штамм bifidobacterium bifidum ov-19, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств

Формула изобретения

Штамм Bifidobacterium bifidum OV-19 коллекционный номер № 216, хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и прочих лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и многих других причин [1, 4].

Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, урогенитальной сферы и устранять дисбиотические нарушения.

Вместе с тем, рационализация подхода к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должна основываться на закономерностях, связанных с процессами стабилизации нормобиоценоза, в особенности, учитывать такое явление, как аутогенная сукцессия - последовательная смена микробиоценозов в процессе онтогенеза, в результате которой происходит вытеснение одних видов микроорганизмов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в данных условиях. При этом образуется сукцессионный ряд - серия с конечным формированием относительно стабильного биоценоза. Данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза, совпадающей с критическими периодами развития в детском и подростковом возрасте; в то же время у взрослых людей состав бифидофлоры относительно стабилен [8].

Исследования видового состава бифидофлоры, проводившиеся ранее с применением биохимических методов идентификации, позволили сделать заключение о том, что бифидобактерии в организме человека представлены пятью основными видами - Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve и В. infantis (патенты РФ 1347221, 849779, 2108383, 2152993, 863639, 2120991, 2078814, 2111248). При этом анализ полученных данных показал, что виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп; вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. infantis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста [3, 6].

Анализ ДНК, начатый в 70-е годы, позволил идентифицировать новые виды бифидобактерии (В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. dentium, В. animalis, В. angulatum.) и расширить представления о видовом составе бифидофлоры человека и закономерностях ее становления. [2, 5, 8, 9].

Виды В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. dentium, В. animalis, В. angulatum характерны для микробиоценоза детей младшего возраста. Вместе с тем, уже на новом методическом уровне подтверждены данные о том, что виды В. bifidum и В. longum остаются доминантными представителями бифидофлоры человека во все возрастные периоды жизни. Это означает, что оптимальная формула пробиотического средства должна включать как «подвижную», меняющуюся в процессе онтогенеза часть, которая комплементарна микробиоценозу определенной возрастной категории людей, так и «консервативную», состоящую из видов, стабильно сохраняющихся в процессе онтогенеза. В связи с этим селекция перспективных штаммов бифидобактерии, относящихся к видам В. bifidum и В. longum, как универсальных и наиболее распространенных, представляет особый интерес при создании средств коррекции микрофлоры.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма В. bifidum OV-19, обладающего антагонистической активностью, устойчивостью к внешним воздействиям и средствам антибактериальной терапии, высокой кинетикой накопления биомассы на питательных средах при промышленном выращивании.

Штамм В. bifidum OV-19 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находившегося на грудном вскармливании, и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под № 216.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах (капсулы, таблетки, суспензии, суппозитории, аэрозоли), биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, в том числе детского питания, соков, напитков и т.д. Также штамм В. bifidum OV-19 может быть применен в производстве гигиенических и косметических средств, например кремов, гелей, косметических масок.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма В. bifidum OV-19, который может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности в составе бактерийных препаратов, биологически активных добавок, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Штамм В. bifidum OV-19 в ходе технологического процесса на производственных средах в короткие сроки накапливает биомассу с высоким содержанием бифидобактерии, обладает антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, широким спектром устойчивости к антибактериальным средствам, кислой среде, нетоксичен, что обеспечивает активную колонизацию биотопа и восстановление резидентной микрофлоры.

Применение данного штамма расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микрофлоры человека и позволит создать формулу симбиотической ассоциации видов бифидобактерии, наиболее приближенную к составу микробиоценоза кишечника современного человека.

Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические свойства

Клетки штамма В. bifidum OV-19 представляют собой Грам+полиморфные, бесспоровые неподвижные тонкие, слегка изогнутые палочки с утолщениями на обоих концах, расположенные одиночно, попарно под углом в 60° друг к другу или в виде тетраэдра.

В полужидких питательных средах клетки растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза; отдельно выросшие колонии через 16-24 часа роста имеют форму гвоздиков.

Физиолого-биохимические свойства

Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания 37-38°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L + молочной кислоты без образования газа, закисляя среду до pH 3,5-4,0. Ферментирует галактозу, эскулин, раффинозу, арабинозу, ксилозу. Не ферментирует мальтозу, фруктозу, лактозу, мелецитозу, сахарозу, салицин, трегалозу, маннитол, рамнозу, маннозу, целлобиозу, сорбитол. На уреазу, нитраты и индол - тест отрицательный.

Генотипирование штамма B. bifidum OV-19 осуществлялось на основе амплификации, клонирования и последующего секвенирования фрагментов генов, кодирующих 16S рибосомальную РНК и трансальдолазу. Прочитанные последовательности ДНК зарегистрированы в GenBank под номерами EU 272013 и EU 272019.

Культуральные свойства

Штамм активно накапливает биомассу на различных производственных средах до высоких показателей содержания КОЕ/мл бифидобактерии и органических кислот (таблица 1). Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.

Таблица 1.
Показатели содержания бифидобактерии и органических кислот при культивировании штамма B. bifidum OV-19 на разных средах выращивания
Питательная среда	КОЕ/мл	0T
Среда для культивирования бифидобактерии (БС)	5,0×109	174
МРС	5,6×109	205
Гидролизатно-молочная среда	6,0×10 9	210
Печеночная среда	5,8×109	210
Молоко восстановленное обезжиренное	5,0×10 8	90

Данные, представленные в таблице 1, показывают, что штамм В. bifidum OV-19 накапливает на производственных средах биомассу бифидобактерии с содержанием КОЕ/мл не ниже lg 9. При этом отмечаются также высокие показатели титруемой кислотности, что говорит об активном накоплении органических кислот. Молоко сквашивает к 18 часам культивирования с образованием ровного без сыворотки сгустка с кисломолочным запахом и вкусом. При культивировании в молоке значение кислотности составляет не более 90°Т.

В таблице 2 представлены данные культивирования штамма В. bifidum OV-19 в течение 96 часов на обезжиренном молоке и бифидум-среде.

Таблица 2.
Показатели культивирования штамма В. bifidum OV-19 в течение 96 часов
Время выращивания после посева, (ч)	Выращивание на молоке	Выращивание на БС среде
0T	КОЕ/мл	0T	КОЕ/мл
0	18	5,0×106	34	2,1×10 6
24	85	2,0×108	168	5,0×10 9
36	90	2,0×108	178	4,6×10 9
48	90	2,1×108	188	4,9×10 9
72	96	1,8×108	195	4,8×10 9
96		1,8×10 8	201	4,8×109

Данные, представленные в таблице 2, демонстрируют, что при длительном культивировании штамма В. bifidum OV-19 при нарастании содержания органических кислот в культуральной жидкости и обезжиренном молоке не происходит снижения содержания жизнеспособных клеток бифидобактерии, что говорит о высокой устойчивости штамма B bifidum OV-19 к кислой среде.

Таким образом, из приведенных данных видно, что штамм В. bifidum OV-19 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах накапливает биомассу бифидобактерии и органические кислоты в короткие сроки и с высокими показателями. Устойчив к кислой среде. Сквашивает молоко, что делает возможным изготовление на его основе ферментированных кисломолочных продуктов с ценными лечебно-профилактическими и органолептическими свойствами.

Антагонистическая активность штамма В. bifidum OV-19 изучалась методом отсроченного антагонизма с тест-культурами условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (таблица 3).

Таблица 3.
Антагонистическая активность штамма В. bifidum OV-19
№	Штамм тестируемого микроорганизма	Зона задержки роста в присутствии штамма В. bifidum OV-19, мм
1	Staphylococcus aureus АТСС 653 8-Р	15±4
2	Shigella flexneri 337	19±3
3	Shigella sonnei 177	18±5
4	Proteus vulgaris 1274	18±3
5	Escherichia coli 157	12±3

Результаты, представленные в таблице 3, показали, что при нанесении тест-культур на суточную культуру штамма В. bifidum OV-19 на агаризованной среде (метод перпендикулярных штрихов), их рост подавляется. Размер зон задержки роста свидетельствует о том, что штамм В. bifidum OV-19 проявляет высокие антагонистические свойства в отношении тестируемых культур.

Чувствительность к антибиотикам штамма В. bifidum OV-19 изучалась на модели 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили дискодиффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского с учетом рекомендаций МУК 4.2.1890-04 [7]. Полученные данные представлены в таблице 4.

Таблица 4
Антибиотикочувствительность штамма В. bifidum OV-19
№	Наименование антибиотика	Интерпретация зон, мм	Содержание активного вещества в диске, мкг	Диаметр зоны ингибирования роста, мм
Устойчив	Промежуточно устойчив	Чувствителен
1	Бензилпенициллин	19	20-27	28	10	30±2
2	Оксациллин	10	11-13	14	10	15±0
3	Ампициллин	10	11-14	16	10	25±2
4	Карбенициллин	14	15-18	19	25	40±0
5	Азлоциллин	13	14-16	16	75	28±2
6	Цефалотин	14	15-18	19	30	36±2
7	Цефалексин	14	15-18	19	30	35±0
8	Цефазолин	14	15-18	19	30	25±2
9	Цефтазидим	14	15-17	18	30	25±2
10	Цефотаксим	14	15-20	21	30	35±2
11	Имипенем	13	14-15	16	10	35±0
12	Стрептомицин	16	17-19	20	30	15±0
13	Неомицин	12	13-16	17	30	10±0
14	Канамицин	14	15-18	19	30	0±0
15	Гентамицин	12	13-14	15	10	8±0
16	Амикацин	14	15-16	17	30	0±0
17	Тетрациклин	16	17-21	22	30	28±0
18	Доксициклин	15	16-19	20	10	35±0
19	Эритромицин	17	18-21	22	15	30±0
20	Азитромицин	13	14-17	18	15	25±0
21	Кларитромицин	13	14-17	18	15	35±0
22	Рокситромицин	13	15-18	19	30	35±0
23	Линкомицин	19	20-23	24	15	35±0
24	Клиндамицин	14	15-20	21	2	35±2
25	Ванкомицин	14	15-16	17	30	25±2
26	Хлорамфеникол (левомицитин)	15	16-18	19	30	35±2
27	Рифампицин	12	13-15	16	5	35±0
28	Полимиксин	11	12-14	15	300ЕД	0±0
29	Налидиксовая кислота	12	13-17	18	30	8±0
30	Ципрофлоксацин	15	16-20	21	5	15±3
31	Пефлоксацин	14	15-21	22	10	8±0
32	Ломефлоксацин	18	19-21	22	10	20±2

Как видно из таблицы 4, штамм устойчив к полимиксину, амикацину, канамицину, неомицину, стрептомицину, гентамицину, ципрофлоксацину, пефлоксацину, налидиксовой кислоте, промежуточно устойчив к оксациллину, ломефлоксацину. К остальным антибиотикам, используемым в исследовании, штамм чувствителен.

Безвредность

В опыте изучения острой токсичности штамма В. bifidum OV-19 показана его полная безвредность: при введении белым мышам per os микробной взвеси бифидобактерии в количестве 5×10⁷ КОЕ на животное, гибели мышей не отмечено.

Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм В. bifidum OV-19 отличается высокой технологичностью, активно наращивает биомассу бифидобактерии на производственных средах с содержанием бифидобактерии не ниже 10⁹ КОЕ/мл, образует в процессе культивирования органические кислоты, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, устойчив к повышенной кислотности. Сквашивает молоко с образованием сгустка. Безвреден при введении лабораторным животным.

Представленные данные изучения штамма В. bifidum OV-19 позволяют сделать заключение об его перспективности при использовании как основы для бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, а также средств гигиенического и косметического назначения.

Пример 1. Использование штамма В. bifidum OV-19 для получения биологически активной добавки к пище в жидкой форме.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. bifidum OV-19 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл, и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (1 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (20 литров) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в объеме 3-5% в аппарат для культивирования со стерильной гидролизатно-молочной средой следующего состава (в расчете на 1 литр среды): гидролизат молока - 0,5 л, пептон - 2 г, лактоза - 10 г, хлористый натрий - 5 г, цистеин - 0,2 г, агар-агар - 1 г, дистиллированная вода - 0,5 литра; pH среды - 7,0-7,2. Проводят культивирование в течение 16-24 часа при температуре 37-38°С. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат бифидобактерии с содержанием бифидобактерии не менее 10⁹ КОЕ/мл, который можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического назначения. Готовый продукт разливают по 100 мл во флаконы и герметично укупоривают.

Пример 2. Использование штамма В. bifidum OV-19 в качестве ингредиента неферментированного пищевого продукта.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. bifidum OV-19 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10 ^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в гидролизатно-молочную среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10⁹ КОЕ/мл бифидобактерии.

Готовая биомасса служит для обогащения пищевых продуктов. Ее вносят в молоко, соки, детское питание, мороженое и другие продукты, перемешивают и разливают или фасуют в емкости, получая продукт с концентрацией бифидобактерии 10^6-7 КОЕ/мл или КОЕ/г.

Пример 3. Использование штамма В. bifidum OV-19 для получения бактерийного препарата.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. bifidum OV-19 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в казеиново-дрожжевую среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10 ⁹ КОЕ/мл бифидобактерии.

К готовой биомассе добавляют сахарозожелатиновую защитную среду высушивания в объеме 10-15% и 15-20% обезжиренного молока. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при 40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат имеет не менее 10⁸ КОЕ/г живых клеток бифидобактерии.

Пример 4. Использование штамма В. bifidum OV-19 для получения капсулированной формы биологически активной добавки к пище.

Для капсулирования готовят смесь, в которую входят следующие ингредиенты: 1 часть сухой биомассы, содержащая не менее 10⁹ КОЕ/г бифидобактерии, 6 частей инулина и 3 части яблочного пектина. К смеси, из расчета получившейся массы добавляют 0,5% аэросила и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы № 0 по 0,4 г. В 1 г БАД к пище содержится не менее 10 ⁸ КОЕ жизнеспособных бифидобактерии.

Пример 5. Использование штамма В. bifidum OV-19 для получения гигиенических и косметических средств.

Сухую биомассу бифидобактерии штамма В. bifidum OV-19 с содержанием бифидобактерии не менее 10⁹ КОЕ/г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема.

Пример 6. Использование штамма В. bifidum OV-19 для получения кисломолочного продукта.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. bifidum OV-19 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до

10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в стерильное обезжиренное молоко в количестве 5% к его объему и культивируют при 37-38°С до сквашивания (в течение 16-18 часов). Готовый продукт охлаждают и разливают по 0,2 л в пластиковые стаканчики и укупоривают крышками из металлической фольги. Продукт содержит не менее 10⁸ КОЕ/мл бифидобактерии.

Список литературы

1. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. / Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007, с.300.

2. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. /Дифференцирование видов бифидобактерии на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. Научно-практический журнал «Клиническое питание», 2007, № 1-2, с.31.

3. Гончарова Г.И., Вилыпанская Ф.Л., Ж. микробиол., 1968, № 7, с.55.

4. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. / Функциональное питание. М., Грант, 2002, с.295.

5. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. /Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерии на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. Научно-теоретический журнал «Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук», 2006, № 5, с.9-12.

6. Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. / Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерии в составе средств профилактики и лечения дисбактериозов кишечника. Сб. научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 1986, с.64-69.

7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04, 2004.

8. Соколова К.Я., Соловьева И.В. / Дисбактериозы. Теория и практика. Н.Новгород, 1999, 198 с.

9. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. / Бифидобактерии: традиционный взгляд и современные генетические исследования. Журнал «Вопросы практической педиатрии», 2007, т.2, № 5, с.76-79.