случае предлагаемого изобретения способствует сохранению более высокого уровня жизнеспособности иммобилизуемой биомассы, а также повышает технологическую и экологическую безопасность производства биокатализатора.

4. Поскольку носитель иммобилизованных клеток-продуцентов пектиназ - криогель поливинилового спирта - обладает макропористостью (сечение крупных пор от 0,5 до 5,0 мкм), то это обеспечивает благоприятные условия для иммобилизованной биомассы в отношении поступления субстратов (включая кислород для дыхания аэробных мицелиальных грибов) к клеткам и отвода продуктов жизнедеятельности, включая секретируемые внеклеточные пектиназы, от клеток, что в совокупности обеспечивает существенно лучшие показатели продуктивности заявляемого иммобилизованного биокатализатора по сравнению с аналогами и прототипом.

5. Использование в качестве матрицы носителя вязкоупругого нехрупкого материала-криогеля поливинилового спирта, практически не подвергаемого абразивному износу, позволяет варьировать форму гранул биокатализатора и использовать его в различных реакторах, в том числе и в реакторах с интенсивным перемешиванием, что существенно увеличивает скорость массообменных биокаталитических процессов. Как результат, заявляемое изобретение позволяет получить иммобилизованный биокатализатор, обладающий существенно улучшенными (по отношению к аналогам и прототипу) характеристиками, а именно, как минимум, в 1,5 раза (Пример 2), а в максимуме - в 11,5 раз (Пример 4) увеличенной суммарно накапливающейся пектолитической активностью при использовании биокатализатора и, как минимум, в 1,8 раза (Пример 5), а в сравнении с прототипом - в 120 раз, увеличенной средней продуктивностью процесса по пектолитической активности.

6. Заявляемое техническое решение обладает высокой универсальностью в отношении иммобилизуемых культур, поскольку положительный эффект при реализации данного изобретения может быть получен при использовании клеток самых разных мицелиальных грибов, являющихся продуцентами внеклеточных пектиназ (см. примеры 1-5).