способ экспрессного сорбционно-цветометрического определения тетрациклина в моче

Формула изобретения

Способ экспрессного определения тетрациклина в моче, характеризующийся тем, что тетрациклин концентрируют путем нанесения пробы мочи, из которой удалены белки, на сорбент, представляющий собой силикагель, формируют на нем окрашенное соединение при участии хлорида железа (III) и K₄[Fe(CN)₆ ] с последующим определением тетрациклина по колористической тест-шкале.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к аналитической химии и касается количественного определения тетрациклина в моче человека и животных.

Тетрациклины - традиционные популярные антибиотики широкого спектра действия, применяемые в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности.

Тетрациклиновые антибиотики занимают также важное место среди средств хемиотерапии различных заболеваний и для создания методов диагностики при возникновении ряда заболеваний.

Это диктует необходимость определения наличия и концентрации тетрациклина в биологических объектах.

Известен фотометрический способ определения тетрациклина путем обработки анализируемой пробы раствором хлорамина и последующим фотометрированием полученного раствора [1].

Недостатками способа являются низкая чувствительность (0,05 мг/см³) и недостаточная селективность, т.к. невозможно проводить определение в окрашенных растворах и в присутствии других антибиотиков.

Известен также способ определения тетрациклина путем обработки анализируемой пробы раствором гидроксида натрия при рН 9-10,5 с последующим фотометрированием полученного раствора [2].

Недостатком данного способа является то, что в щелочной среде тетрациклин неустойчив. В зависимости от концентрации тетрациклина скорость деструкции будет настолько различной, что количественное определение с установленным доверительным интервалом на уровне 10% практически невозможно. Это означает, что в одной и той же пробе найденная концентрация тетрациклина может быть в 10 раз больше или в 10 раз меньше. Это обстоятельство является препятствием к применению данной методики.

Среди разработанных способов определения тетрациклина наиболее надежным является иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием спорообразующих тест-культур Bacillus subtilis вар L2 [3].

К достоинствам ИФА следует отнести высокую чувствительность и возможность учета результатов через несколько часов от момента начала исследования.

К недостаткам метода относятся сложность осуществления самого анализа, трудности оценки специфичности полученных результатов и высокая стоимость.

Целью изобретения является создание высокочувствительного экспресс-метода оценки содержания тетрациклина в моче.

Метод основан на формировании координационных соединений, в которых один и тот же элемент находится в виде ионов с различной степенью окисления. Известно, что такие координационные соединения обладают высокой поглотительной способностью в видимом диапазоне спектра.

Изобретение включает стадии: а) пробоподготовка - удаление из мочи белков, б) сорбция тетрациклина силикагелем КСМГ, в) формирование на сорбенте окрашенного соединения при участие тетрациклина и ионов железа в степенях окисления +3 и +2.

Следующий пример представлен для того, чтобы наиболее полно проиллюстрировать изобретение.

Пример 1. Первая стадия определения тетрациклина (ТЦ) в моче человека и животных включает пробоподготовку - удаление из мочи белков. Для этого в 10 см ³ отобранной мочи вносят 0,1 см³ 20% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), перемешивают 5 мин, центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. Центрифугат переносят в другую центрифужную пробирку.

Вторая стадия: сорбция тетрациклина. В полученный центрифугат вносят 0,2 г силикагеля КСМГ, перемешивают 20 мин, центрифугируют 5 мин и центрифугат отбрасывают. К сорбенту вносят 10 см³ 0,1 М уксусной кислоты, перемешивают, центрифугируют и центрифугат отбрасывают.

Третья стадия: формирование на сорбенте окрашенного соединения. К сорбенту после промывания вносят 0,1 см³ 10 ^-4 М раствора хлорида железа (III), доводят объем до 10 см³ 0,1 М раствором уксусной кислоты, перемешивают 10 мин, центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, осадок дважды промывают 10 см³ 0,1 М раствора уксусной кислоты. К осадку приливают 5 см³ 0,1 М раствора уксусной кислоты, 1 см³ 10 ^-2 М раствора K₄[Fe(CN) ₆], все тщательно перемешивают и через 20 мин определяют концентрацию ТЦ в пробе по тест-шкале, которую строят с ориентировкой на возможные концентрации ТЦ в моче.

Колористическая тест-шкала. В 10 центрифужных пробирок вносят 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 см³ 10 ^-3 М раствора ТЦ, по 5 см³ мочи, не содержащей ТЦ, по 0,1 см³ 20% ТХУ и доводят объемы растворов до 10 см³ 0,1 М раствором уксусной кислоты. Перемешивают 5 мин, центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, центрифугат переносят в другие центрифужные пробирки. В полученные центрифугаты вносят по 0,2 г силикагеля КСМГ, содержимое пробирок перемешивают 20 мин и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Центрифугат отбрасывают, а к осадкам добавляют по 0,1 см³ 10 ^-4 М раствора хлорида железа (III), доводят до 10 см ³ 0,1 М раствором уксусной кислоты, перемешивают 10 мин, центрифугируют, центрифугат отбрасывают, осадки дважды промывают 0,1 М раствором уксусной кислоты. К промытым осадкам приливают по 5 см³ 0,1 М раствора уксусной кислоты, по 1 см³ 10^-2 М К ₄[Fe(CN)₆], доводят объемы до 10 см³ 0,1 М раствором уксусной кислоты, все тщательно перемешивают и через 20 минут оценивают окраску силикагеля, которая меняется от бледно-голубой до зеленой см.чертеж. Окраска устойчива длительное время.

Результаты определения тетрациклина в моче методом «введено-найдено» по предлагаемой методике и методике сравнения представлены в таблице.

Результаты определения тетрациклина в моче (n=6, р=0,95, tp=2,57)
Внесено в мочу тетрациклина, мкг/см 3	Найдено, мкг/см 3
	Данным методом	С использованием метода сравнения*
0,00	-	-
0,25	0,25±0,02	0,20±0,03
0,5	0,50±0,05	0,45±0,05
1,0	1,00±0,01	0,95±0,09
1,5	1,50±0,10	1,45±0,10
2,0	2,00±0,20	2,00±0,30
2,5	2,50±0,30	2,40±0,30
5,0	5,00±0,50	4,50±0,50
7,5	7,5±0,80	7,0±0,90
10,0	10,0±1,00	10,0±1.50
*Методические указания МУК. 4.2.026-95

Следует отметить, что тест-шкала с образованием окрашенного соединения тетрациклина с хлоридом железа (III) и K₄ [Fe(CN)₆] на поверхности силикагеля КСМГ позволяет быстро оценить содержание тетрациклина в моче. В случае, если содержание тетрациклина не укладывается в шкалу, можно построить другую, для большего или меньшего интервала концентраций.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Соловей Н.В., Сааведра Н.Ф. Фотометрическое определение тетрациклина гидрохлорида. - Фармация, 1974, Т.23, №4, С.72-73.

2. Соболева О.Н. Способ определения тетрациклина: A.c. SU 1081487 A1; заявл. 1982.08.02; опубл. 1984.03.23.

3. Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах. Методические указания МУК 4.2.026-95, с.8.