способ получения комбинированного липосомального антибактериального препарата
Классы МПК: | A61K9/127 липосомы A61K31/7036 содержащие по крайней мере одну аминогруппу, непосредственно присоединенную к карбоциклическому кольцу, например стрептомицин, гентамицин, амикацин, валидамицин, фортимицины C07H15/236 с сахаридным радикалом, замещенным алкиламиногруппой в положении 3 и двумя заместителями, кроме водорода, в положении 4, например гентамициновый комплекс, сисомицин, вердамицин A61K31/496 не конденсированные пиперазины, содержащие дополнительно гетероциклические кольца, например рифампин, тиотиксен |
Автор(ы): | Ротов Константин Александрович (RU), Алексеев Владимир Валерьевич (RU), Храпова Наталья Петровна (RU), Снатенков Евгений Александрович (RU), Замарин Александр Евгеньевич (RU), Курилов Виктор Яковлевич (RU), Васильев Владимир Петрович (RU), Замарин Антон Александрович (RU) |
Патентообладатель(и): | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2008-05-20 публикация патента:
20.12.2009 |
Изобретение относится к медицине, а именно к способу получения липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения и профилактики особо опасных инфекционных заболеваний. Основу способа составляет: растворение навесок липидов и рифампицина в хлороформе, приготовление раствора гентамицина сульфата, создание эмульсии из хлороформенного раствора липидов с рифампицином, получение липосом выпариванием с обращением фаз, удаление невключившихся в мембрану рифампицина и внутрь везикул гентамицина сульфата центрифугированием, отличающийся тем, что при получении липосом добавлением к хлороформенной смеси липидов рифампицина в органической фазе и увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле», это позволило встроить в мембрану антибиотик. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере исключает токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) на мембрану липосом и антибактериальные препараты, сокращает время обработки. 1 ил.
Формула изобретения
Способ получения комбинированного липосомального антибактериального препарата, включающий растворение навесок липидов и антибактериального препарата в хлороформе, приготовление раствора включаемого препарата, создание эмульсии из органического раствора и растворенного препарата и последующего получения липосом выпариванием с обращением фаз, отличающийся тем, что для получения липосом, содержащих водо- и жирорастворимые антибактериальные средства, увеличивают липидную нагрузку и применяют только один органический растворитель с определенной температурой кипения, для этого 63,3-50,1 мг смеси липидов (фосфатидил-холин, холестерин в соотношении 7:3) растворяют в 4,3-3,8 мл хлороформа и смешивают с 1,0-0,5 мл хлороформенного раствора рифампицина, содержащего 6,0-3,0 мг антибиотика, затем 28,5-7,125 мг гентамицина сульфата, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляют к раствору липидов в органической фазе, и обрабатывают на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 3 мин до достижения образования эмульсии, после чего понижают давление в роторном испарителе и полностью удаляют органический растворитель и к образовавшемуся гелю добавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивают в колбе на роторном испарителе, отделяют невключившиеся антибактериальные средства центрифугированием при 40000 g в течение 1 ч, полученный препарат липосом контролируют по размеру, проценту иммобилизации антибактериального средства и степени окисления липидов мембраны липосом.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине, а более конкретно к проблеме создания новых липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения и профилактики особо опасных инфекционных заболеваний.
Проблемы, связанные с непосредственным использованием лекарств в фармакологии и медицине, могут быть разрешены путем использования систем переносчиков (Макаров К.А., Кибардин С.А. Иммобилизованные биопрепараты в медицине. - М.: Медицина. - 1980. - 128 С.).
На сегодняшний день липосомы представляются наиболее многообещающими по сравнению с другими возможными переносчиками не только потому, что они биодеградируемы, а также из-за уникальных свойств как носителей лекарственных веществ, позволяющих включать в их внутреннее водное пространство водорастворимые, а в липидный бислой - водонерастворимые препараты, целенаправленно доставлять их в нужные области организма, снижать их токсичность и продлевать действие, предохраняя препараты от воздействия агрессивной физиологической среды (Грегориадис Г., Аллисон Л. Липосомы в биологических системах. - М.: Медицина. - 1983. - С.36-39, Саатов Т.С., Исаев Э.И., Бурханов С.А. Аутологические липосомы // Вестник Акад. мед. наук СССР. - 1990. - № 8. - С.47-50).
Особый интерес представляют липосомы как переносчики антибактериальных препаратов (Ротов К.А., Васильев В.П., Антонов Ю.В. Получение и характеристика липосом, содержащих антибиотики // Микробиол. Журн. -1989. - Т.51. - № 6. - С.79-82). Антибиотик в основном концентрируется в паренхиматозных органах (печени, селезенке), легких и, кроме того, доставка препарата путем эндоцитоза непосредственно в лизосомы уменьшает его инактивацию и позволяет оптимизировать антимикробное действие. Это приобретает особо важное значение для лечения и профилактики таких инфекций, как сап и мелиоидоз, возбудители которых находятся внутри фиксированных макрофагов.
Рядом авторов (Тихонов Н.Г., Ротов К.А., Перепелкин А.И. Липосомальные антибиотики и их использование при лечении особо опасных инфекционных заболеваний // Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье: Сб. научн. трудов ВолгНИПЧИ. - Волгоград, 2000. - С.291-301., Ротов К.А., Тихонов С.Н., Храпова Н.П., Алексеев В.В., Снатенков Е.А. Оценка эффективности лечения легочной формы острого мелиоидоза липосомальным цефазолином в эксперименте // Проблемы особо опасных инфекций. - 2007. - Вып.93. - № 1. - С.93-94) было отмечено, что иммобилизация антибиотиков в липосомы позволила значительно повысить эффективность лечения сапной и мелиоидозной инфекций в эксперименте в сравнении со свободными формами антимикробных препаратов. Показана возможность применения липосомального гентамицина сульфата, доксициклина для профилактики мелиоидозной и сапной инфекций в эксперименте (Ротов К.А., Снатенков Е.А., Алексеев В.В., Храпова Н.П. Возможность применения липосомального гентамицина сульфата для профилактики мелиоидозной инфекции в эксперименте // Санитарная охрана территорий государств - участников содружества независимых государств - проблемы биологической безопасности противодействия биотерроризму в современных условиях. Мат. междунар. научн.-практ. конфер. (13-14 сентября 2005). - Волгоград, 2005. - С.148-149., Рогов К.А., Снатенков Е.А., Замарин А.А., Тихонов С.Н., Храпова Н.П., Алексеев В.В. Протективность липосомального доксициклина при экспериментальной сапной инфекции // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Матер. Российской научн.-практ. конф. (21-22 марта 2007 г.), г.Ставрополь 2007. - С.67-68).
Вместе с тем проблема экстренной профилактики и лечения особо опасных инфекционных заболеваний разработана недостаточно.
Приготовление липосом методом «ручного» встряхивания: 100 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин, дицетилфосфат в соотношении 7:2:1) растворяют в 50 мл хлороформа в 200 мл круглодонной колбе для роторного испарителя и при пониженном давлении проводили выпаривание органического растворителя. Время окончания выпаривания определяли по исчезновению запаха хлороформа в колбе, при этом на ее стенках образовывалась тонкая пленка липидов. Снятую с роторного испарителя колбу продували газообразным азотом для предотвращения окисления липидов и затем вносили 5 мл, содержащих 28,5 мг гентамицина сульфата в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2. После 2 часовой инкубации при комнатной температуре смеси для образования гомогенной суспензии липосом в колбу помещали несколько стеклянных бусинок и энергично встряхивали в течение 5 минут. Невключившийся антибиотик удаляли центрифугированием. Мягкие условия приготовления и большие размеры липосом позволяют использовать этот метод для включения крупных биологических макромолекул без значительной потери активности. Недостатком метода является низкий процент включения материала (1-3%) (Acuto О., Pugliese О., Muler М., Tosi R. Preparation of liposomes incorporating membrane components from human lymphoid cells // Tissue Antigenes. - 1979. - V.14, № 5. - P.385-397).
Приготовление мелких моноламеллярных липосом методом ультразвуковой обработкой: взвесь липосом, полученную по методу, описанному выше, переносят в сосуд для ультразвуковой обработки и производят озвучивание в атмосфере азота. Режим озвучивания: частота - 20 кГц; мощность - 200 Вт; экспозиция - 30 мин. Для предотвращения разогрева взвеси липосом применяют ледяную баню. В процессе озвучивания происходит просветление взвеси липосом. По окончанию обработки препарат представляет собой прозрачную жидкость, опалесцирующую при боковом освещении. Образуются очень мелкие, однородные по размеру 20-200 Å моноламеллярные липосомы. Включение материала не превышает 1,5%. Данным способом можно включать низкомолекулярные вещества, устойчивые к ультразвуку. В основном он применяется в биофизических исследованиях мембран (Papahadjopoulos D., Wotkins J.C. Phospholipid model membrynes. II. Permeabilyti properties of hydrated liguid crystals. - Biochim. et biophys. Acta, 1967, vol. 135, p.639-652).
Наиболее близким аналогом является метод получения липосом, предложенный Szoka F., Papahandjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal space and high capture by reverse-phase evaporation // Proc. Nat. Sci. USA. - 1978. - V.75, N 9. - P.4194-4198. Согласно методу 30 мг липидов (фосфатидилхолин, холестерин, дицетилфосфат в соотношении 7:2:1) растворяют в 3 мл смеси эфира с хлороформом 2:1 и вносят в круглодонную колбу роторного испарителя объемом 100 см3. 1 мл раствора включаемого материала (гентамицина сульфат - 28,5 мг) в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5 добавляют к раствору липидов в органической фазе и обработкой ультразвуком 20 кГц, мощностью 200 Вт в течение 5 минут достигают образования эмульсии типа «вода в масле». Колбу с эмульсией присоединяют к роторному испарителю, и постепенно понижая давление так, чтобы не происходило кипение, полностью удаляют органический растворитель. Об окончании выпаривания судят по образованию геля в колбе и исчезновению запаха органического растворителя. В процессе выпаривания поддерживают температуру смеси выше температуры фазового перехода фосфолипидов (20-25°С). Колбу снимают с испарителя, к образовавшемуся гелю добавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,5 и встряхивают до образования гомогенной суспензии липосом. Липосомы, полученные данным методом, характеризуются высокой эффективностью включения - до 50-60% и большими размерами - до 1,0-1,2 мкм. Невключившийся материал удаляют центрифугированием. Недостатком является малая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле», вследствие чего в каждом конкретном случае требуется подбор состава липидной смеси, техники выпаривания и навыка в работе, использование смеси растворителей с разной температурой кипения, что приводит к неоднородному образованию фосфолипидных везикул (температура кипения эфира +34,5°С, температура кипения хлороформа +61,2°С), а также токсическое воздействие ионов титана на антигенный материал и фосфолипиды (Г. Грегориадис, А. Аллисон. Липосомы в биологических системах. - М.: Медицина. - 1983. - С.28-29).
Целью изобретения является получение комбинированного липосомального антибактериального препарата, содержащего в мембране водонерастворимый рифампицин, во внутреннем объеме - гентамицина сульфат.
Поставленная цель достигается тем, что вследствие увеличения липидной нагрузки происходит встраивание рифампицина в мембрану липосом, повышается ее стабильность и возрастает процент инкапсуляции гентамицина сульфата. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) на антибактериальные препараты и фосфолипиды. Для этого 63,3-50,1 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 4,3-3,8 мл хлороформа и смешивали с 1,0-0,5 мл хлороформенного раствора рифампицина, содержащего 6,0-3,0 мг антибиотика. 28,5-7,125 мг гентамицина сульфата, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе и обработкой на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 3 мин достигали образования эмульсии. При пониженном давлении в роторном испарителе полностью удаляли органический растворитель. К образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивали в колбе на роторном испарителе. Отделение невключившихся антибиотиков проводили центрифугированием при 40000 g в течение 1 ч на центрифуге «Ja-21» «Bechman» (США). В супернатанте определяли радиоизотопным методом по двум меткам 125I-рифампицин и 14С-гентамицина сульфат.
Увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) и сократить время обработки.
Добавлением к хлороформенной смеси липидов рифампицина в органической фазе и увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Это позволило встроить в мембрану антибиотик. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) и сократить время обработки. Данный способ позволяет встроить в мембрану 50% рифампицина и инкапсулировать внутрь липосом 70% гентамицина сульфата.
Примеры конкретного выполнения:
Пример 1. Получение липосом с высоким содержанием в мембране рифампицина и внутри везикул гентамицина сульфата
Предлагаемая дозировка может найти применение для создания максимальных концентраций антибактериальных средств в среде макроорганизма.
Для этого 63,3 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 4,3 мл хлороформа и смешивали с 2,0 мл хлороформенного раствора рифампицина, содержащего 6 мг антибиотика. 28,5 мг гентамицина сульфата, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе и обработкой на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 3 мин достигали образования эмульсии. При пониженном давлении в роторном испарителе полностью удаляли органический растворитель. К образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивали в колбе на роторном испарителе. Отделение невключившихся антибиотиков проводили центрифугированием при 40000 g в течение 1 ч на центрифуге «Ja-21» «Bechman» (США). Процент иммобилизации антибиотиков определяли радиоизотопным методом. Он составлял 50% для рифампицина и 70% для гентамицина сульфата. Размеры липосомального препарата при электронно-микроскопическом исследовании составляли 600-800 нм (чертеж). Степень окисления липидов мембраны липосом составляла 0,8±0,02 (перекисный индекс Клейна) (Klein R.A. The detection of oxidation in liposome preparations // Biochim. Biophys. Acta. - 1970. - N 21. - P.486-489).
Пример 2. Получение липосом с низким содержанием в мембране рифампицина и внутри везикул гентамицина сульфата
Предлагаемые дозы антимикробных препаратов можно использовать в качестве последующего поддерживающего лечения.
Для получения липосом 50,1 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 3,8 мл хлороформа и смешивали с 0,5 мл хлороформенного раствора рифампицина, содержащего 1,5 мг антибиотика. 7,125 мг гентамицина сульфата, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе. Далее методика приготовления препарата идентична указанной в примере 1.
Таким образом, добавлением к хлороформенной смеси липидов рифампицина в органической фазе и увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Это позволило встроить в мембрану антибиотик. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) на мембрану липосом и антибактериальные препараты и сократить время обработки. Данный способ позволяет встроить в мембрану 50% рифампицина и инкапсулировать внутрь липосом 70% гентамицина сульфата.
Класс A61K31/7036 содержащие по крайней мере одну аминогруппу, непосредственно присоединенную к карбоциклическому кольцу, например стрептомицин, гентамицин, амикацин, валидамицин, фортимицины
Класс C07H15/236 с сахаридным радикалом, замещенным алкиламиногруппой в положении 3 и двумя заместителями, кроме водорода, в положении 4, например гентамициновый комплекс, сисомицин, вердамицин
Класс A61K31/496 не конденсированные пиперазины, содержащие дополнительно гетероциклические кольца, например рифампин, тиотиксен