способ получения функционально активного рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы (lf), рекомбинантная плазмидная днк petgst-lfmin, кодирующая активный белок lf, и штамм escherichia coli bl-gstlfmin, продуцирующий активный белок летального фактора сибирской язвы

Классы МПК:C12P21/00 Получение пептидов или протеинов
C07K2/00 Пептиды с неопределенным числом аминокислот; их производные
C12N1/21 модифицированные введением чужеродного генетического материала
C12N15/31 гены, кодирующие микробные белки, например энтеротоксины
C12N15/63 введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии
Автор(ы):, , ,
Патентообладатель(и):Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2007-11-23
публикация патента:

Сконструирована новая рекомбинантная плазмида pETGST-LFmin (7704 п.н.), содержащая каталитически активный фрагмент гена летального фактора (LF) сибирской язвы под контролем промотора бактериофага Т7, детерминанту устойчивости к ампициллину и последовательность глютатион-S-трансферазы для эффективной очистки рекомбинантного белка на сорбенте с иммобилизованным глютатионом. Плазмида обеспечивает эффективный синтез белка LF сибирской язвы, химеризованного с последовательностью глютатион-S-трансферазы для очистки на иммобилизованном глютатионе. Штамм Escherichia coli BL-LFminGST получен трансформацией указанных плазмидных ДНК в штамм E.coli BL21 (ВЕЗ), который обеспечивает выход синтезируемого белка LF не менее 90 мг/1 г сырой биомассы. Активный белок LF получен способом, предусматривающим культивирование указанного рекомбинантного штамма, разрушение бактериальных клеток в буферном растворе рН 7,4 в присутствии Тритона Х-100 и протеазного ингибитора, очистку на сорбенте с иммобилизованным глютатионом. Способ обеспечивает выход протеолитически активного рекомбинантного химерного очищенного белка LF сибирской язвы в количестве не менее 70 мг/1 г сырой биомассы. 3 н.п. ф-лы, 3 ил.

способ получения функционально активного рекомбинантного белка   летального фактора сибирской язвы (lf), рекомбинантная плазмидная   днк petgst-lfmin, кодирующая активный белок lf, и штамм escherichia   coli bl-gstlfmin, продуцирующий активный белок летального фактора   сибирской язвы, патент № 2355769 способ получения функционально активного рекомбинантного белка   летального фактора сибирской язвы (lf), рекомбинантная плазмидная   днк petgst-lfmin, кодирующая активный белок lf, и штамм escherichia   coli bl-gstlfmin, продуцирующий активный белок летального фактора   сибирской язвы, патент № 2355769 способ получения функционально активного рекомбинантного белка   летального фактора сибирской язвы (lf), рекомбинантная плазмидная   днк petgst-lfmin, кодирующая активный белок lf, и штамм escherichia   coli bl-gstlfmin, продуцирующий активный белок летального фактора   сибирской язвы, патент № 2355769 способ получения функционально активного рекомбинантного белка   летального фактора сибирской язвы (lf), рекомбинантная плазмидная   днк petgst-lfmin, кодирующая активный белок lf, и штамм escherichia   coli bl-gstlfmin, продуцирующий активный белок летального фактора   сибирской язвы, патент № 2355769

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pETGST-LFmin, обеспечивающая синтез гибридного рекомбинантного активного белка летального фактора сибирской язвы в клетках Escherichia coli, имеющая молекулярную массу 5,08 МДа, состоящая из BamHI-NdeI фрагмента ДНК коммерческой плазмиды pET22b(+); фрагмента глютатион-5-трансферазы и пептида c-myc, а также BamHI/SalI фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность фрагмента гена летального фактора сибирской язвы без домена, содержащая в качестве генетического маркера ген способ получения функционально активного рекомбинантного белка   летального фактора сибирской язвы (lf), рекомбинантная плазмидная   днк petgst-lfmin, кодирующая активный белок lf, и штамм escherichia   coli bl-gstlfmin, продуцирующий активный белок летального фактора   сибирской язвы, патент № 2355769 -лактамазы, детерминирующий устойчивость клеток Escherichia coli BL21 (DE3), трансформированных плазмидой pETGST-LFmin, к антибиотикам пенициллинового ряда; уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI: XhoII 657 пн, EcoRI 683 пн, StuI 748 пн, Xhol 801 пн, BcoI 801 пн.

2. Штамм Escherichia coli BL-GSTLFmin, продуцирующий гибридный полипептид, содержащий летальный фактор сибирской язвы, химеризованный с глютатион-S-трансферазой и пептидом с-myc.

3. Способ получения рекомбинантного летального фактора сибирской язвы, включающий трансформацию клеток Escherichia coli BL21 (DE3) экспрессионной плазмидной ДНК pETGST-LFmin, кодирующей рекомбинантный белок летального фактора сибирской язвы, культивирование полученного штамма, разрушение бактериальных клеток добавлением Тритона Х-100 в буферном растворе рН 7,4, содержащем протеазный ингибитор, с последующей очисткой целевого продукта на сорбенте с иммобилизованным глютатионом.

Описание изобретения к патенту

обретение относится к биотехнологии, конкретно - к области генной инженерии, касается способа получения активного рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую синтез белка летального фактора сибирской язвы, штамм бактерий Escherichia coli, который может быть применен как продуцент данного белка, и методику выделения и очистки активного белка летального фактора сибирской язвы из бактериальной биомассы.

Летальный фактор сибирской язвы (LF) наряду с протективным антигеном (РА) представляет собой важнейший компонент летального токсина сибирской язвы и является основным фактором, определяющим летальный исход при сибиреязвенной инвазии. Основной областью применения активного белка LF являются биологические исследования, биомедицина и разработка лекарств, в частности разработка диагностических китов для раннего определения и фармацевтических препаратов для терапии сибиреязвенной инфекции и вакцинации против сибирской язвы. Это может иметь важное значение как для борьбы с локальными вспышками заболевания, так и для быстрой нейтрализации последствий возможных биотеррористических актов с использованием бактерий или спор бактерий сибирской язвы.

Сибирская язва - это инфекционное заболевание, вызываемое токсигенными штаммами грамположительной бактерии Bacillus anthracis. Вирулентность бактерии определяется капсулой, состоящей из поли-D-глютамовой кислоты, и экзотоксином, включающим в себя три компонента - летальный фактор (LF), протективный антиген (РА) и фактор отечности (EF). По отдельности эти белки не обладают токсическим эффектом, но комбинации LF+PA (летальный токсин) и EF+PA (токсин отечности) приводят к различным патологическим последствиям как у млекопитающих и человека, так и в культуре клеток. Функционально LF сибирской язвы представляет собой Zn2+-зависимую металлопротеазу, специфически расщепляющую белки семейства киназ митоген-акивируемых протеин киназ МАРКК (в частности, МЕК1), приводя к лизису клеток, подвергшихся действию токсина под воздействием макрофагов. Проводились исследования ферментативной активности LF, его субстратной специфичности, его трехмерной структуры.

Летальный фактор сибирской язвы является белком с молекулярной массой 90 кДа. Структурно составленным из четырех доменов с преимущественно спиральной структурой. Домен 1 состоит из 12 спиральных участков, уравновешивающих четырехцепочечный слой. Этот домен связывается с протективным антигеном. Домен 2 сходен со вторым доменом токсина VIP2 Bacillus cereus, однако не обладает его каталитическими радикалами. Внутри последовательности домена 2 находится последовательность домен 3. Этот домен составлен из повторов, которые возникли в результате дупликации последовательности, изначально принадлежавшей домену 2. Домен 4 - это каталитически активная протеаза. Бета-слой и шесть альфа-спиралей формируют структуру, сходную с той, которая существует у другой металлопротеазы, термолизина. Связывание субстратного белка семейства МАРКК происходит в углублении между доменами 3 и 4. Активный центр фермента составлен аминокислотным радикалом Glu687 за молекулой воды и атомом цинка, связанным с радикалами His686, His690, Tyr728 и Glu735 (Pannifer AD, Wong TY, Schwarzenbacher R, Renatus M, Petosa C, Bienkowska J, Lacy DB, Collier RJ, Park S, Leppla SH, Hanna P, Liddington RC. (2001) Nature, 414, 229-233).

Известен способ выделения рекомбинантного летального фактора сибирской язвы (Gupta P, Batra S, Chopra АР, Singh Y, Bhatnagar R. (1998) Infect Immun, 66(2), 862-865), в котором используют экспрессионную конструкцию на основе плазмиды pQE30, проэкспрессированную в штамме Е. coli SG 13009. Недостатком продукции белка с использованием этой конструкции является то, что более 40% белка находится в деградированном состоянии (видимо, в силу расщепления протеазами E.coli), что, безусловно, снижает выход белка при использовании данной конструкции. Большая исходная степень деградации белка приводит к тому, что требуется три стадии очистки белка для получения гомогенного продукта вместо двух, предлагаемых в настоящем изобретении. В используемой экспрессионной конструкции не содержится последовательностей для специфической детекции экспрессионного продукта.

Известен генно-инженерный способ получения мутантного белка LF с использованием конструкции на основе рЕТ30 под контролем промотора фага Т5 в экспрессионных штаммах E.coli (патент РФ 2287581, опубл. 20.11.2006). Полученный таким образом белок и его мутанты используют для разработки вакцин против сибирской язвы. Однако известно, что рекомбинантный белок LF, синтезируемый с применением использованной конструкции, имеет до 40% деградации в отличие от 10%, наблюдаемых при использовании заявленной конструкции. В запатентованной экспрессионной конструкции не содержится последовательностей для специфической детекции экспрессионного продукта в отличие от заявленной.

Известен наиболее близкий к заявленному способ, в котором применяют экспрессию полноразмерного летального фактора сибирской язвы, химеризованного с глютатион-S-трансферазой (Kim J., Kim Y.-M., Koo B.-S., Chae Y.-K., Yoon M.-Y. (2003) Prot. Expr. Purif., 30(2), 293-300). По этой методике получают достаточно чистый белок в одну стадию очистки, но выход его сравнительно невысок по сравнению с выходом белка в заявленном способе и не превышает 5 мг с литра культуры. Конструкцию для получения рекомбинантного белка в описанной работе создают на основе плазмиды pGEX-KG под управлением синтетического Тас-промотора, что приводит к деградации части белка в процессе наработки. Кроме того, в экспрессионной конструкции не содержится последовательностей для специфической детекции экспрессионного продукта.

Изобретение решает задачу создания продуцента и получения активного рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы с высоким выходом и низкой степенью деградации.

Поставленная задача решается за счет рекомбинантной плазмидной ДНК pETGST-LFmin, обеспечивающей синтез гибридного рекомбинантного активного белка летального фактора сибирской язвы в клетках Escherichia coli, имеющей молекулярную массу 5,08 МДа, состоящей из BamHI-NdeI фрагмента ДНК коммерческой плазмиды pET22b(+); фрагмента глютатион-S-трансферазы и пептида с-myc, а также BamHI/SalI фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность фрагмента гена летального фактора сибирской язвы без домена, содержащая в качестве генетического маркера ген способ получения функционально активного рекомбинантного белка   летального фактора сибирской язвы (lf), рекомбинантная плазмидная   днк petgst-lfmin, кодирующая активный белок lf, и штамм escherichia   coli bl-gstlfmin, продуцирующий активный белок летального фактора   сибирской язвы, патент № 2355769 -лактамазы, детерминирующий устойчивость клеток Escherichia coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pETGST-LFmin, к антибиотикам пенициллинового ряда; уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI:

XhoII 657 пн, EcoRI 683 пн, StuI 748 пн, XhoI 801 пн, BcoI 801 пн.

Также за счет штамма Escherichia coli BL-GSTLFmin, продуцирующего гибридный полипептид, содержащий летальный фактор сибирской язвы, химеризованный с глютатион-S-трансферазой и пептидом с-myc.

А также за счет способа получения рекомбинантного летального фактора сибирской язвы, включающего трансформацию клеток Escherichia coli BL21(DE3) экспрессионной плазмидной ДНК pETGST-LFmin, кодирующей рекомбинантный белок летального фактора сибирской язвы, культивирование полученного штамма, разрушение бактериальных клеток добавлением Тритона X-100 в буферном растворе рН 7.4, содержащем протеазный ингибитор, с последующей очисткой целевого продукта на сорбенте с иммобилизованным глютатионом.

Техническим результатом изобретения является получение в очищенном виде и с высоким выходом (до 95% чистоты, до 100 мг с литра культуры) гомогенного рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы.

Для повышения уровня продукции и снижения степени деградации белка LF в качестве базовой конструкции применяют плазмиду с промотором Т7 полимеразы, содержащую в своем составе последовательность, соответствующую пептиду с-myc для детекции продукта и глютатион-S-трансферазы для эффективной очистки синтезируемого белка. Для получения базовой векторной конструкции pETNHIS в плазмиду pET22b(+) (Novagen), не содержащую сайта BglII (последовательность сайта рестрикции нарушают обработкой плазмиды эндонуклеазой рестрикции BglII с последующей достройкой концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и лигированием достроенных концов) по сайтам эндонуклеаз рестрикции NdeI и BamHI вводят последовательность, содержащую фрагмент гена глютатион-S-трансферазы и пептид с-myc.

Фрагмент гена глютатион-S-трансферазы получают прямым ПЦР с ДНК плазмиды pDS473a (ATCC #87616) со специфических праймеров, очищают полученный фрагмент элюцией из агарозного геля и при помощи ПЦР к 3'-концу полученного фрагмента достраивают последовательность, кодирующую пептид с-myc, а на концы полученного фрагмента вносят сайты эндонуклеаз рестрикции NdeI и BamHI. Полученный фрагмент клонируют в вектор pET22b(+) по сайтам NdeI и BamHI.

В полученную описанным способом плазмиду pETGST по сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI и XhoI клонируют фрагмент гена летального фактора сибирской язвы, не содержащий домен I.

Полученную плазмиду pETGST-LFmin трансформируют в штамм E.coli BL21(DE3) и экспрессируют в среде 2xYT. Выход рекомбинантного белка летального фактора сибирской язвы высокой степени чистоты (97%) после хроматографической очистки на глютатион-сефарозе (Pharmacia) составляет 15% относительно суммарного белка клетки.

В предлагаемом техническом решении используют штамм-продуцент Escherichia coli BL-LFminGST, содержащие плазмидную ДНК pETGST-LFmin, суперпродуцент рекомбинантного белка LF.

Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pETGST-LFmin обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в них гена летального фактора сибирской язвы или его фрагмента без домена I.

Фрагмент гена летального фактора сибирской язвы получен полимеразной цепной реакцией с ДНК бактерии сибирской язвы в Государственном Научном Центре Прикладной микробиологии РАМН.

Концевые участки гена и его фрагмента, содержащие соответствующие примененным векторам сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI и SalI вводят с помощью полимеразной цепной реакции с синтетическими олигонуклеотидными праймерами LFminBamHI и LFSalI (фиг.1), а затем ген или его фрагмент клонируют в векторную плазмиду pETGST.

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL-GSTLFmin характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, неспороносные, грамотрицательные.

Культуральные признаки. Бактериальные клетки хорошо растут на простых питательных средах. При выращивании на агаре образуют круглые, мутные желто-серые колонии со слегка неровным краем, диаметром до 3 мм. При росте на жидких средах (LB, 2xYT) образуют интенсивную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40°С при оптимуме 37°С и оптимальных значениях рН от 7 до 7.5. В качестве источника углерода используют аминокислоты, углеводы, глицерин. В качестве источника азота могут использовать как органические соединения (аминокислоты, дрожжевой экстракт, триптон и др.), так и неорганические минеральные соли в аммонийной форме.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда (до 200 мкг/мл).

Штамм-продуцент получают путем трансформации компетентных клеток E.coli соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.

Штамм BL-GSTLFmin является суперпродуцентом. При индукции изопропилтио-способ получения функционально активного рекомбинантного белка   летального фактора сибирской язвы (lf), рекомбинантная плазмидная   днк petgst-lfmin, кодирующая активный белок lf, и штамм escherichia   coli bl-gstlfmin, продуцирующий активный белок летального фактора   сибирской язвы, патент № 2355769 -галактозидом происходит эффективный синтез целевого белка LF, который накапливается в цитоплазме клеток в растворимом состоянии и составляет до 50% суммарного белка клетки.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pETGST-LFmin, для чего фрагмент гена летального фактора сибирской язвы без первого домена получают ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (фиг.1). Праймеры содержат сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI (N-конец гена, праймер LFminBamHI) и SalI (С-конец гена, праймер LFXhoI). Полученную ДНК расщепляют соответствующими эндонуклеазами рестрикции и затем лигируют с расщепленной по сайтам BamHI и XhoI векторной плазмидной ДНК pETGST. На фиг.2 представлена последовательность фрамента гена летального фактора сибирской язвы, не содержащего первого домена. На фиг.3 изображена последовательность экспрессионной конструкции плазмиды pETGST-LFmin.

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli DH12S или другие клетки, не содержащие DE3 лизогена и собственной устойчивости к антибиотикам пенициллинового ряда, и высевают на 2xYT-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют ПЦР с праймеров LFminBamHI и LFSalI, и из клонов, ПЦР которых приводит к образованию фрагмента нужной длины при анализе смеси агарозным гель-электрофорезом, выделяют плазмидную ДНК методом щелочного лизиса. Правильность встраивания фрагмента подтверждают секвенированием плазмидной ДНК. Полученные рекомбинантные плазмидные ДНК трансформируют в компетентные клетки штамма E.coli BL21(DE3), полученные клоны анализируют на уровень экспрессии целевого белка и отбирают штаммы-продуценты.

Штамм-продуцент E.coli BL-LFminGST выращивают на богатой среде (2xYT, Terrific Broth и др.) до достижения оптической плотности культуры 0.6-1.2 ОЕ и индуцируют 1 мМ изопропилтио-способ получения функционально активного рекомбинантного белка   летального фактора сибирской язвы (lf), рекомбинантная плазмидная   днк petgst-lfmin, кодирующая активный белок lf, и штамм escherichia   coli bl-gstlfmin, продуцирующий активный белок летального фактора   сибирской язвы, патент № 2355769 -D-галактозидом. Экспрессию проводят 6 часов при температуре 25°С.

Клетки из экспрессионной культуры собирают центрифугированием при 5000 об/мин и обрабатывают лизоцимом (0.5 мг/мл) при 4°С в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCl рН 7.4, 150 мМ NaCl, дополненном протеазным ингибитором (Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail, Roches) с добавлением Triton X-100 до концентрации 0.5%. К лизату добавляют MgCl2 до концентрации 5 мМ и разрушают ДНК ДНКазой (10 мкг/мл). Полученный лизат центрифугируют 20 минут при 18000 g и наносят на колонку. Хроматографическую очистку проводят на сорбенте, несущем иммобилизованный глютатион (GST-Sepharose, Pharmacia) в буферном растворе рН 7.5. Элюцию осуществляют раствором 10 мМ глютатиона на том же буфере. Диализуют очищенный белок LF в буфер, содержащий 20 мМ Трис-HCl рН 8, 2 мМ EDTA и 10% глицерина. Чистоту полученного препарата LF определяют денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле и препарат замораживают для хранения на -70°С.

Детекцию продукта осуществляют с помощью иммуноблота с антителами, специфичными к пептиду с-myc.

Активность полученного рекомбинантного летального фактора сибирской язвы измеряют с использованием специфического субстрата для летального фактора сибирской язвы и содержащего хромометку (Lethal Factor Protease Substrate 2, фирма Biotrend, Германия) по возрастанию поглощения в растворе при длине волны 405 нм на спектрофотометре. Кинетические измерения проводятся в течение 30 минут при 37°С.

Изобретение иллюстрируют графические материалы:

Фиг.1. Праймеры для амплификации фрагмента гена летального фактора сибирской язвы без домена I.

Фиг.2. Последовательность фрагмента гена летального фактора сибирской язвы без домена I.

Фиг.3. Последовательность экспрессионной конструкции плазмиды pETGST-LFmin.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pETGST-LFmin

Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3' к 5' концу с помощью защищенных фосфоамидитов (5'диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(способ получения функционально активного рекомбинантного белка   летального фактора сибирской язвы (lf), рекомбинантная плазмидная   днк petgst-lfmin, кодирующая активный белок lf, и штамм escherichia   coli bl-gstlfmin, продуцирующий активный белок летального фактора   сибирской язвы, патент № 2355769 -цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов), активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0.5-0.7 мкМ, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкМ/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.

Для приготовления вектора ДНК 3 мкг плазмиды pETGST-LFmin обрабатывают в 20 мкл буфера для BamHI (фирма New England Biolabs) 10 единицами эндонуклеазы рестрикции BamHI, а затем в 20 мкл буфера 2 (New England Biolabs) 10 единицами эндонуклеазы XhoI. Рестрикция проводится 1 час при 37°С. Векторный фрагмент длиной 6,06 т.п.о. после электрофореза в агарозном геле помещают в диализный мешочек с максимальной пропускной способностью 12-14 кДа и элюируют под действием тока в трис-боратном буфере для электрофореза, а затем обрабатывают смесью фенол-хлороформ (1:1) и осаждают ДНК из раствора этанолом.

Для приготовления фрагмента гена LF проводят ПЦР-амплификацию, используя в качестве матрицы бактериальную ДНК сибирской язвы и (0.05 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А и В (по 20 рМ каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, содержащем каждый из четырех dNTP в концентрации 0.5 мМ и 1 ед активности Pfu-полимеразы (фирма Promega). ПЦР проводят в режиме, предусматривающем 1 минуту денатурации при 95°С, отжиг 30 секунд при 57°С, элонгацию - 40 секунд при 72°С, 25 циклов ПЦР. После этого реакционную смесь депротеинизируют смесью фенол-хлороформ (1:2) и осаждают этанолом. Осадок растворяют в 20 мкл воды и расщепляют эндонуклеазами рестрикции BamHI и SalI (реакция с эндонуклеазой рестрикции SalI производства Fermentas проводится в буфере О Fermentas). Целевой фрагмент выделяют элюцией из агарозного геля.

0.5 мкг полученного синтетического фрагмента гена рекомбинантного летального фактора сибирской язвы прибавляют к раствору 0.3 мкг описанного выше векторного фрагмента и лигируют в 10 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl рН 7.6, 10 мМ MgCl2, 0.2 мМ АТР, 10 мМ дитиотрейтита и 10 ед. активности Т4-ДНК лигазы в течение 4 часов при 16°С.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации электропорацией (прибор ВТХ 600, режим 129 Ом, 2,5 KB) электрокомпетентных клеток E.coli DH12S. Трансформанты высевают на чашки с 2xYT-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью ПЦР-амплификации с праймеров LFminBamHI и LFSalI в тех же условиях, что и получение фрагмента ДНК для клонирования, используя в качестве матрицы плазмидную ДНК единичной бактериальной колонии. Положительные клоны идентифицируются по наличию фрагмента длиной 1606 пн при анализе ПЦР-смеси электрофорезом в агарозном геле. Из положительных клонов выделяют ДНК плазмиды pETGST-LFmin методом щелочного лизиса.

Пример 2.

Получение штамма-продуцента E.coli BL-GSTLFmin и определение его продуктивности

Штамм-продуцент E.coli BL-GSTLFmin получают трансформацией компетентных клеток E.coli BL21(DE3) плазмидой pETGST-LFmin, как описано в примере 1. Единичные клоны BL21(DE3), несущие плазмиду pETGST-LFmin, экспрессируют в аналитическом количестве (по 5 мл) согласно протоколу, описанному для препаративной экспрессии, и анализируют уровень экспрессии белка летального фактора сибирской язвы денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле и иммуноблотом с антителами против пептида с-myc. Для проведения электрофореза равные аликвоты клеток разных клонов центрифугируют при 5000 об/мин 5 минут, осажденные клетки растворяют в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, обрабатывают 20 секунд ультразвуком, нагревают 3 минуты при 100°С и наносят на гель. После прохождения электрофореза гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Для постановки иммуноблота мембрану Hybond C+ и гель на 10 минут замачивают в буфере, содержащем 38.6 мМ глицина, 47.9 мМ трис-основание, 0,0385% додецилсульфата натрия, 20% метанола. Перенос ведут при силе тока 1 мА на см геля. Блокировка мембраны после переноса осуществляется 3% раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS рН 7,4, содержащим 0.05% Tween. Блокированную мембрану инкубируют с антителами с-myc (клон CRL-1725, АТСС) при комнатной температуре в течение 2 часов в том же PBS, содержащем 0.5% БСА, и после отмывки первичного антитела смесью PBS-0.05% Tween 20 мембрану инкубируют ночь с пероксидазным конъюгатом антитела к мышиным антителам. Отмытый блот проявляют с использованием пероксидазного субстрата ТМВ по стандартному протоколу. Клоны, дающие наибольший выход белка, являются суперпродуцентами, их выращивают на богатой среде (2xYT) в течение ночи, добавляют глицерин до 15% и замораживают на -70°С для хранения.

Для препаративной экспрессии штаммы суперпродуцента E.coli BL-GSTLFmin выращивают в течение ночи при 37°С с добавлением 2% глюкозы, помещают 10 мл ночной культуры в 1000 мл среды 2xYT, содержащей 0.1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина, и выращивают при 37°С до оптической плотности 1 ОЕ. Выросшую культуру охлаждают до 25°С, добавляют ИПТГ до 1 мМ и проводят экспрессию 6 часов при 25°С. Далее клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин 10 минут и хранят в виде замороженных осадков при температуре -70°С.

Пример 3.

Очистка белка летального фактора, полученного с использованием конструкции pETGST-LFmin, и определение его активности.

Клетки из экспрессионной культуры суспендируют в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCl рН 7.4, 150 мМ NaCl, дополненном протеазным ингибитором (Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail, Roches), и обрабатывают лизоцимом (0.5 мг/мл) при +4°С в течение 30 минут. Лизируют клетки добавлением Triton X-100 до концентрации 0.5%. К лизату добавляют MgCl2 до концентрации 5 мМ и разрушают геномную ДНК E.coli ДНКазой (10 мкг/мл). Полученный лизат центрифугируют 20 минут при 18000 g и наносят на колонку с сорбентом, несущим иммобилизованный глютатион (GST-Sepharose, Pharmacia) в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCl рН 7.5 и 70 мМ NaCl. Колонку промывают 10 объемами того же буфера и элюируют белок раствором, содержащим 10 мМ глютатиона в том же буфере. Диализуют очищенный белок LF в буфер, содержащий 20 мМ Трис-HCl рН 8, 2 мМ EDTA и 10% глицерина. Чистоту препарата LF определяют денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле, как описано в примере 2, и замораживают для хранения на -70°С. Выход рекомбинантного белка летального фактора составляет 70 мг с литра культуры после полной процедуры очистки.

Протеолитическая активность полученного препарата оценивается по расщеплению специфического субстрата для летального фактора сибирской язвы, содержащего хромометку (Lethal Factor Protease Substrate 2, фирма Biotrend, Германия), по возрастанию поглощения в растворе при длине волны 405 нм на спектрофотометре (Tecan). Кинетические измерения проводятся в течение 30 минут при 37°С. Кинетические параметры щепления субстрата полученным летальным фактором сибирской язвы составляют kcatM=4.12±0.8 с-1 мкМ -1.

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2355769

patent-2355769.pdf

Класс C12P21/00 Получение пептидов или протеинов

рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)
модифицированная дрожжевая двугибридная система для эффективного исследования взаимодействия между белками и их доменами. -  патент 2529356 (27.09.2014)
лейколектины и их применение -  патент 2528860 (20.09.2014)
модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)
способ получения пептидов, специфично распознающих определенные типы клеток и предназначенных для терапевтических целей -  патент 2528739 (20.09.2014)
слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк -  патент 2528251 (10.09.2014)
способ получения цитохрома с -  патент 2528061 (10.09.2014)
рсв-специфичные связывающие молекулы и средства для их получения -  патент 2527067 (27.08.2014)
способы, относящиеся к модифицированным гликанам -  патент 2526250 (20.08.2014)
l-фукоза 1 6 специфичный лектин -  патент 2524425 (27.07.2014)

Класс C07K2/00 Пептиды с неопределенным числом аминокислот; их производные

способ выделения низкомолекулярных пептидов -  патент 2510398 (27.03.2014)
способ получения нового полимерного соединения, обладающего противовирусной активностью, сополимеризацией 2,5-дигидроксибензойной кислоты и желатина с помощью фермента лакказы -  патент 2494119 (27.09.2013)
белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе -  патент 2485133 (20.06.2013)
белково-полипептидный комплекс, обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе -  патент 2485132 (20.06.2013)
комбинация пептидов -  патент 2482127 (20.05.2013)
активирующий люминесценцию белка гидридный комплекс -  патент 2475493 (20.02.2013)
способ получения и очистки ингибина-а человека -  патент 2434018 (20.11.2011)
штамм staphylococcus hominis klp-1 - продуцент низкомолекулярных пептидных соединений, ингибирующих развитие грамположительных бактерий -  патент 2428470 (10.09.2011)
очистка белков с помощью катионного поверхностно-активного вещества -  патент 2426738 (20.08.2011)
способ прогнозирования вторичной структуры белка -  патент 2425837 (10.08.2011)

Класс C12N1/21 модифицированные введением чужеродного генетического материала

рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli n41 (pbpun4/mr)-продуцент сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции bpun4i -  патент 2529362 (27.09.2014)
рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)
нуклеиноваяя кислота, обладающая активностью гена фосфатазы фосфатидной кислоты (варианты), белок, рекомбинантный вектор, трансформант и способ получения композиции жирной кислоты -  патент 2528875 (20.09.2014)
слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк -  патент 2528251 (10.09.2014)
тест-система для скрининга ингибиторов протеинкиназы gsk3 ; человека -  патент 2528059 (10.09.2014)
рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli - продуцент янтарной кислоты (варианты) и способ получения янтарной кислоты с использованием этого штамма -  патент 2528056 (10.09.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
плазмида 40nagal, определяющая синтез -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения -  патент 2525682 (20.08.2014)
антитело к epha2 -  патент 2525133 (10.08.2014)
штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина -  патент 2524133 (27.07.2014)

Класс C12N15/31 гены, кодирующие микробные белки, например энтеротоксины

рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)
клостридиальные нейротоксины с измененной персистентностью -  патент 2524429 (27.07.2014)
штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина -  патент 2524133 (27.07.2014)
способ идентификации и оценки количества микробных клеток возбудителя чумы в исследуемых пробах посредством пцр в режиме реального времени -  патент 2518302 (10.06.2014)
биологические материалы и их применение -  патент 2508296 (27.02.2014)
рекомбинантный полипептид а2, селективно связывающий hsa, рекомбинантная днк pa2, кодирующая hsa-связывающую часть полипептида a2, его продуцент - рекомбинантный штамм escherichia coli m15-a2, содержащий рекомбинантную плазмидную днк pqe 32-pa2, обеспечивающую получение полипептида a2 и применение полипептида а2 для диагностики микроальбуминурии и выделения hsa из сыворотки крови -  патент 2506271 (10.02.2014)
полинуклеотидная последовательность, кодирующая сконструированный белок пертактин, вектор, включающий такую последовательность, и вакцинные композиции, содержащие белок пертактина или вектор -  патент 2499046 (20.11.2013)
гибридный инсектицидный белок, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такой белок, трансгенные растения и их семена, содержащие такой белок, способ получения белка и его применение -  патент 2497830 (10.11.2013)
нейссериальные вакцинные композиции, содержащие комбинацию антигенов -  патент 2494758 (10.10.2013)
конструкции, содержащие составные экспрессионные кассеты, для терапии рака -  патент 2487165 (10.07.2013)

Класс C12N15/63 введение чужеродного генетического материала с использованием векторов; векторы; использование их хозяев; регулирование экспрессии

модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)
вакцины и компоненты вакцин для подавления микробных клеток -  патент 2528854 (20.09.2014)
антитела, узнающие углеводсодержащий эпитоп на cd43 и сеа, экспрессируемых на раковых клетках и способы их применения -  патент 2528738 (20.09.2014)
антитела против альфа5-бета 1 и их применение -  патент 2528736 (20.09.2014)
рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli - продуцент янтарной кислоты (варианты) и способ получения янтарной кислоты с использованием этого штамма -  патент 2528056 (10.09.2014)
способ получения наноматериала на основе рекомбинантных жгутиков археи halobacterium salinarum -  патент 2526514 (20.08.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
новая мутация, вовлеченная в повышенную толерантность растений к имидазолиноновым гербицидам -  патент 2525933 (20.08.2014)
способ создания трансгенных животных со стабильным и высоким уровнем экспрессии целевого белка в молоке -  патент 2525712 (20.08.2014)
синтетические 5 utr (нетранслируемые области), экспрессионные векторы и способ повышения трансгенной экспрессии -  патент 2524431 (27.07.2014)
Наверх