композиции для супрессии экспрессии ccr5 и способы их применения

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для уменьшения экспрессии поверхностных рецепторов CCR5 на мононуклеарных клетках, содержащая по меньшей мере одно соединение, блокирующее фазу G1, и по меньшей мере одно противовирусное средство, которое ингибирует или снижает проникновение ВИЧ в мононуклеарные клетки, где соединение, блокирующее фазу G1, находится в количестве, достаточном для уменьшения экспрессии поверхностных рецепторов CCR5.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где соединение, блокирующее фазу G1, выбрано из группы, состоящей из бутирата натрия, афидиколина, оломуцина, росковитина, токоферолов, токотриенолов, гидроксимочевины (HU) и рапамицина (PARA).

3. Фармацевтическая композиция для уменьшения экспрессии поверхностных рецепторов CCR5 на мононуклеарных клетках у человека, где композиция содержит рапамицин (PARA) и по меньшей мере одно противовирусное ВИЧ средство, где противовирусное ВИЧ средство представляет собой ингибитор проникновения вируса или его функциональный эквивалент.

4. Фармацевтическая композиция по пп.1-3, где соединение вводят перорально, ректально, назально, местно, вагинально или парентерально.

5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, где противовирусное средство выбрано из группы, состоящей из SCH-C, SCH-D, PRO 140, ТАК-779, ТАК-220, аналогов RANTES, AK602, UK-427, 857, моноклональных антител, Fuzeon (T-20), NB-2, NB-64, Т-649, Т-1249 и их функциональных аналогов или эквивалентов.

6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, где терапевтически эффективное количество рапамицина составляет от около 5 мг/кг до около 50 мг/кг в сутки.

7. Способ борьбы с вирусной инфекцией, которая зависит от уровней поверхностных рецепторов CCR5, где способ предусматривает:

введение индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, блокирующие фазу G1, и по меньшей мере одно противовирусное средство, которое ингибирует или снижает проникновение ВИЧ в мономолекулярные клетки, где соединение, блокирующее фазу G1, находится в количестве, ингибирующем экспрессию CCR5, снижая, таким образом, количество поверхностных рецепторов CCR5 и репликацию вируса.

8. Способ по п.7, где соединение, блокирующее фазу G1, является представителем, выбранным из группы, состоящей из бутирата натрия, афидиколина, гидроксимочевины (HU), оломуцина, росковитина, токоферола, токотриенолов и рапамицина (RAPA).

9. Способ по п.7, где противовирусным средством является по меньшей мере один представитель, выбранный из SCH-C, SCH-D, PRO 140, ТАК-779, ТАК-220, аналогов RANTES, AK602, UK-427, 857, моноклональных антител, NB-2, NB-64, Т-649, Т-1249 и их функциональных аналогов.

10. Фармацевтическая композиция, содержащая средство, блокирующее фазу G1, и противовирусное ВИЧ средство, где противовирусное средство представляет собой ингибитор вирусного проникновения и где средством, блокирующим фазу G1, является рапамицин или гидроксимочевина.

11. Фармацевтическая композиция по п.10, где противовирусное ВИЧ средство представляет собой ТАК-779.

12. Фармацевтическая композиция по п.11, где количество рапамицина или гидроксимочевины достаточно для синергического усиления активности ТАК-779.

13. Способ усиления активности противовирусного ВИЧ средства, которое представляет собой ингибитор вирусного проникновения, где способ предусматривает введение противовирусного ВИЧ средства в сочетании со средством, блокирующим фазу G1.

14. Способ по п.13, где противовирусное ВИЧ средство, которое представляет собой ингибитор проникновения вируса, представляет собой ТАК-779, а средство, блокирующее фазу G1, представляет собой рапамицин или гидроксимочевину.

Описание изобретения к патенту

Предпосылки изобретения

Область изобретения

Настоящее изобретение в целом относится к супрессии экспрессии CCR5, более конкретно к композициям, содержащим по меньшей мере один агент, блокирующий фазу G1, который обладает супрессивной активностью в отношении экспрессии поверхностных рецепторов CCR5, и, таким образом, обеспечивающий лечебный эффект заболеваний человека, при которых рецепторы CCR5 играют неблагоприятную роль.

Описание предшествующего уровня техники

Считается, что вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является основной причиной медленно развивающегося поражения иммунной системы, называемого синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД). Существуют по меньшей мере 2 различных типа ВИЧ: ВИЧ-1 и ВИЧ-2. У людей репликация ВИЧ происходит преимущественно в популяции Т-лимфоцитов CD4, и ВИЧ инфекция приводит к уменьшению числа этого типа клеток и, в конечном счете, к иммунной недостаточности, оппортунистическим инфекциям, неврологическим дисфункциям, росту новообразований и, в конце концов, к смерти.

ВИЧ является членом семейства лентивирусов ретровирусов. Ретровирусы представляют собой оболочечные вирусы, которые содержат геном одноцепочечной РНК, и реплицируются через промежуточную форму ДНК, продуцируемую обратной транскриптазой, кодируемой вирусом, которая является РНК-зависимой ДНК-полимеразой.

Вирусная частица ВИЧ содержит вирусную сердцевину, частично состоящую из капсидных белков, вместе с геномом вирусной РНК и ферментами, которые требуются для ранних репликативных событий. Миристилированный gag-белок формирует наружную оболочку вокруг вирусной сердцевины, которая, в свою очередь, окружена оболочкой липидной мембраны, происходящей из мембраны инфицированной клетки. Поверхностные гликопротеиды оболочки ВИЧ синтезируются в виде одиночного белка-предшественника 160 килодальтон, который расщепляется клеточной протеазой во время вирусного почкования на гликопротеиды, gp41 и gp120. Белок gp41 представляет собой трансмембранный гликопротеид, а gp120 представляет собой внеклеточный гликопротеид, который остается нековалентно связанным с gp41, возможно, в тримерной или многомерной форме.

ВИЧ нацелен на клетки CD4, потому что поверхностный белок (CD4) клеток CD4 действует в качестве клеточного рецептора для вируса ВИЧ-1. Вход вируса в клетки зависит от связывания gp120 молекул клеточных рецепторов CD4, что объясняет тропизм ВИЧ к клеткам CD4, тогда как gp41 заякорен на гликопротеидном комплексе оболочки вирусной мембраны. CCR5 служит в качестве совместного рецептора для инфекции клеток CD4 необразующими синтиции (NSI) штаммами ВИЧ-1.

Экспрессия рецептора CCR5 на Т-клетках зависит от состояния активации клеток. Покоящиеся лимфоциты не экспрессируют CCR5, однако, после активации, CCR5 экспрессируется. Важность CCR5 для первоначальной передачи ВИЧ-1 возрастает вследствие того, что индивидуумы, у которых отсутствует экспрессия CCR5 (гомозиготный генотип CCR5- 32), обычно устойчивы к инфекции (Liu et al., 1996). Кроме того, последние исследования показывают, что плотность CCR5 на клеточной поверхности коррелирует с прогрессированием заболевания у инфицированных индивидуумов (Lin et al., 2002).

Было обнаружено, что другие расстройства и прогрессирование эффектов связаны с экспрессией рецептора CCR5. Например, отторжение трансплантата происходит в результате экстравазации мононуклеарных клеток реципиента в аллотрансплантат, процесса, который опосредован экспрессией CCR5 на инфильтрирующих мононуклеарных клетках. Исследования астмы с использованием мышиных моделей аллергических заболеваний дыхательных путей показали, что CCR5, вероятно, играет важную роль при воспалении дыхательных путей. Кроме того, ревматоидный артрит характеризуется инфильтрацией синовиальной оболочки мононуклеарных клеток, и, по-видимому, CCR5 играет роль вследствие высоких уровней экспрессии CCR5, обнаруживаемой в инфильтрированных лимфоцитах. Интересно, что мононуклеарные клетки, присутствующие в активных демиелинирующих бляшках, характерных для больных рассеянным склерозом, также демонстрируют высокие уровни экспрессии CCR5.

Таким образом, было бы полезно идентифицировать соединения, которые уменьшают или ингибируют экспрессию поверхностных рецепторов CCR5 на мононуклеарных клетках, и применять такие соединения для эффективного лечения расстройств, связанных с экспрессией поверхностных рецепторов CCR5.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к супрессии экспрессии поверхностных рецепторов CCR5 посредством манипулирования клеточным циклом в активированных лимфоцитах путем введения композиции, которая блокирует фазу G1 клеточного цикла, прерывая, таким образом, ответ лимфоцита на IL-2 (через Il-2R), который управляет переходом от фазы G1 к фазе S, а также прохождение через фазу S. Снижение экспрессии CCR5 уменьшает количество рецепторных сайтов для входа ВИЧ в Т-клетки, и, таким образом, снижает эффекты развития ВИЧ.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к супрессии транскрипции CCR5 для снижения экспрессии поверхностных рецепторов CCR5, вызывая, таким образом, накопление хемокинов на клеточном уровне. Такое накопление хемокинов происходит вследствие пониженного количества поверхностных рецепторов CCR5 для захвата хемокина/лиганда.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к супрессии транскрипции CCR5 для снижения экспрессии поверхностных рецепторов CCR5, вызывая посредством этого снижение числа поверхностных рецепторов для связывания gp120 ВИЧ, что, в свою очередь, предотвращает или снижает репликацию ВИЧ.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к композициям, которые ингибируют опосредованный CCR5 вирусный вход ВИЧ путем снижения количества поверхностных рецепторов CCR5, экспрессированных на мононуклеарных клетках, включая, но не ограничиваясь, Т-клетки, активированные Т-клетки и макрофаги.

В еще одном аспекте изобретение относится к композиции, содержащей агент, блокирующий фазу G1, который задерживает наступление S-фазы в цикле мононуклеарных клеток, где агент, блокирующий фазу G1, прерывает сигналы, возникающие после связывания IL-2 с рецептором IL-2 (IL-2R) на клеточной поверхности, и, таким образом, супрессирует экспрессию CCR5, которая зависит от передачи сигналов через рецептор IL-2.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу ингибирования опосредованного CCR5 вирусного вхождения, а именно к супрессии экспрессии белка CCR5 иммуномодуляторным препаратом рапамицином (RAPA). RAPA, бактериальный макролид, который в настоящее время разрешен для лечения отторжения при почечной трансплантации, проявляет цитостатическую активность в Т-клетках, прерывая молекулярные события, возникающие в результате связывания IL-2 с рецептором IL-2 (Sehgal, S.N., 1998).

Агент, модулирующий клеточный цикл G1, может включать любое соединение, которое блокирует или удлиняет фазу G1 в клеточном цикле мононуклеарных клеток, например, включая, но не ограничиваясь, бутират натрия, афидиколин, гидроксимочевину (HU), оломуцин, росковитин, токоферолы, включая альфа-токоферол, бета-токоферол, D-альфа-токоферол, дельта-токоферол, гамма-токоферол, токотриенолы, рапамицин (RAPA) и их функциональные аналоги или производные.

Композиции по настоящему изобретению могут, кроме того, включать по меньшей мере одно противовирусное средство. Противовирусное средство может включать любое средство, которое ингибирует вхождение в клетку или репликацию в ней инфекционного вируса, и, в частности, ретровирусов, таких как вирусы ВИЧ. Противовирусные средства включают, но ими не ограничиваются, ингибиторы нуклеозида RT, ингибиторы/антагонисты CCR5, ингибиторы вирусного вхождения и их функциональные аналоги.

Таким образом, в одном из аспектов композиции и способы по настоящему изобретению, кроме того, включают терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного противовирусного средства, включая, но ими не ограничиваясь, ингибиторы нуклеозида RT, такие как зидовудин (ZDV, AZT), ламивудин 93TC), ставудин (d4T), диданозин (dd1), залцитабин (ddC), абакавир (АВС), эмивирин (FTC), тенофовир (TDF), делавирадин (DLV), эфавиренц (EFV), невирапин (NVP), сикванавир (SQV), ритонавир (RTV), инданавир (IDV), нелфинавир (NFV), ампренавир (APV), лопинавир (LPV), атазанавир, комбивир (ZDV/3TC), калетра (RTV/LPV), тризивир (ZDV/3TC/ABC);

ингибиторы/антагонисты CCR5, такие как SCH-C, SCH-D, PRO 140, TAK-779, TAK-220, аналоги RANTES, AK602, UK-427, 857, моноклональные антитела;

ингибиторы вирусного вхождения, такие как фузеон (Т-20), NB-2, NB-64, T-649, T-1249, SCH-C, SCH-D, PRO 140, TAK-779, TAK-220, аналоги RANTES, AK602, UK-427, 857, и их функциональные аналоги или эквиваленты.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу усиления эффективности ТАК-779 и уменьшения количества поверхностных рецепторов CCR5 на активированной Т-клетке, где способ предусматривает введение композиции, содержащей а) ТАК-779 в количестве, которое, как полагают, неэффективно в качестве антагониста рецепторов CCR5, и b) агент, блокирующий фазу G1, в количестве, эффективном для снижения экспрессии CCR5, посредством чего включение агента, блокирующего фазу G1, в композицию, увеличивает эффективность ТАК-779. Предпочтительно агент, блокирующий фазу G1, представляет собой RAPA или HU, и эффективность увеличивается синергически.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу борьбы с вирусной инфекцией, при которой поверхностный рецептор CCR5 играет неблагоприятную роль, предусматривающему введение пациенту композиции, содержащей эффективное количество агента, блокирующего фазу G1, для снижения экспрессии поверхностных рецепторов CCR5.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу поддержания длительного контроля над вирусом ВИЧ, где способ предусматривает введение по меньшей мере одного противовирусного средства и соединения, блокирующего фазу G1, в терапевтически эффективном количестве, для снижения экспрессии рецепторов CCR5, посредством этого снижая связывание gp120 ВИЧ.

Противовирусное средство может представлять собой любой ингибитор вхождения ВИЧ, такой как ТАК-799 или SCH-C, каждый из которых блокирует связывание вирусов с рецепторами CCR5. Было показано, что устойчивость вирусов к этим антагонистическим молекулам CCR5 возникает в результате более эффективного использования CCR5 вирусом (Trkola et al., 2002). Тот факт, что вирусы ВИЧ-1 устойчивы к блокаторам CCR5, остаются зависимыми от рецепторов CCR5 для инфекции, свидетельствует о том, что уменьшение CCR5 вмешается в рост и возникновение устойчивых вирусных вариантов, посредством этого увеличивая длительность противовирусного действия терапии ингибиторами вхождения.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения для снижения эффектов и репликации ВИЧ у инфицированного ВИЧ индивидуума, где способ предусматривает введение агента, блокирующего фазу G1, в сочетании с антагонистом ТАК-779 для усиления эффективности ТАК-779 и снижения экспрессии CCR5.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики ВИЧ инфекции у индивидуума, вероятно, подвергшегося воздействию ВИЧ, где способ предусматривает введение индивидууму по меньшей мере одного соединения, блокирующего фазу G1, в эффективном количестве для уменьшения транскрипции поверхностных рецепторов CCR5 и посредством этого ингибирования вхождения ВИЧ в организм индивидуума.

Другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из следующего подробного описания чертежей и формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показано, что эффект RAPA на пролиферацию PBMC (мононуклеарных клеток периферической крови) и уменьшение пролиферации заметны при величинах больше 1 нМ RAPA.

На фиг.2А-2D показана эффективность RAPA при супрессии экспрессии CCR5 на Т-клетках и моноцитах; на фиг.2А показано специфическое выявление поверхностной экспрессии CCR5 на Т-клетках CD4⁺ здорового донора, но не на Т-клетках CD4⁺ индивидуума, гомозиготного по мутации 32 в гене CCR5; на фиг.2В показана супрессия регуляции поверхностной экспрессии CCR5 на Т-клетках CD4⁺ RAPA у PBMC, которые культивировали в течение 7 дней в присутствии IL-2 и RAPA и затем анализировали для выявления уровней CCR5, где экспрессия CCR5 на Т-лимфоцитах CD4⁺ показана как сплошная линия, и флюоресценция вследствие контроля изотипа IgG показана как пунктирная линия; на фиг.2С показано ингибирование RAPA транскрипции мРНК CCR5 у PBMC. Общее количество РНК выделяли из PBMC, которые культивировали в присутствии IL-2 и RAPA в течение 7 дней (клетки из того же эксперимента, который показан на фиг.2В). Эквивалентные количества РНК подвергали RT-PCR, используя праймерные пары, специфичные для амплификации мРНК CCR5 (верхняя) и РНК рибосомы 18S (нижняя); на фиг.2D показано, что RAPA супрессирует экспрессию CCR на клеточной поверхности созревающих моноцитов, которые культивировали в течение 5 дней в присутствии RPMI 20/10% ABHS, и RAPA подвергали двойному иммуноокрашиванию для выявления CD14 и CCR5. Изменения поверхностной экспрессии CCR5 исследовали в клетках, пермеализированных CD14. Профиль иммунофлюоресценции, полученный с mAb 182 против CCR5 (сплошная линия) сравнивали с профилем изотипического контроля IgG2b (пунктирная линия). Результаты, показанные на фиг.2В и 2С, являются характерными данными, полученными в PBMC от пяти разных доноров. Результаты, показанные на фиг.2D, являются характерными для аналогичных профилей, полученных у трех различных доноров.

На фиг.3А и 3В показано, что RAPA увеличивает уровни внеклеточного -хемокина в культурах РВМС. На фиг.3А показаны результаты, полученные на донорных РВМС, которые культивировали в присутствии IL-2 и RAPA в течение 10 дней, и в это время супернатант оценивали на содержание -хемокина с помощью ELISA, и клетки окрашивали для выявления экспрессии CCR5. Указано процентное содержание лимфоцитов CD4, экспрессирующих CCR5, при каждой концентрации RAPA. Результаты, показанные у двух доноров, являются характерными результатами четырех экспериментов с использованием четырех различных доноров. *, P<0,01; #, P<0,05, по сравнению с контролем, не получавшим лечение, по t критерию Стьюдента; на фиг.3В показан эффект RAPA на внеклеточные уровни MIP-1 в культурах РВМС без CCR5. Уровни белка MIP-1 в присутствии и отсутствие RAPA измеряли в супернатантах, стимулированных IL PBMC от здорового донора и от донора, гомозиготного по мутации 32 в гене CCR5. Величины получали на 10-й день культивирования в виде средней величины ± стандартное отклонение парных лунок.

На фиг.4A-4C показано ингибирование репликации ВИЧ-1 в РВМС и что противовирусная активность у R5 ВИЧ-1 больше, чем у Х4 ВИЧ-1. На фиг.4А показаны результаты репликации в течение семидневного периода испытания, где обработанные RAPA PBMC были инфицированы IIIb ВИЧ-1 или ADA ВИЧ-1. Инфицированные клетки культивировали в присутствии препарата RAPA в течение 7 дней, и в это время репликацию вируса измеряли по р24, а жизнеспособность клеток измеряли анализом MTT. Результаты (средние величины ± стандартное отклонение по трем лункам) характерны для 7 независимых экспериментов, каждого на клетках от другого донора; на фиг.4В показаны эффекты на инфицированную IIIb ВИЧ-1 и ADA ВИЧ-1, обработанную ДНазой линию РВМС при обработке 100 нМ RAPA или без него. Последовательности ДНК ВИЧ-1 амплифицировали PCR в клеточных лизатах, полученных через 24 ч после инфекции. Амплифицированные продукты PCR выявляли радиоактивным зондом. «+» указывает на присутствие RAPA в культуре РВМС перед и после инфекции; «-» указывает на отсутствие обработки RAPA. Амплификация последовательностей -актина показала такое же количество клеточной ДНК среди различных клеточных лизатов (данные не показаны). NC обозначает отрицательный контроль PCR; на фиг.4С показана противовирусная активность низких концентраций RAPA при исследовании на наборе штаммов R5 ВИЧ-1. Клеточную пролиферацию анализировали на неинфицированных клетках от того же донора, культивированных в идентичных условиях. Результаты (средние величины ± стандартное отклонение по трем лункам) репрезентативны для 3 независимых экспериментов, каждого на клетках от другого донора.

На фиг.5 показано, что RAPA ингибирует репликацию ВИЧ-1 у MDM. Очищенные моноциты культивировали в течение 5 дней в присутствии RAPA. На 5-й день клетки инфицировали ADA ВИЧ-1 и культивировали в присутствии RAPA в течение еще 14 дней. На 7-й, 10-й и 14-й день после инфекции рост вируса измеряли анализом RT. На 14-й день жизнеспособность клеток определяли МТТ. Результаты (средние величины ± стандартное отклонение по трем лункам) репрезентативны для данных, полученных в 3 независимых экспериментах, каждом с использованием клеток от другого донора.

На фиг.6 показано, что RAPA усиливает противовирусную активность антагониста CCR5 TAK-779. PBMC, которые культивировали в отсутствие или в присутствии RAPA (1, 10 и 100 нМ) в течение 7 дней, инфицировали ADA ВИЧ-1 в присутствии 0,1 нМ TAK-779. Инфицированные клетки культивировали в присутствии RAPA и 0,1 нМ TAK-779. На 7-й день после инфекции продукцию вируса измеряли анализом р24 в надосадочной жидкости культуры. Следует отметить логарифмическую шкалу на оси y. Данные представляют средние величины ± стандартное отклонение по трем лункам. Показаны репрезентативные результаты, полученные в одном из трех независимых экспериментов.

На фиг.7 показано, что HU усиливает противовирусную активность антагониста CCR5 TAK-779. РВМС, которые культивировались в отсутствие или в присутствии HU в течение 7 дней, инфицировали ADA ВИЧ-1 в присутствии или в отсутствие TAK-779. На 7-й день после инфекции продукцию вируса измеряли анализом р24 в надосадочной жидкости культуры.

На фиг.8А-8В показана эффективность HU в супрессии экспрессии CCR5 на Т клетках и моноцитах; на фиг.8А показана супрессия поверхностной экспрессии CCR5 на Т клетках CD4⁺ HU в РВМС, которые культивировали в течение 7 дней в присутствии IL-2 и HU и затем анализировали для определения уровней CCR5, причем экспрессия CCR5 на Т-лимфоцитах CD4 ⁺ показана в виде сплошной линии, а флюоресценция вследствие контроля изотипа IgG показана в виде пунктирной линии; на фиг.8В показано ингибирование HU транскрипции мРНК CCR5 в РВМС. Общее количество РНК выделяли из РВМС, которые культивировали в присутствии IL-2 и HU в течение 7 дней (клетки из одного и того же эксперимента, как показано на фиг.8А). Эквивалентные количества РНК подвергали RT-PCR, используя затравочные пары, специфичные для амплификации мРНК CCR5 (верхняя) и РНК рибосом 18S (нижняя).

На фиг.9 показаны изменения, по сравнению с исходным уровнем, мРНК CCR5 в качестве измерения экспрессии CCR5. Величины нормализованы для клеточного конститутивного гена бета-актина. Отличия складки от исходного уровня (нулевой день) отмечены на логарифмической шкале. Испытанные точки времени включают 7-й, 14-й и 28-й день во время введения RAPA, а затем 42-й день, через 2 недели после прекращения введения RAPA.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

В настоящем описании способ лечения вирусной инфекции обозначает и включает в себя «профилактическое» лечение или «терапевтическое» лечение. «Профилактическое» лечение представляет собой лечение, проводимое у индивидуума, у которого нет признаков заболевания или у которого присутствуют ранние признаки заболевания, с целью уменьшения риска развития патологии, связанной с заболеванием.

Используемый в настоящем описании термин «терапевтическое» означает лечение, проводимое у индивидуума, у которого отмечаются признаки патологии, с целью уменьшения или устранения этих признаков.

Используемый в настоящем описании термин «терапевтически эффективное количество» означает количество соединения, которое достаточно для обеспечения благоприятного эффекта у индивидуума, которому вводится соединение. Благоприятный эффект означает, например, придание вирусу некомпетентности для репликации, ингибирование вирусной репликации, ингибирование инфекции другой клетки-хозяина или увеличение количества Т клеток CD4.

Используемый в настоящем описании термин «пораженная вирусом клетка» означает клетку, в которой присутствует вирус и который является инфицирующим или потенциально инфицирующим, и включает эпителиальные клетки, клетки нервной системы, Т-лимфоциты (активированные или покоящиеся), макрофаги, моноциты, тканевые дендритные клетки или им подобные.

Используемый в настоящем описании термин «функциональный эквивалент» означает, что агент сохраняет некоторую или всю биологическую активность соответствующего соединения.

Используемый в настоящем описании термин «функциональный аналог» означает соединения, полученные из конкретного первоначального соединения прямыми замещениями, которые не приводят к существенной (т.е. более чем в 100 раз) потере биологической активности первоначального соединения, где такие замещения представляют собой модификации, хорошо известные специалистам в данной области, например этерификация, замещение водорода галогеном, замещение алкокси алкилом, замещение алкила алкокси и тому подобное.

Соединения, блокирующие фазу G1

Композиции по настоящему изобретению могут включать любой агент, блокирующий фазу G1, который блокирует, задерживает или продлевает активность клеточного цикла в фазе G1 и/или переходе между G1 и S мононуклеарных клеток и уменьшает экспрессию CCR5. Предпочтительно агент, блокирующий фазу G1, прерывает реакцию лимфоцита на IL-2 (посредством IL-2R), который управляет переходом от фазы G1 к фазе S, а также прохождение через фазу S.

Агенты, блокирующие фазу G1, включают, но не ограничиваются, бутират натрия, афидиколин, гидроксимочевину (HU), оломуцин, росковитин, токоферолы, токотриенолы, рапамицин (RAPA) и/или их функциональные аналоги. Предпочтительно композиция включает рапамицин, который ингибирует реакцию Т клеток на IL-2, вещество, которое запускает Т клетки, уже активированные TCR, для прохождения через G1. Поэтому рапамицин блокирует клетку на переходе от G1 к S. Предпочтительнее композиция включает эффективное количество RAPA для прерывания реакции лимфоцита на IL-2 (через IL-2R), который управляет переходом от фазы G1 к фазе S, вызывая посредством этого уменьшении экспрессии CCR5 и одновременно уменьшая количество рецепторных участков для вхождения ВИЧ.

В настоящем изобретении используется одно из идентифицированных выше соединений, блокирующих фазу G1, для введения индивидууму, страдающему вирусной инфекцией, причем соединение удлиняет фазу G1 клеточного цикла активированного лимфоцита, ингибируя посредством этого экспрессию рецепторов CCR5 и уменьшая количество сайтов связывания лигандов gp120 ВИЧ.

Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим по меньшей мере одно соединение, блокирующее фазу G1, и, необязательно, по меньшей мере одно противовирусное средство, а также к способам профилактики, лечения и/или уменьшения эффектов ВИЧ. Способы предусматривают введение указанных композиций, содержащих соединения, блокирующие фазу G1, и необязательно противовирусные средства, причем эти два соединения можно вводить отдельно, одновременно, совместно или последовательно.

Фармацевтически приемлемые производные и соли

Термин «фармацевтически приемлемое производное» используется в настоящем описании для обозначения любой фармацевтически или фармакологически приемлемой соли, сложного эфира или соли такого сложного эфира соединения по изобретению, или любого соединения, которое, после введения реципиенту, способно обеспечить (прямо или косвенно) одно или несколько соединений в соответствии с изобретением или их противовирусно активный метаболит или остаток.

Предпочтительные сложные эфиры соединений, блокирующих фазу G1, по изобретению включают сложные эфиры карбоновых кислот, в которых некарбонильная часть сложноэфирной группы выбрана из прямого или разветвленного алкила, например н-пропила, трет-бутила, н-бутила, алкоксиалкила (например, метоксиметила), аралкила (например, бензила), арилоксиалкила (например, феноксиметила), арила (например, фенила, необязательно замещенного галогеном,

С_1-4алкила или С_1-4алкокси или амино); сложных эфиров сульфоната, таких как алкил- или аралкилсульфонил (например, метаносульфонила); сложных эфиров добавления аминогруппы (например, L-валила или L-изолейцила) и сложных эфиров моно-, ди- или трифосфата. Сложные эфиры фосфата могут быть дополнительно этерифицированы, например, С_1-20 спиртом или его реактивным производным, или 2,3-ди С_2-4 ацилглицерином.

Фармацевтически приемлемые соли включают, без ограничения, соли органических карбоновых кислот, таких как уксусная, молочная, винная, яблочная, изетионовая, лактобионовая, п-аминобензойная и янтарная кислоты; органические сульфоновые кислоты, такие как метансульфоновая, этансульфоновая, бензолсульфоновая и п-толуолсульфоновая кислоты, и неорганические добавки, такие как хлористоводородная, серная, фосфорная и сульфамовая кислоты.

Противовирусные соединения

В одном из аспектов композиции и способ настоящего изобретения, кроме того, включают терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного противовирусного средства, включая, но ими не ограничиваясь, ингибиторы нуклеозида RT, ингибиторы/антагонисты CCR5, ингибиторы вирусного вхождения и их функциональные аналоги.

Предпочтительно противовирусное средство включает ингибиторы нуклеозида RT, такие как зидовудин (ZDV, AZT), ламивудин 93TC), ставудин (d4T), диданозин (dd1), залцитабин (ddC), абакавир (АВС), эмивирин (FTC), тенофовир (TDF), делавирадин (DLV), эфавиренц (EFV), невирапин (NVP), сикванавир (SQV), ритонавир (RTV), инданавир (IDV), нелфинавир (NFV), ампренавир (APV), лопинавир (LPV), атазанавир, комбивир (ZDV/3TC), калетра (RTV/LPV), тризивир (ZDV/3TC/ABC);

ингибиторы/антагонисты CCR5, такие как SCH-C, SCH-D, PRO 140, TAK-779, TAK-220, аналоги RANTES, AK602, UK-427, 857, моноклональные антитела;

ингибиторы вирусного вхождения, такие как фузеон (Т-20), NB-2, NB-64, T-649, T-1249, SCH-C, SCH-D, PRO 140, TAK-779, TAK-220, аналоги RANTES, AK602, UK-427, 857, и их функциональные аналоги.

Противовирусное лечение

Хотя современное противовирусное (ARV) лечение вызывает супрессию репликации ВИЧ и приводит к улучшению иммунной функции, оно ограничено высокой стоимостью, токсичностью и сложностями соблюдений врачебных предписаний. Более того, возможность достижения длительного контроля за ВИЧ инфекцией только противоретровирусным лечением является мало вероятным. К настоящему времени было показано, что современная противоретровирусная терапия неэффективна для полного уничтожения ВИЧ у инфицированных индивидуумов, и нет реальных данных о том, что количество остаточного вируса уменьшается со временем после обычной противоретровирусной терапии. Более того, после прекращения противоретровирусной терапии количество вируса может быстро повыситься до более высоких уровней по сравнению с количеством вируса перед лечением (Davey, 1999; Dybul et al., 2002 and 2001).

Противоретровирусная терапия требует строгого соблюдения сложных схем введения. Было показано, что частота вирусологической несостоятельности в течение 6-месячного периода времени достигала 60% у пациентов, которые не могут достичь более чем 95% соблюдения назначенного лечения. Комбинация множества неблагоприятных побочных эффектов, связанных с противоретровирусной терапией, и доступность этого лечения только для 1 из 20 из 33 миллионов людей, инфицированных, по оценкам, во всем мире, побудили к пересмотру современных стратегий достижения целей терапии ВИЧ инфекции.

Более того, в настоящее время считают, что терапия ВИЧ является пожизненным процессом. Поэтому жизненно важно разработать эффективные способы лечения, которые можно успешно проводить в течение длительных периодов времени для подавления ретровирусов и, в частности, предотвращения инфекции и/или ингибирования ВИЧ. Кроме того, желательно устранить или, по меньшей мере минимизировать цитотоксичность, связанную с введением противовирусных средств, которые в остальном определены как эффективные. В целом признано, что токсичность противовирусного агента можно избежать или, по меньшей мере, минимизировать введением сниженной дозы противовирусного средства; однако, также признано, что эффективность противовирусного средства в целом уменьшается по мере снижения дозы.

Таким образом, осуществление настоящего изобретения обеспечивает снижение дозы противовирусных средств при поддержании или снижении вирусной нагрузки использованием циклической терапии и введением агентов G1 клеточного цикла по настоящему изобретению в схему введения для ВИЧ инфицированного индивидуума. В частности, применение соединений, блокирующих фазу G1 в комбинации с противовирусными средствами, показало перспективу поддержания подавления вирусов в программе введения циклической терапии. Было показано, что путем использования на 50% меньшего количества лекарственных средств снижаются побочные эффекты, связанные с применением противоретровирусных средств и увеличивается соблюдение назначенной схемы лечения. Другое очевидное воздействие происходит на общую стоимость лекарственных средств, что будет содействовать распространению этих препаратов по всем развивающимся странам.

Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения циклическая терапия используется в качестве альтернативного подхода, предназначенного для увеличения активности противовирусных средств, уменьшения стоимости и токсичности препаратов. Кроме того, поскольку один компонент композиций настоящего изобретения нацелен на клеточный механизм хозяина, а не на вирус, заявители ожидают, что устойчивость вируса к этой комбинации препаратов по существу не должна возникнуть.

Схема циклической противовирусной терапии может продолжаться в течение примерно 12 недель, а затем на 4 неделе добавляется или замещается соединение, блокирующее фазу G1. Если вирусная нагрузка остается низкой или приблизительно постоянной, циклы могут чередоваться для уменьшения периода времени каждого цикла. Период времени для приема противовирусных препаратов может быть уменьшен при усилении соединением, блокирующим фазу G1. Кроме того, может быть введен период времени, который не включает противовирусные препараты, а включает только соединение, блокирующее фазу G1. Этот период времени, в течение которого индивидуум не принимают противовирусные средства, предоставляет биологической системе индивидуума достаточно времени для восстановления или компенсации токсических эффектов противовирусного соединения.

Кроме того, композиции и способы настоящего изобретения можно использовать для лечения ВИЧ инфекций снижением вирусной нагрузки и репликации вируса уменьшением количества участков связывания для лигандов gp120.

Подлежащие введению дозы меняются в соответствии с агентом, блокирующим фазу G1, противовирусным средством, периодом лечения, частотой введения, хозяином и природой или тяжестью инфекции. Дозу может определить специалист в данной области без ненужного количества экспериментов.

Композиции изобретения вводятся по существу в концентрациях нетоксичных дозировок, достаточных для обеспечения высвобождения достаточной единицы дозировки настоящей комбинации в организм пациента для обеспечения желательного ингибирования ВИЧ. Действительная введенная дозировка будет определяться физическими и физиологическими факторами, такими как возраст, масса тела, тяжесть состояния и/или клинический анамнез пациента. Активные противовирусные компоненты в идеале вводятся для достижения концентраций противовирусного средства в плазме in vivo от примерно 0,01 мкМ до примерно 100 мкМ, предпочтительнее примерно от 0,1 до 10 мкМ, а наиболее предпочтительно примерно 1-5 мкМ и агента, блокирующего фазу G1, примерно от 1 до 25 мкМ, предпочтительнее примерно 2-20 мкМ, а наиболее предпочтительно примерно 5-10 мкМ.

Например, при лечении ВИЧ-положительных пациентов и больных СПИДом в способах настоящего изобретения могут использоваться композиции для обеспечения примерно от 0,005 до 500 мг/кг массы тела в день противовирусного средства, предпочтительнее примерно от 0,1 до 200 мг/кг в день и наиболее предпочтительно от 1 до 50 мг/кг в день, и примерно от 0,01 до 1000 мг/кг массы тела в день агента, блокирующего фазу G1, предпочтительнее примерно от 0,001 до 1000 мг/кг в день или наиболее предпочтительно примерно от 0,5 до 50 мг/кг в день. Конкретные стандартные дозировки агента, блокирующего фазу G1, и противовирусного средства настоящего изобретения включают количества в размере 50 мг, 100 мг, 200 мг, 500 мг и 1000 мг, например, включенные в отдельные композиции. Или вместе, как обсуждено ниже.

Однако следует понимать, что уровни дозировки, которые отклоняются от предоставленных диапазонов, могут также подходить при лечении данной вирусной инфекции.

Терапевтическую эффективность соединений, блокирующих фазу G1, можно определить стандартными фармацевтическими процедурами в клеточных культурах или у экспериментальных животных, например, для определения LD₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) и ED₅₀ (дозы, терапевтически эффективной у 50% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический показатель, и он может быть в виде соотношения LD₅₀/ED₅₀ . Предпочтительны соединения, которые проявляют большие терапевтические показатели. Данные, полученные в результате анализов на клеточных культурах и исследований на животных, можно использовать при составлении диапазона дозировок для применения людьми. Дозировка таких соединений находится предпочтительно в пределах диапазона циркулирующих концентраций, которые включают ED₅₀ при небольшой или отсутствующей токсичности. Дозировка может варьироваться в пределах этого диапазона, в зависимости от используемой лекарственной формы и применяемого пути введения. Для любого соединения, используемого в способе изобретения, терапевтически эффективную дозу можно оценить первоначально по анализам на культурах клеток. Дозу можно составить на экспериментальных моделях у животных для достижения диапазона концентрации в циркулирующей плазме, который включает IC₅₀ (т.е. концентрации испытуемого соединения, которая достигает половины максимального ингибирования симптомов), по данным определения в клеточной культуре. Такую информацию можно использовать для более точного определения доз, которые можно использовать у людей. Уровни в плазме можно измерить, например, высоко эффективной жидкостной хроматографией.

Желательная доза предпочтительно представлена в двух, трех, четырех, пяти, шести или более субдоз, введенных через соответствующие интервалы в течение суток. Эти субдозы могут вводиться в стандартных лекарственных формах, например, содержащих от 0,01 до 1000 мг, предпочтительно от 1 до 50 мг, в зависимости от количества субдоз соединения, блокирующего фазу G1 на стандартную лекарственную форму.

Хотя определенное соединение, блокирующее фазу G1, и противовирусное средство можно вводить отдельно, или последовательно, или одновременно, предпочтительно представить их вместе объединенными в фармацевтической композиции.

Композиции настоящего изобретения могут включать и обсужденные выше ингредиенты вместе с одним или несколькими их носителями, и необязательно другие терапевтические средства. Каждый носитель должен быть «фармацевтически приемлемым» в том смысле, что он совместим с другими ингредиентами композиции и не вреден для индивидуума.

Настоящее изобретение предоставляет способ лечения или профилактики вирусной инфекции, такой как ретровирусные инфекции, которые можно лечить или предотвратить в соответствии с изобретением, включая ретровирусные инфекции у людей, такие как инфекции вирусом иммунодефицита человека. Определенные соединения, блокирующие фазу G1, композиции и способы в соответствии с изобретением особенно полезны для лечения СПИДа и связанных ВИЧ-положительных состояний. Соединения настоящего изобретения можно также применять для лечения бессимптомных инфекций или заболеваний у людей, вызванных или связанных с ретровирусами человека.

Терапевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в комбинации с другими терапевтическими средствами для лечения вирусных инфекций или состояний. Примеры таких дополнительных терапевтических средств включают средства, которые эффективны для лечения вирусных инфекций или связанных состояний, такие как иммуномодулирующие агенты, такие как тимосин, ингибиторы рибонуклеотид-редуктазы, такие как 2-ацетипиридин 5-[(2-хлоранилин)тиокарбонил)тиокарбоногидразон, интерфероны, такие как альфа-интерферон, 1-бета-D-арабинофуранозил-5-(1-пропинил)урацил, 3'-азидо-3'-деокситимидин, рибавирин и фосфономуравьиная кислота.

Пути введения

Композиции в соответствии с настоящим изобретением можно вводить для лечения любым подходящим путем, включая пероральный, ректальный, назальный, местный (включая трансдермальный, буккальный и сублингвальный), вагинальный и парентеральный (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрикожное). Следует понимать, что предпочтительный путь будет варьироваться в зависимости от состояния и возраста реципиента, природы инфекции и выбранного активного ингредиента.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения включают те, которые подходят для перорального, ректального, назального, местного (включая трансдермальное, буккальное и сублингвальное), вагинальное или парентеральное (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрикожное) введение.

Композиции могут быть для удобства представлены в стандартной лекарственной форме и могут быть изготовлены способами, известными в области фармации. Такие способы включают стадию получения ассоциации соединения, блокирующего фазу G1, и, необязательно, противовирусного средства с носителем. Носитель необязательно включает один или несколько вспомогательных ингредиентов. В целом, композиции изготавливают получением однородной и тесно связанной ассоциации отдельных ингредиентов с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями или ими обоими, и затем, при необходимости, профилированием продукта.

Композиции, подходящие для трансдермального введения, могут быть представлены в виде дискретных накладок, приспособленных оставаться в тесном контакте с эпидермисом реципиента в течение длительного периода времени. Такие накладки для удобства содержат соединение, блокирующее фазу G1, и, необязательно, противовирусное средство, такое как антагонист CCR5, 1) в водном растворе с необязательным добавлением буфера; 2) растворенные и/или диспергированные в адгезивном веществе или 3) диспергированные в полимере.

Композиции настоящего изобретения, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в дискретных единицах, таких как капсулы, саше или таблетки, каждая из которых содержит заданное количество ингредиентов; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной или не водной жидкости; или в виде жидкой эмульсии масла в воде или жидкой эмульсии воды в масле.

Таблетка может быть изготовлена прессованием или формовкой, необязательно с одним или несколькими дополнительными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть изготовлены прессованием в подходящей машине соединения, блокирующего фазу G1 и противовирусное средство, в свободно текучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно, смешанной со связывающим веществом (например, повидоном, желатином, гидроксипропилметилцеллюлозой), смазывающим агентом, инертным разбавителем, консервантами, разрыхлителем (например, гликолят-крахмалом натрия, поперечно сшитым повидоном, поперечно сшитой карбоксиметилцеллюлозой натрия), поверхностно-активным или диспергирующим агентом. Формованные таблетки могут быть изготовлены формовкой в подходящей машине смеси порошкообразного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем. Таблетки могут быть необязательно покрыты или снабжены насечкой и могут быть составлены так, чтобы обеспечить медленное или контролируемое высвобождение одного или нескольких из содержащихся в них ингредиентов, с использованием, например, гидроксипропилметилцеллюлозы в варьирующихся пропорциях для обеспечения желательного профиля высвобождения. Таблетки могут необязательно быть обеспечены энтеросолюбильным покрытием для обеспечения высвобождения в частях пищеварительного тракта, кроме желудка.

Композиции, подходящие для местного введения в ротовую полость, включают лепешки, содержащие одно или несколько соединений, блокирующих фазу G1, и необязательно противовирусное средство в ароматизированной основе, обычно сахарозе или акации; пастилки, содержащие один или более ингредиентов в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и акация, и средства для полоскания ротовой полости, включающие один или несколько ингредиентов в подходящем жидком носителе.

Композиции для ректального введения могут быть представлены в виде суппозиториев с подходящим основанием, включающим, например, масло какао или салицилат.

Композиции, подходящие для вагинального введения, могут быть представлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или аэрозольных композиций, содержащих, в дополнение к одному или нескольким соединениям настоящего изобретения, такие носители, которые в данной области известны как соответствующие.

Композиции, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные изотонические стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические агенты и растворенные вещества, которые делают композиции изотоничными с кровью предполагаемого реципиента, и водные ил неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители. Композиции могут быть представлены в запаянных контейнерах с одной стандартной дозой или с множеством доз, например ампулах и флакончиках, и они могут храниться в замороженном и высушенном (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного водного носителя, например воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Растворы и суспензии для приготовления перед использованием могут быть получены из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного вида.

Для индивидуума в перинатальном периоде лекарственную комбинацию можно, например, вводить перорально после 36 недель беременности и продолжать в течение периода родов. Наиболее эффективны вмешательства примерно во время поздних сроков беременности и родов (когда, как считают, происходит большинство случаев передачи).

В дополнение к композициям, описанным ранее, соединения могут быть также составлены в виде депонированных препаратов. Такие длительно действующие композиции можно вводить имплантацией (например, подкожно или внутримышечно) или внутримышечной инъекцией. Так, например, соединения могут быть составлены в композиции с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в подходящем масле), или ионообменными смолами, или слабо растворимыми производными, например слабо растворимой солью. Другие подходящие системы доставки включают микросферы, которые обеспечивают возможность местной неинвазивной доставки препаратов в течение продолжительного периода времени. Введенное лекарственное средство медленно высвобождается их этих микросфер и захватывается клетками окружающей ткани (например, эндотелиальные клетки).

При желании композиции могут быть представлены в упаковке или устройстве подачи, которые могут содержать одну или несколько стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, включать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. Упаковка или устройство подачи может сопровождаться инструкциями по введению.

Подходящие средства воздействия на стадию G1 клеточного цикла могут применяться в стратегиях лечения ВИЧ инфекции, которые обеспечивают возможность поддержания продолжительного подавления вирусов с меньшей зависимостью от комбинированной противоретровирусной (ARV) терапии. Современной целью ARV является получение насколько возможно сильного подавления вирусов в течение насколько возможно длительного периода. Потребность в менее частом введении или в уменьшенном количестве ARV для контроля подавления вирусов непосредственно направлена на решение изложенной ниже проблемы, связанной с достижением современных целей противоретровирусного лечения, включающих:

1. Современные схемы HAART обременительны и сложны и требуют стойкую переносимость и строгое соблюдение схемы приема 3 или более препаратов.

2. Длительное строгое соблюдение предписанного лечения может быть невозможным для большинства пациентов.

3. Длительная устойчивость к накапливающемуся токсическому действию лекарственных средств у большинства пациентов может быть невозможна.

4. Современные руководства по лечению ВИЧ инфекции рекомендуют относительно позднее начало HAART ввиду неспособности HAART отдельно искоренить инфекцию и риск связанных с препаратами побочных эффектов, включая тяжелые метаболические синдромы.

5. У некоторых пациентов, которых не лечили до более поздних стадий заболевания, будет высокий уровень вирусной нагрузки, который может увеличить риск передачи и вызвать проблему общественного здравоохранения.

6. Наконец, огромное большинство инфицированных ВИЧ людей во всем мире не имеют доступа к противоретровирусным препаратам, главным образом, ввиду высокой стоимости.

Включением средств, блокирующих клеточную фазу G1 в терапевтические подходы, со смещением сосредоточения в сторону поддержания длительного контроля вируса можно получить менее сложные, менее токсичные и более приемлемые по затратам схемы, которые могут быть применимы во всем мире. Настоящее изобретение, которое нацеливает клеточный цикл G1 на снижение экспрессии рецепторов CCR5 в активированных Т клетках, можно успешно использовать для поддержания подавления вирусов при хронической инфекции ВИЧ-1 без необходимости продолжительной терапии множеством противоретровирусных препаратов. Эти результаты оказывают положительное воздействие на затраты, побочные эффекты и доступность терапии ВИЧ инфекции.

Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые ни в коей мере не должны рассматриваться как ограничивающие.

Пока нет других указаний, в практике настоящего изобретения используются обычные методики клеточной биологии, клеточной культуры, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые известны в данной области. Эти методики полностью описаны в литературе (см., например, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2 ^nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N.Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Patent No: 4683195; Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames & S.J.Higgins eds., 1984); Transcription And Translation (B.D.Hames & S.J.Higgins eds., 1984); Culture Of Animal Cells (R.I.Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); The treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H.Miller and M.P.Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M.Weir and С.С.Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

ПРИМЕРЫ

Методы и материалы

Клеточная культура и проточная цитометрия. Выращивание культур мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) и макрофагов, полученных из моноцитов (MDM) здоровых доноров, проводили, как описано в публикациях (Poli, 1993; Perno, 1993). РВМС поддерживали в присутствии 100 единиц/мл rhIL-2 (Roche Molecular Biochemicals). Жизнеспособность клеток определяли окрашиванием трипановым синим или анализом МТТ (Roche Molecular Biochemicals).

RAPA приобретали у компании Calbiochem. Антагонист CCR5, TAK-779, получали из Программы исследований СПИДа и эталонных реагентов Национальных институтов здоровья (Rockville, MD).

Поверхностную экспрессию CCR5 измеряли на РВМС, культивированных в присутствии IL-2 в течение 7-10 дней. Окрашивание проводили, как описано в публикации (Lane, 1999), но используя mAb 182 против CCR5 (R&D Systems). Фоновое окрашивание определяли добавлением подобранного по изотипу контроля (IgG2b, R&D Systems), вместо mAb против CCR5. Данные получали, используя проточный цитометр FASCCalibur (BD Biosciences) и анализировали использованием FLOWJO (Tree Star, San Carlos, CA).

Уровни -хемокинов MIP-1 , MIP- и RANTES измеряли в культуральных супернатантах использованием наборов ELISA (R&D Systems).

Анализы инфективности. Следующие вирусы использовали в экспериментах с инфекцией: ВИЧ-1 IIIb, ВИЧ-1 ADA, ВИЧ-1 Bal, ВИЧ-1 JRFL, ВИЧ-1 JRCSF и ВИЧ-1 SF162. ВИЧ-1 IIIb представляет собой адаптированный к Т-клеточной линии лабораторный штамм, который использует CXR4 для вхождения в клетки, тогда как остальные представляют собой изоляты, которые используют CCR5. Вирусы получали из Программы исследований СПИДа и эталонных реагентов Национальных институтов здоровья.

Для инфекции РВМС свежие РВМС культивировали в течение 7 дней в среде, содержащей IL-2. На 7-й день клетки подвергали воздействию вируса в течение 3 часов. Неадсорбированный вирус удаляли трехкратным промыванием клеток PBS. Инфицированные клетки культивировали в среде IL-2. Инфекцию MDM проводили, как описано выше (Perno, 1993). Пока нет других указаний, РВМС инфицировали использованием moi (множественности заражения) 0,001 и MDM инфицировали использованием moi 0,002. Рост вируса контролировали в культуральных надосадочных жидкостях измерением уровней антигена р24 ELISA (NEN) или измерением активности вирусной RT в анализе RT (Willey, 1988).

Методологии PCR. Амплификацию CCR5 и последовательностей РНК -химокина выполняли RT-PCR, как описано в публикациях (Baba, 1996; Levine, 1996). В некоторых экспериментах эффект обработки RAPA на вхождение вируса в РВМС исследовали PCR ДНК. Вкратце, РВМС, которые были обработаны IL-2 и RAPA в течение 7 дней, инфицировали в течение 3 часов ВИЧ-1 IIIb или ВИЧ-1 ADA при moi 0,05. Вирусные инокуляты сначала фильтровали через фильтр 0,22 мкм и затем обрабатывали ДНазой (10 мкг/мл) в течение 30 мин при 37°С для обеззараживания инокулята ДНК ВИЧ-1. Инфицированные клетки обильно промывали для удаления остаточного вируса. Через 24 часа после инфекции получали клеточные лизаты и аликвотные количества амплифицировали PCR ДНК, используя затравочную пару М661/М667 (Zack, 1990). Амплифицированные продукты выявляли жидкостной гибридизацией, используя зонд, меченный ³²Р (Spina, 1995). Интенсивности сигналов гибридизации измеряли фосфовизуализирующим устройством. Затравки -актина использовали для контроля входа количества ДНК в образце.

Пример 1

Влияние RAPA на пролиферацию и жизнеспособность РВМС. Очищенные РВМС от здоровых доноров культивировали в присутствии IL-2 и RAPA (10-кратные серийные разведения от 10⁴ до 0,01 нМ). На 7-й день степень клеточной пролиферации измеряли анализом МТТ. Показаны репрезентативные результаты, полученные в одном из двух независимых экспериментов, в каждом с использованием клеток от четырех доноров. Для каждого донора величины данных представляют собой среднюю величину ± стандартное отклонение по трем независимым лункам. Как показано на фиг.1, уменьшенную пролиферацию, измеренную анализом MTT на 7-й день, выявляли при концентрациях препаратов 1 нМ. Токсичность препаратов наблюдали при концентрациях препаратов выше 10³ нМ (данные не показаны).

Пример 2

RAPA обеспечивает супрессию экспрессии CCR5 на Т-лимфоцитах и моноцитах. Специфичность CCR5 определяли, используя последовательность операций поверхностного окрашивания измерением экспрессии CCR5 на лимфоцитах от здорового донора и от донора, ранее характеризовавшегося как гомозиготного в отношении мутации 32 в гене CCR5. Перед окрашиванием РВМС от обоих доноров культивировали в течение 7 дней в присутствии IL-2, потому что эти условия культивирования обеспечивают повышающую регуляцию поверхностной экспрессии CCR5 (Bleul, 1997). Результаты, изображающие экспрессию CCR5 на синхронизированных CD4 Т-клетках, показаны на фиг.2А. Результаты показывают специфическое выявление поверхностной экспрессии CCR5 на Т клетках CD4⁺ от здорового донора, но не на Т-клетках CD4⁺ от индивидуума, гомозиготного по мутации 32 в гене CCR5. Результаты указывают на то, что методология, использованная в настоящем примере, может специфически выявить поверхностную экспрессию CCR5.

Для определения эффекта RAPA на поверхностную экспрессию CCR5 на лимфоцитах от здоровых доноров свежие донорские РВМС культивировали в среде IL-2 в присутствии увеличивающихся концентраций RAPA (0,1, 1, 10 и 100 нМ) в течение 10 дней. На 7-й и 10-й день поверхностную экспрессию CCR5 на Т-лимфоцитах CD4 и CD8 измеряли двойным окрашиванием антителами против CD4 и против CD8 в комбинации с mAb 182 против CCR5 и анализом на FASC. Результаты 7-го и 10-го дня указали на то, что концентрации RAPA 1 нМ осуществляли супрессию поверхностной экспрессии CCR5 на лимфоциты CD4 у пяти тестированных доноров. RAPA в концентрации 0,1 нМ осуществлял супрессию экспрессии белка CCR5 на лимфоцитах CD4 от одних и тех же, но не всех доноров. Репрезентативные результаты 7-го дня, показывающие концентрации RAPA, которые эффективно осуществляли супрессию CCR5 у всех доноров, изображены на фиг.2В. Аналогичное уменьшение экспрессии CCR5 было очевидным на субпопуляции лимфоцитов CD8, и супрессия CCR5 в обоих субпопуляциях лимфоцитов CD4 и CD8 также наблюдалась на 10-й день (данные не показаны).

На уровне транскрипции анализ с помощью полуколичественной RT-PCR РНК, выделенной из культур РВМС, обработанных RAPA, показал уменьшенные количества транскриптов CCR5 в присутствии препарата (верхняя полоса фиг.2С). Анализ с помощью полуколичественной RT-PCR рибосомной РНК 18S показал одинаковое содержание РНК среди образцов, дающих сниженные уровни транскриптов CCR5 (нижняя полоса фиг.2С). Кроме того, амплификация образцов РНК в отсутствие этапа RT, не дала сигнала амплификации, таким образом, исключая возможность загрязнения клеточной ДНК в препаратах РНК (данные не показаны).

Аналогичным образом RAPA осуществляет супрессию экспрессии CCR5 на клеточной поверхности на созревающих моноцитах. Моноциты, культивированные в течение 5 дней в присутствии RPMI 20/10% ABHS и RAPA подвергали двойному иммуноокрашиванию для выявления CD14 и CCR5. Изменения поверхностной экспрессии CCR5 исследовали в клетках, синхронизированных CD14. Профиль иммунофлюоресценции, полученный антителом mAb 182 против CCR5 (сплошная линия), сравнивают с профилем иммунофлюоресценции контроля изотипа IgG2b (пунктирная линия), как показано на фиг.2D. Моноциты, культивированные в течение 5 дней в присутствии RAPA, проявили сниженные уровни поверхностной экспрессии CCR5, по сравнению с культурами, не обработанными препаратом. Эксперименты с использованием моноцитов от трех различных доноров показали согласованную супрессию поверхностной экспрессии CCR5 при концентрациях RAPA, достигающих нижнего уровня 0,01 нМ. Эти результаты показывают, что RAPA снижает поверхностную экспрессию CCR5 на культивированных Т-лимфоцитах (и CD4, и CD8) и моноцитах. Вместе с результатами RT-PCR на РВМС, эти результаты указывают на то, что RAPA препятствует экспрессии CCR5 снижением генной транскрипции.

Пример 3

RAPA увеличивает внеклеточные уровни культур MIP-1 и MIP-1 :

Ввиду того, что лимфоциты и моноциты, культивируемые в присутствии RAPA, проявили сниженные уровни РНК CCR5 и белка, измеряли уровни лигандов CCR5 MIP-1 , MIP-1 и RANTES в надосадочных жидкостях культур РВМС, обработанных RAPA. РВМС от четырех доноров культивировали в присутствии IL-2 и RAPA в течение 10 дней. На 10-й день у каждого донора определяли процентную долю клеток, экспрессирующих CCR5, и содержание хемокинов в надосадочной жидкости. Как и в предыдущих экспериментах, обработка RAPA привела к сниженным уровням экспрессии белка CCR5. При измерении содержания хемокинов в культуральных надосадочных жидкостях было обнаружено, что уровни MIP-1 и MIP-1 были выше в присутствии RAPA, чем в его отсутствие, у всех четырех доноров. Среди различных доноров культуры, обработанные RAPA, содержали в 6-39 раз более высокие уровни MIP-1 , чем необработанные культуры. Аналогичным образом уровни MIP-1 были увеличены в 17-47 раз в присутствии RAPA по сравнению с необработанными контролями. Напротив, уровни RANTES в присутствии RAPA были увеличены у двух доноров, в то же самое время оставаясь неизменными или даже снижаясь у других. Результаты определения уровней хемокинов, полученные у двоих из доноров, проявивших расхождение уровней RANTES, изображены на фиг.3А.

Для определения того, были ли возросшие уровни белков MIP-1 и MIP-1 , выявленные в надосадочных жидкостях клеток, обработанных RAPA, результатом возросшей транскрипционной активности, общее содержание РНК из обработанных RAPA и необработанных культур было амплифицировано полуколичественной RT-PCR. Амплификация РНК, выделенной на 3-й, 7-й и 10-й день культуры, затравочной парой, специфичной для MIP-1 и MIP-1 , не проявила различий количества транскрипта для любого хемокина между обработанными RAPA и необработанными культурами (данные не показаны). Эти данные свидетельствовали о том, что RAPA не повышает внеклеточные уровни MIP-1 / усилением продукции хемокиновых транскриптов.

Представленные выше результаты, показывающие, что обработка клеток RAPA привела к уменьшенным количествам транскриптов CCR5 (и уровней белка) без усиления продукции хемокиновых транскриптов, свидетельствовали о том, что наблюдаемые увеличения уровней белков MIP-1 / происходят вследствие отсутствия захвата хемокина клетками, обработанными RAPA. Представленные выше результаты были подтверждены оценкой воздействия RAPA на секрецию MIP-1 , хемокина, который использует CCR5 в качестве своего единственного рецептора, в культурах РВМСБ, полученных от донора, гомозиготного по мутации 32 в гене CCR5. В этих экспериментальных условиях, при которых MIP-1 не может быть подвергнут эндоцитозу CCR5, эффекту RAPA на уровни белка MIP-1 , предоставили сведения в отношении механизма, посредством которого RAPA увеличивает уровни -хемокина. Для этого стимулированные РВМС от двух здоровых доноров и от донора без CCR5 культивировали в присутствии RAPA, как в предыдущих экспериментах. Уровни MIP-1 в надосадочных жидкостях оценивали на 10-й день. Репрезентативные результаты, полученные у одного из здоровых доноров, показаны на фиг.3В вслед за результатами, полученными у донора без CCR5. У здорового донора обработка RAPA привела к возросшему уровню белка MIP-1 (увеличение в 9,3 раза по сравнению с необработанным RAPA контролем), как ожидалось по предыдущим экспериментам. Однако в присутствии RAPA уровни белка MIP-1 у донора без CCR5 были увеличены лишь в 1,2 раза. Эти результаты вместе показывают, что возросшие уровни белка MIP-1 и, кроме того, MIP-1 , в присутствии RAPA, отражают накопление хемокина вследствие уменьшенного захвата клетками, проявляющими сниженные уровни корецептора CCR5.

Пример 4

Противовирусная активность RAPA в РВМС. Противовирусную активность RAPA анализировали в РВМС, которые культивировали в присутствии RAPA в течение 7 дней перед инфекцией. Клетки инфицировали штаммами X4 ВИЧ-1 IIIb и R5 ВИЧ-1 ADA. Инфицированные клетки культивировали в присутствии RAPA (в той же концентрации, что и во время предварительной обработки) в течение еще 7 дней, в течение которых измеряли репликацию вирусов и жизнеспособность клеток. Всего в семи различных экспериментах с использованием клеток от различных доноров противовирусный эффект RAPA был более мощным против ВИЧ-1 ADA, чем против ВИЧ-1 IIIb. Результаты, показанные на фиг.4А, по одному донору демонстрируют, что при 10 нМ RAPA средняя величина ингибирования ВИЧ-1 ADA в семи экспериментах составила 91% (диапазон от 88 до 97%), тогда как при 100 нМ RAPA ВИЧ-1 ADA ингибировался на 94% (диапазон от 92 до 99%). Напротив, 10 нМ RAPA ингибировал ВИЧ-1 IIIb на 13,5% (диапазон 5-25%), а 100 нМ RAPA ингибировал ВИЧ-1 IIIb на 32% (диапазон 29-60%).

Для дополнительной демонстрации диспропорционального противовирусного эффекта RAPA на штамм R5 в сравнении со штаммом Х4 ВИЧ-1 противовирусный эффект затем оценивали измерением вирусной ДНК в клетках вскоре после инфекции. РВМС донора, которые культивировали в течение 1 недели в присутствии (100 нМ RAPA) или в отсутствие препарата, были инфицированы обработанными ДНазой штаммами R5 ВИЧ-1 ADA или X4 ВИЧ-1 IIIb. Через 24 часа после инфекции готовили клеточные лизаты и амплифицировали для выявления последовательностей ДНК ВИЧ-1 PCR. Амплифицированные PCR продукты выявляли использованием меченного радиоактивным изотопом зонда. Как показано на фиг.4В, анализы фосфовизуализирующим устройством радиоактивных сигналов указали на то, что содержание ДНК ВИЧ-1 IIIb было одинаковым в обработанных RAPA и необработанных клетках. Напротив, содержание ДНК ВИЧ-1 ADA в обработанных RAPA клетках было в 3 раза ниже, чем в необработанных клетках. Затравочные пары, специфичные для гена -актина, показали одинаковый вход ДНК среди образцов (данные не показаны).

Поскольку результаты, полученные с ВИЧ-1 IIIb и R5 ВИЧ-1 ADA, свидетельствуют о том, что RAPA оказывал более мощный противовирусный эффект у R5, чем у Х4 ВИЧ-1, противовирусную активность низких концентраций RAPA (0,01, 0,1 и 1 нМ) затем оценивали против набора из 5 штаммов R5 ВИЧ-1 с результатами, показанными на фиг.4С. При этих концентрациях RAPA противовирусная активность наблюдалась против штаммов R5, но не против ВИЧ-1 IIIb. RAPA в концентрации 0,01 нМ ингибировал R5 ВИЧ-1 на 10-64%, в зависимости от штаммов, тогда как 0,1 нМ RAPA ингибировал репликацию вируса на 15-85%. При 1 нМ RAPA все вирусы R5 были ингибированы на 90%. Вместе эти результаты демонстрируют, что RAPA уменьшает восприимчивость РВМС к инфекции штаммами ВИЧ-1, использующими CCR5, в то же масое время оказывая небольшое воздействие на штаммы, использующие CXCR4.

Пример 5

Противовирусная активность RAPA в макрофагах. Противовирусную активность RAPA в MDM сначала анализировали в условиях культуры, которая, как было показано, осуществляет супрессию экспрессии CCR5 (см. представленные выше результаты). Для этого донорские моноциты культивировали в течение 5 дней в присутствии RAPA. На 5-й день клетки инфицировали ВИЧ-1 ADA. Инфицированные клетки культивировали в присутствии RAPA в течение еще 14 дней. Продукцию вируса измеряли на культуральных надосадочных жидкостях на 7-й, 10-й и 14-й день после инфекции. Жизнеспособность клеток измеряли анализом МТТ в конце эксперимента. В течение хода эксперимента RAPA ингибировали репликацию вируса зависимым от дозы образом. На 14-й день концентрации RAPA в диапазоне 0,1-100 нМ ингибировали продукцию вируса на 70-95%, как показано на фиг.5. Жизнеспособность клеток в конце эксперимента была снижена при концентрациях RAPA 10 нМ. В дополнительном эксперименте, в котором RAPA использовали в концентрации 0,01 нМ, R5 вирусы ВИЧ-1 ADA и ВИЧ-1 SF 162 ингибировались соответственно на 64% и 45% (данные не показаны).

В описанном выше эксперименте моноциты предварительно обрабатывали RAPA в течение 5-дневного периода дифференциации. Для устранения возможных помех RAPA процессу дифференциации моноцитов был спланирован новый эксперимент инфекции, в котором RAPA отсутствовал в течение 5-дневного периода дифференциации моноцитов. Для этого свежие моноциты культивировали в течение 5 дней в отсутствие RAPA. На 5-й день клетки инфицировали ВИЧ-1 ADA и затем подвергали воздействию RAPA. В этих экспериментальных условиях 2 независимых эксперимента с использованием моноцитов от двух различных доноров показали, что 1 нМ RAPA ингибировал репликацию вируса примерно на 60% у одного из доноров и примерно на 80% у другого донора (продукция вируса, измеренная на 14-й день после инфекции, данные не показаны).

Взятые вместе эти результаты показывают, что обработка RAPA дифференцирующихся моноцитов препятствует их способности стать восприимчивыми мишенями для ВИЧ инфекции и что RAPA также препятствует способности ВИЧ реплицироваться в уже дифференцированных макрофагах.

Пример 6

RAPA усиливает противовирусную активность антагониста CCR5 TAK-779. Тестирование проводили для определения того, увеличит ли супрессия поверхностной экспрессии CCR5, наблюдавшаяся в присутствии RAPA, активность препарата, антагониста CCR5. Для тестирования этой гипотезы, донорские РВМС культивировали в среде IL-2 в отсутствие или в присутствии RAPA (1, 10 и 100 нМ). Через 7 дней клетки инфицировали ВИЧ-1 ADA в присутствии 0,1 нМ ТАК-779, концентрации препарата ТАК-779, проявляющей низкую противовирусную активность. Инфицированные клетки культивировали в присутствии RAPA (в такой же концентрации, как во время предварительной обработки) плюс 0,1 нМ ТАК-779. Продукцию вирусов определяли через 7 дней после инфекции. Результаты, представленные на фиг.6, показывают, что в отсутствие RAPA 0,1 нМ ТАК-779 вызывал ингибирование репликации вируса на 21%. Однако в присутствии 1 нМ RAPA противовирусный эффект вследствие ТАК-779 увеличивался с ингибирования вируса на 21% до 74,5%. Аналогичным образом противовирусная активность ТАК-779 увеличивалась до ингибирования вируса соответственно на 89% и 96% в присутствии 10 и 100 нМ RAPA. Использованная концентрация ТАК-779 не оказывала воздействия на жизнеспособность клеток (данные не показаны). Эти результаты свидетельствуют о том, что противовирусные свойства препарата-антагониста CCR5 усиливаются RAPA.

Результаты, показанные на фиг.6, иллюстрируют синергическую эффективность при комбинации RAPA и ТАК-779. Как указано выше, 0,1 нМ ТАК-779 проявляет небольшую активность, и результаты, показанные на фиг.4, указывают на то, что введение одного RAPA снижает уровень Р24 до количеств нанограмм/мл. Однако комбинация обоих соединений снижает уровни р24 до пикограмм/мл. Таким образом, комбинация обеспечивает синергическое снижение репликации ВИЧ-1.

Пример 7

Синергическая активность RAPA и ТАК-779 в уменьшении репликации ВИЧ-1 дополнительно показана при комбинации HU и ТАК-779. Фиг.7 иллюстрирует, что HU синергически усиливает противовирусную активность антагониста CCR5 ТАК-779. Донорские РВМС культивировали в среде IL-2 в отсутствие или в присутствии HU (0 и 10 нМ). Через 7 дней клетки инфицировали ВИЧ-1 ADA. Инфицированные клетки культивировали в присутствии HU (в такой же концентрации как во время предварительной обработки) плюс различных концентраций ТАК-779 в диапазоне от 0,2 до 20 нМ). Продукцию вируса определяли через 7 дней после инфекции. Комбинация ТАК-779 и HU показала, что без HU и ТАК-779 величина р24 составляла приблизительно 5000 пикограмм/мл. Введение 10 нМ HU снизило уровни р24 приблизительно на 60%. Введение 2 нМ ТАК-779 снизило уровни р24 примерно на 20%. Однако комбинация 10 нМ HU и 2 нМ ТАК-779 вызвала общее снижение р24 приблизительно на 90%, указывая, таким образом, на то, что комбинация вызывала синергическое снижение уровней р24 и увеличивала активность антагониста CCR5 ТАК-779. Таким образом, эти результаты показывают синергическое увеличение активности антагониста CCR5.

Пример 8

Для определения эффекта HU на поверхностную экспрессию CCR5 на лимфоцитах от здоровых доноров свежие донорские РВМС культивировали в среде IL-2 в присутствии увеличивающихся концентраций HU (0, 50, 100 и 200 мкМ) в течение 10 дней. На 7-й и 10-й день поверхностную экспрессию CCR5 на CD4 и CD8 Т-лимфоцитах измеряли двойным окрашиванием антителами против CD4 и против CD8 в комбинации с mAb против CCR5 и анализом на FACS. Результаты на 7-й и 10-й день указали на то, что концентрации HU 50 мкМ осуществляли супрессию поверхностной экспрессии CCR5 на CD4 лимфоцитах у пяти тестированных доноров. При этом уровне транскрипции полуколичественный анализ RT-PCR РНК, выделенной из культур РВМС, обработанных HU, показал уменьшенные количества транскриптов CCR5 в присутствии препарата (верхняя полоса на фиг.8В). Анализ RT-PCR рибосомной 18S РНК показал одинаковое содержание РНК среди образцов, дающих сниженные уровни транскриптов CCR5 (нижняя полоса на фиг.8В).

Пример 9

В большинстве случаев было показано, что воздействия in vivo рапамицина на экспрессию хемокиновых рецепторов 5 (CCR5) и накопление хемокинов MIP-1 , MIP- и RANTES вследствие сниженного захвата клетками, представляющими сниженные уровни экспрессии корецептора CCR5 у добровольцев с хронической ВИЧ инфекцией ВИЧ-1, используют хемокиновый рецептор CCR5 в качестве корецептора для входа в макрофаги и лимфоциты CD4. Естественными лигандами для корецептора CCR5 являются белки, называемые -хемокинами. На моделях in vitro, обсужденных выше, было продемонстрировано, что рапамицин, а также другие агенты, действующие на фазу G1 клеточного цикла, включая гидроксимочевину, заметно уменьшали экспрессию поверхностных рецепторов CCR5, как показано на фиг.2В-С и 8А-В.

Для оценки активности экспрессии CCR5 и ее воздействий на уровни рецепторов CCR5 in vivo было проведено открытое, не рандомизированное испытание для доказательства концепции, в котором 8 добровольцам с установленной ВИЧ инфекцией после дозы насыщения 6 мг в течение 28 дней вводили 2 мг в день рапамицина. Периферическую кровь для определения уровней экспрессии CCR5 получали при контрольном посещении, на 7-й, 14-й и 28-й день введения рапамицина и на 42-й день (который наступал через 2 недели после последней дозы рапамицина). 8 индивидуумов были включены в исследование, и к настоящему времени 3 добровольца завершили исследование, и рапамицин был хорошо переносим.

На фиг.9 изображено изменение экспрессии CCR5, наблюдавшееся у ВИЧ инфицированных добровольцев во время этого испытания. У всех трех добровольцев было продемонстрировано уменьшение экспрессии CCR5 самое позднее к 28-му дню, которое было связано с применением RAPA. У добровольцев 001 и 006 отчетливо произошло почти немедленное снижение экспрессии CCR5, тогда как у добровольца 007 снижение произошло на более поздних сроках лечения. Таким образом, изменение клеточного цикла мононкулеарных клеток периферической крови средством, специфичным для G1, рапамицином, привело к уменьшению экспрессии РНК CCR5 у ВИЧ инфицированных добровольцев с установленной ВИЧ инфекцией, и это средство было хорошо переносимым.

Нацеливание RAPA на клеточный компонент, такой как CCR5, в отличие от нацеливания на сам вирус, предоставляет противовирусную стратегию, которая с меньшей вероятностью приведет к устойчивости вируса, поскольку ожидается, что клеточные компоненты будут мутировать под воздействием препарата. Исследования in vitro свидетельствуют о том, что RAPA должен быть более эффективным при борьбе с репликацией штаммов R5, чем штаммы Х4 ВИЧ-1. В этом отношении, большое значение имеет терапевтическое применение RAPA в виде лечения ранней стадии заболевания, вызванного ВИЧ-1 (перед появлением штаммов Х4), особенно в свете современных рекомендаций в поддержку отсроченного начала противоретровирусной терапии (Dybul, 2002). Кроме того, противовирусные свойства RAPA особенно важны в географических зонах, где присутствует подтип С ВИЧ-1, поскольку эти вирусы используют CCR5 в качестве основного корецептора (Bjornal, 1999). Распространенность инфекций подтипом С ВИЧ-1 выросла в течение последнего десятилетия, и в настоящее время они составляют преобладающий подтип во всем мире (Essex, M. (1999).

Более того, противовирусные свойства RAPA предоставляют новые возможности лечения для подавления отторжения аллотрансплантата у ВИЧ инфицированных индивидуумов, подвергающихся трансплантации солидных органов. Противовирусные свойства RAPA в сочетании с антиангиогенными свойствами (Guba, 2002) свидетельствуют о том, что RAPA предоставляет лучший выбор для пациентов с ВИЧ инфекцией, подвергающихся трансплантации органов.

Резюмируя, можно сказать, что способность RAPA осуществлять супрессию экспрессии корецепторов CCR5 и повышать внеклеточные уровни -хемокинов предоставляет новую стратегию с важными выводами для лечения и предотвращения инфекции ВИЧ-1. Комбинация RAPA и антагонистов CCR5 особенно эффективна при борьбе с репликацией вирусов у пациентов.