способ получения церулоплазмина

Формула изобретения

1. Способ получения церулоплазмина, характеризующий тем, что обрабатывают осадок IV фракции плазмы крови по Кону 0,1 М натрий ацетатным буферным раствором с pH 5,5-5,8, приготовленный раствор наносят на ДЕАЕ сорбент в режиме «кипящего слоя», элюируют тем же буферным раствором, содержащем 0,33 М NaCl, затем проводят вирусную инактивацию путем сольвент-детергентной обработки элюата, инактивированный элюат дополнительно подвергают хроматографической очистке на карбоксильном катионите ацетатным буферным раствором с pH 5,1-5,3, причем на первой стадии используют ацетатный буферный раствор, содержащий 7%-ный этанол и 1%-ный твин 80, а на второй стадии - ацетатный буферный раствор, содержащий 15%-ный этанол, элюирование целевого продукта осуществляют 0,4 М ацетатным буферным раствором с pH, равным 5,1-5,3, продукт подвергают диализу и стерилизующей фильтрации.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что вирусную инактивацию осуществляют смесью трибутилфосфата и твина 80.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения высокоочищенного церулоплазмина, свободного от вирусов, методами хроматографии.

Известен способ получения церулоплазмина, включающий сорбционную очистку на ДЕАЕ-сорбенте, осаждение примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделение их центрифугированием с последующим осаждением целевого продукта этиловым спиртом, его растворением, стерилизующей фильтрацией и лиофильным высушиванием.

(SU 1826193, 10.09.1995)

Известен способ получения церулоплазмина, включающий гомогенизацию осадка спиртовой фракции по Кону в растворе хлористого натрия, тепловую денатурацию белковых примесей, сорбцию на ДЕАЕ-сефадексе, элюирование раствором хлористого натрия, осаждение целевого продукта этиловым спиртом, растворение осадка, стерилизующую фильтрацию и пастеризацию с последующим лиофильным высушиванием.

(RU 2162338, 27.01.2001)

Недостатками описанных выше способов являются невысокая чистота и недостаточная вирусологическая безопасность продукта.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату является способ получения церулоплазмина, включающий гомогенизацию осадка спиртовой фракции по Кону в растворе хлористого натрия, тепловую денатурацию белковых примесей, сорбцию на ДЕАЕ-целлюлозе, элюирование раствором хлористого натрия, осаждение целевого продукта этиловым спиртом, растворение осадка в присутствии добавок маннитола, стерилизующую фильтрацию и пастеризацию с последующим лиофильным высушиванием.

(RU 2225725, 20.03.2004)

Недостатками способа являются низкая производительнеость (полный цикл составляет 3-4 суток), значительные потери целевого вещества (до 50%) и недостаточная вирусологическая безопасность полученного продукта.

Задачей настоящего изобретения является увеличение производительности способа, повышение выхода и вирусологической безопасности церулоплазмина.

Поставленная задача решается описываемым способом получения церулоплазмина, который включает гомогенизацию осадка IV фракции плазмы крови по Кону в растворе, контактирование полученного раствора с сорбентом, содержащим диэтиламиноэтиловые группы, промывку сорбента, элюирование церулоплазмина и стерилизующую фильтрацию, причем контактирование раствора с сорбентом осуществляют в хроматографической колонне в режиме «кипящего слоя», после элюирования церулоплазмина проводят вирусную инактивацию путем сольвент-детергентной обработки элюата, и инактивированный элюат дополнительно подвергают хроматографической очистке на карбоксильном катионите.

Предпочтительно гомогенизацию осадка плазмы крови осуществляют в ацетатном буферном растворе с pH, равным 5,5-5,8.

Предпочтительно в качестве сорбента, содержащего диэтиламиноэтиловые (ДЕАЕ) группы, используют сорбент на основе акрилата.

Предпочтительно элюирование церулоплазмина осуществляют ацетатным буферным раствором с pH, равным 5,5-5,8.

Предпочтительно вирусную инактивацию осуществляют смесью трибутилфосфата и твина 80.

Предпочтительно хроматографическую очистку на карбоксильном катионите проводят при pH, равном 5,1-5,3.

Перед стерилизующей фильтрацией возможно проведение диализа.

Использование режима «кипящего слоя» в процессе сорбции церулоплазмина на колонке позволяет отделить раствор от агломератов, препятствующих реализации традиционного хроматографического режима. Проведение сольвент-детергентной обработки повышает вирусологическую безопасность продукта, а использование дополнительной хроматографической стадии очистки повышает чистоту конечного продукта. Проведение всего процесса в режиме хроматографии позволяет избавиться от громоздких стадий объемной отмывки сорбента и стадий осаждения/растворения и центрифугирования.

Ниже приведены конкретные примеры осуществления способа.

Пример 1.

15 кг осадка фракции IV по Кону, предварительно отмытого водой от альбумина, содержащего 70 г церулоплазмина, помещают в реактор, заливают 300 л охлажденного до 4°С 0,1 М натрий-ацетатного буфера с pH 5,65, и медленно перемешивают в течение 1,5 часов.

Колонну размерами 300×570 мм с адаптером и рабочим объемом 40 л заполняют 20 л сорбента, содержащего диэтиламиноэтиловые (ДЕАЕ) группы, на основе акрилового полимера с размером частиц 100-250 мкм (Диасфер-АК-ДЕАЕ, ЗАО «БиоХимМак СТ»).

Адаптер опускают до уплотнения слоя сорбента и уравновешивают колонну 0,1 М раствором ацетата натрия с pH 5,65, пропуская 90 л того же буфера со скоростью 0,7 л/мин сверху-вниз.

Адаптер поднимают в верхнее положение и наносят подготовленный раствор сырья в обратном направлении снизу-вверх в "кипящем слое" при слабом перемешивании раствора сырья в реакторе. Начальная скорость нанесения - 0,4 л/мин. По мере нанесения пробы сорбент приобретает голубую окраску. Скорость нанесения пробы увеличивают, поддерживая одинаковый верхний уровень сорбента в «кипящем слое».

После нанесения всего раствора сырья на колонну в том же направлении через колонну пропускают 400 л холодного (4°С) 0,1 М ацетата натрия, pH 5,65 с той же скоростью.

Адаптер опускают до уплотнения слоя сорбента и меняют направление промывки тем же буферным раствором на обратное - сверху-вниз. Промывку продолжают до значения оптической плотности буферного раствора, выходящего из колонны 0,1 ОЕ при 280 нм.

Элюирование церулоплазмина осуществляют 45 л 0,1 М натрий-ацетатного буферного раствора с pH 5,65, содержащего 0,33 М NaCl. Сбор целевой фракции контролируют при длине волны 610 нм. Скорость элюирования 0,2 л/мин. Объем целевой фракции составляет 40-50 л.

Затем осуществляют вирусную инактивацию. Для этого в целевую фракцию добавляют трибутилфосфат и твин 80 до их концентрации в растворе 1% каждого и перемешивают в течение 8 часов при комнатной температуре. Затем к раствору добавляют разбавленную уксусную кислоту до значения pH 5,2 и разбавляют дистиллированной водой до значения электропроводности раствора, соответствующего 50 мМ натрий-ацетатному буферному раствору с pH 5,2.

Полученный раствор церулоплазмина подвергают дополнительной очистке. Для этого раствор наносят со скоростью 0,3 л/мин сверху-вниз на колонну, заполненную 3 л карбоксильного катионита (СМ-Сефароза Fast Flow, "GE Healthcare", Швеция) и предварительно уравновешенного 50 мМ натрий-ацетатным буферным раствором с pH 5,2.

Затем колонну промывают, последовательно пропуская через нее со скоростью 0,1 л/мин 12 л 50 мМ натрий-ацетатного буфера с pH 5,2, содержащего 7% этанола и 1% твина 80, и 12 л 50 мМ натрий-ацетатного буфера с pH 5,2, содержащего 15% этанола, затем скорость снижают вдвое и пропускают 12 л 50 мМ натрий-ацетатного буфера с pH 5,2.

Элюирование церулоплазмина с катионита осуществляют 0,4 М натрий-ацетатным буфером с pH 5,2 со скоростью 0,2 л/мин. Сбор целевой фракции контролируют при длине волны 610 нм.

Получают 51 г церулоплазмина в объеме 2 л. Выход - 73%. Показатель соотношения оптической плотности 610/280 нм=0,04.

Продукт диализуют и проводят стерилизующую фильтрацию.

Полный цикл получения продукта не превышает 48 часов.

Таким образом, по сравнению с прототипом получают продукт гарантированно свободный от вирусов. При этом значительно повышается производительность процесса (в 1,5-2 раза) и выход очищенного продукта.