штамм бактерий vibrio fischeri, используемый в качестве тест-культуры для определения токсичности объектов окружающей среды

Формула изобретения

Штамм бактерий Vibrio fischeri ВКПМ В-9579, используемый в качестве тест-культуры для определения токсичности объектов окружающей среды.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штаммам бактерий для биотестирования токсичности объектов окружающей среды, и может быть использовано при проведении эколого-токсических исследований, при мониторинге водных экосистем.

Известен штамм бактерий Ph. phosphoreum (Cohn) Ford, который рекомендован для биотестирования воды на территории Украины [1], [2].

Известный штамм при проведении тестирования используется в лиофилизированном виде, и требуется восстановление его активной формы. Кроме того, чувствительность данного штамма к токсическим веществам недостаточно высокая, в частности, известный штамм позволяет определить наличие токсических веществ в концентрациях, превышающих ПДК.

Известен выбранный в качестве прототипа бактериальный тест «Эколюм», разработанный в России (МГУ, Москва) [3]. Биосенсор «Эколюм» представляет собой лиофилизированные культуры генно-инженерного штамма люминесцентных бактерий, содержащиеся в среде инертных газов в специальных стеклянных флаконах. Культура получена посредством генно-инженерного внедрения lux-оперона в специально подобранный штамм Е.coli. Производится согласно ТУ 6-09-20-236-93, [3]. Используется для определения токсичности воды, почв [4], почв [5], химических соединений, полимеров, материалов и изделий [6].

Биотестирование основано на определении изменения интенсивности биолюминесценции биосенсора «Эколюм» при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем.

Недостатком известного штамма является недостаточно высокая чувствительность к токсическим веществам, в частности, к их наличию в концентрациях на уровне ПДК и ниже. Для тестирования используется лиофилизированная культура, которая находится в биологически неактивной форме и для перехода к активному физиологическому состоянию ей требуется время для прохождения нескольких делений клеток. Недостатком следует считать и высокую себестоимость производства биосенсора вследствие использования дорогостоящего процесса лиофилизации. Кроме того, препарат биосенсора поставляется лишь при условии изначального приобретения прибора экологического контроля «Биотоке-10М».

Целью данного изобретения является получение нового, доступного и дешевого штамма бактерий, характеризующегося высокой чувствительностью биолюминесценции к действию токсических веществ самой разнообразной химической природы.

Для достижения поставленной цели предложен штамм бактерий Vibrio fischeri ВКПМ В-9579, выделенный из воды Черного моря, отобранной в районе м.Б.Утриш (справка о депонировании прилагается).

Для выделения штамма биолюминесцентных бактерий из морской воды использовали метод мембранных фильтров. Бактерии концентрировали из анализируемой воды на мембранный фильтр и затем выращивали их на селективных средах для светящихся бактерий. Выделение биолюминесцентных бактерий проводили, визуально анализируя наличие биолюминесценции. При обнаружении люминесценции выделяли чистую культуру бактерий стандартными методами.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определении бактерий Bergey (Определитель бактерий Берджи. Т.1 / Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, С.Уильямса. - М.: Мир, 1997. - 432 с.; Краткий определитель бактерий Берги. Под ред. Дж. Хоулта. - М.: Мир, 1980. - 496 с.). Для окончательного установления вида штамма выполнена идентификация по генетическим характеристикам во ФГУП «ГосНИИГенетика», ВКПМ. Определение проводили по результатам анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК. По результатам проведенного анализа тестируемый штамм-микроорганизм относится к виду Vibrio fischeri (гомология 98%).

Данный штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками: культура представляет собой подвижные, грамотрицательные палочковидные клетки. Размер клеток в пределах (0,5-0,8)×(1,4-2,6) мкм.

Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах. На питательном агаре через 1 сутки роста при 20°С культура образует мелкие полупрозрачные колонии округлой формы. На питательном бульоне при 20°С через 1 сутки наблюдается помутнение среды, заметно образование тонкого пристеночного кольца, слабая пленка на поверхности среды. В полужидком агаре наблюдается гомогенный рост культуры.

Физиолого-биохимические признаки: факультативный анаэроб. Оксидазный тест положительный. Индол не образует. Катаболизирует глюкозу с образованием кислоты. Сбраживает мальтозу, D-маннозу. Уреазоотрицателен. Аргининдегидролаза отсутствует. Орнитиндекарбоксилаза отсутствует. Ацетилметилкарбинол не образует. Сероводород не образует. Цитрат не утилизирует. Оптимум роста 20-25°С, рН 7,2-7,4. Оптимальная концентрация NaCl 1,7-3%. Штамм не обладает токсичными и патогенными свойствами. Излучает свет, визуально регистрируемый в темноте.

Хранится штамм на питательном агаре с 1,7% NaCl, pH 7,2-7,4.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма:

- хранение бактерий в морозильной камере холодильника-рефрижератора при температуре -18°С в питательном бульоне с 1,7% NaCl, содержащем в качестве криопротектора стерильный глицерин;

- хранение бактерий в низкотемпературном холодильнике при температуре -60°С в питательном бульоне с 1,7% NaCl, содержащем в качестве криопротектора стерильный глицерин;

- замораживание клеток в жидком азоте в питательном бульоне с 1,7% NaCl, содержащем в качестве криопротектора стерильный глицерин;

- в герметично запаянных ампулах в лиофильно-высушенном состоянии.

Размножение культуры осуществляется путем пересева на питательный агар с 1,7% NaCl.

Применение на практике данного штамма обусловливается его физиолого-биохимическими особенностями. Штамм предназначен для биотестирования токсичности, так как характеризуется высокой чувствительностью биолюминесценции к действию широкого спектра токсикантов.

Пример 1.

Реализация использования штамма бактерий Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 в качестве тест-культуры для определения токсичности факторов среды химического происхождения была проведена на токсикантах ZnSO₄, CuSO₄, К ₂Cr₂О₇, додецилсульфат натрия (ДСН) и фенол.

Штамм выращивали на питательном агаре с 1,7% NaCl при температуре 20°С в течение 18 часов. Затем готовили суспензию ночной культуры светящихся бактерий, оптическая плотность которой составляла 0,1 ед. при длине волны 590 нм. Далее полученную суспензию разбавляли в сто раз. Суспензия бактерий готовилась таким образом, чтобы конечная концентрация NaCl составила 1,7%; глюкозы - 0,01% в 0,001 М трис - HCl буфере (рН 7,4).

Аликвоты этой культуры (900 мкл) переносили в стерильные пробирки и добавляли в них изучаемые вещества в объеме 100 мкл. Содержимое пробирок тщательно перемешивали. Пробирки оставляли при комнатной температуре (20°С) на 30 минут. В процессе инкубации пробирки несколько раз встряхивали. Измерение интенсивности биолюминесценции культур, содержащих анализируемые соединения, а также контрольных культур проводили на люминометре ЛТ-01. Результаты измерений интенсивности биолюминесценции представляли в условных единицах свечения (уес).

Оценку токсичности пробы проводили по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб. В качестве контроля использовали 1,7% раствор NaCl.

Для сравнительной оценки чувствительности использовали характеристику ЕС₅₀ (effective concentration) - концентрацию вещества, вызывающую 50%-ое снижение биолюминесценции бактериальной суспензии.

Полученные данные по чувствительности штаммов светящихся бактерий (средние значения ЕС₅₀ ) ко всем исследованным токсикантам представлены в таблице 1. В таблице также приводятся данные по чувствительности к этим же токсикантам lux-штамма Е.coli.

Таблица 1
Сравнение чувствительности биолюминесценции штаммов к исследованным токсическим веществам показало, что штамм Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 более чувствителен, чем lux-штамм E.coli (по средним значениям ЕС50).
Штамм	ЕС 50, мг/л
	ZnSO4	CuSO 4	ДСН	К 2Cr2O7	Фенол
Vibrio fischeri ВКПМ В-9579	2-3	1-1,5	150	10-50	125-150
E.coli	2-3	5-7,5	300	150	>300

Величина ЕС₅₀ для ZnSO₄·7Н ₂О у штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 лежит в диапазоне от 2 до 3 мг/л (концентрация цинка составляет от 0,452 до 0,679 мг/л), а концентрация ЕС₅₀ для CuSO ₄·5H₂O - в диапазоне от 1 до 1,5 мг/л (соответственно, концентрация меди составляет от 0,256 до 0,384 мг/л).

Величина ЕС₅₀ у штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 для бихромата калия находится в диапазоне концентраций от 10 до 50 мг/л.

Для фенола величина ЕС ₅₀ для штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 составила 125-150 мг.

За исключением ZnSO₄, по сравнению с lux-штаммом E.coli, штамм Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 более чувствителен к CuSO₄ (в 5 раз), ДСН (в 2 раза), К₂Cr₂О ₇ (в 5 раз), а также к фенолу (примерно в 2 раза).

Это свидетельствует о перспективности использования штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 для определения токсичности водных сред.

Пример 2.

Большой интерес представляет реакция светящихся бактерий на низкие концентрации загрязнителей, сопоставимые с уровнем ПДК и ниже, что позволяет использовать этот штамм, как тест-культуру при определении очень низких концентраций загрязнителей.

Были проведены измерения чувствительности биолюминесценции выделенных штаммов к действию токсических факторов химического происхождения в очень низкой концентрации. Использовались следующие токсиканты: ZnSO₄, CuSO ₄, К₂Cr₂О ₇, ДСН и фенол.

Тестирование токсичности проводили, как описывается в примере 1.

В таблице 2 представлены данные по чувствительности биолюминесценции Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 ко всем исследованным токсикантам в диапазоне концентраций от 0,00001 мг/л до 1,0 мг/л.

Как видно из таблицы, низкие концентрации токсикантов вызывают у Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 стабильную индукцию биолюминесценции.

Медь в концентрации 0,001-0,005 мг/л (ПДК меди - 0,005 мг/л для морской воды) повышает люминесценцию в пределах 36-42%.

Цинк в концентрации 0,001-0,01 мг/л (ПДК цинка - 0,05 мг/л для морской воды) повышает интенсивность биолюминесценции штамма в пределах 18-26%.

Стандартный токсикант, бихромат калия (ПДК 0,05 мг/л), в концентрации 0,001-0,01 мг/л повысил интенсивность биолюминесценции штамма примерно на 30%.

Аналогичное по эффективности влияние на биолюминесценцию штамма оказал додецилсульфат натрия (ПДК 0,5 мг/л), в концентрациях 0,00001-1,0 мг/л. Интенсивность люминесценции штамма увеличилась в среднем на 30% (концентрация 0,01-0,1 мг/л).

Как следует из таблицы 2, фенол в концентрациях 0,00001-1,0 мг/л в целом оказывал сходное влияние на интенсивность свечения Vibrio fischeri ВКПМ В-9579. Концентрация фенола в диапазоне 0,001-0,01 мг/л (ПДК фенола 0,001 мг/л) вызывает повышение интенсивности свечения штамма (от 27 до 39%, соответственно).

Следует отметить, что заметная индукция свечения штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 (на 30-40%) наблюдалась на уровне ПДК токсикантов [7], а также ниже ПДК (в 5-10 раз).

Полученные данные свидетельствует о высокой чувствительности штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 и перспективности его использования для определения токсичности компонентов водной среды.

Пример 3.

Были проведены эксперименты по использованию штамма бактерий Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 в качестве тест-культуры на токсичность нефтепродуктов.

Были апробированы нефть, дизельное топливо и подсланевая (льяльная) вода из машинного отделения судна в концентрациях от 0,001 мг/л до 1,0 г/л.

Тестирование токсичности проводили, как описывается в примере 1.

Полученные данные по чувствительности биолюминесценции штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 ко всем исследованным нефтепродуктам представлены в таблице 3. В таблице также приводятся данные по чувствительности биолюминесценции lux-штамма E.coli к тем же токсикантам.

Нефть, начиная с концентрации 0,01 мг/л, что значительно ниже ПДК нефти (0,05 мг/л), стимулировала свечение Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 на 63%, а в концентрации 0,1-0,01-10,0 мг/л увеличение интенсивности свечения достигало 106-113-86%. Льяльные воды, дизельное топливо также увеличивали свечение этого штамма (максимально - до 60-85%). Индукция свечения наблюдалась в широком диапазоне испытанных концентраций нефтепродуктов - от 0,01 до 250 мг/л.

Сравнение чувствительности штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 и lux-штамма E.coli свидетельствует о более высокой чувствительности штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 и перспективности его использования для определения токсичности компонентов среды морских водоемов.

Таблица 2
Название токсиканта	Контроль	Концентрация токсиканта, мг/л
		0,00001	0,0001	0,001	0,005	0,01	0,05	0,1	7
	Интенсивность биолюминесценции Vibrio fischeri ВКПМ-9579, уес
Медь	1,62	2,15	2,22	2,3	2,2	2,08	1,83	1,69	0,803
Цинк	0,444	0,495	0,519	0,526	0,540	0,559	0,500	0,520	0,385
К2Cr2O 7	0,430	0,512	0,545	0,562	0,575	0,557	0,553	0,544	0,552
Додецилсульфат натрия	0,444	0,512	0,518	0,530	0,548	0,550	0,586	0,576	0,562
Фенол	0,438	0,508	0,544	0,558	0,580	0,607	0,576	0,569	0,549

Таблица 3
Название нефтепродукта	Концентрация нефтепродукта, мг/л
	Контроль	0,001	0,01	0,1	1,0	10	100	250	500	1000
Интенсивность биолюминесценции штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579, уес
Нефть	0,30	0,44	0,49	0,62	0,64	0,56	0,56	0,41	0,38	0,36
Диз. топливо	0,34	0,45	0,52	0,52	0,63	0,55	0,54	0,42	0,37	0,36
Льяльная вода	0,31	0,40	0,45	0,46	0,48	0,53	0,54	0,39	0,34	0,30
Интенсивность биолюминесценции штамма E.coli, уес
Нефть	0,057	0,048	0,053	0,039	0,031	0,026	0,014
Диз. топливо	0,058	0,053	0,060	0,043	0,040	0,039	0,029
Льяльная вода	0,061	0,050	0,048	0,042	0,038	0,037	0,035

Пример 4.

Для определения токсичности природных проб с помощью штамма бактерий Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 были взяты образцы донных отложений морских водоемов. Один образец с высоким содержанием нефтепродуктов и тяжелых металлов был отобран в районе с высокой антропогенной нагрузкой на акватории одного из портов Азовского моря. Другой грунт для биотестирования с аналогичным гранулометрическим составом отобран в условно чистом морском лимане, изолированном от моря естественной галечной косой (в 5 км от м. Б.Утриш).

Для проведения тестирования экстракты грунтов готовились на воде.

Тестирование токсичности проводили, как описывается в примере 1.

В таблице 4 представлены результаты биотестирования токсичности усредненных проб грунтов, отобранных в морском лимане и на акватории порта.

Таблица 4
Район отбора донных отложений	Интенсивность биолюминесценции Vibrio fischeri ВКПМ В-9579, уес
	Контроль	Опыт	Отклонение от контроля, %
Лиман	1,62	2,1	29,6
Морской порт	2,0	2,89	44,5

Из таблицы 4 следует, что интенсивность биолюминесценции водного экстракта донных отложений из лимана превышала контрольный уровень на 29,6%, а интенсивность свечения пробы с экстрактом грунта из акватории морского порта - на 44,5%. Полученные данные свидетельствуют о чувствительности биолюминесценции штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 к действию токсикантов, присутствующих в донных отложениях морских водоемов.

Таким образом, тестирование токсичности одного из основных компонентов среды - донных отложений, продемонстрировало возможность использования предложенного штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 в качестве тест-культуры.

Литература

1. И.Ю.Малыгина, А.М.Кацев. Светящиеся бактерии Черного и Азовского морей. Экология моря. 2003. Вып.64.

2. КНД 211.1.4.060-97. Визначення токсичностi води на бактерiях Photobacterium phosphoreum (Cohn) Ford. - 21.05.97.

3. ТУ 6-09-20-236-93 (прототип).

4. МР №11-1/134-09. Определение общей токсичности почв по интенсивности биолюминесценции бактерий.

5. МР №11-1/131-09. Определение токсичности химических соединений, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста

6. МР №11-1/133-09. Методика экспрессного определения токсичности воды с помощью люминесцентного бактериального теста «Эколюм».

7. Перечень рыбохозяйственных нормативов: предельно допустимых концентраций (ПДК) и ориентировочно безопасных уровней воздействия (ОБУВ) вредных веществ для воды, водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение - М.: ВНИРО, 1999. - 304 С.