штамм вируса гриппа а/17/висконсин/05/84(н3n2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа, депонированный в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского под № 2413, используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики гриппа, вызванного эпидемическим штаммом вируса гриппа. Профилактику осуществляют интраназальной живой гриппозной вакциной (ЖГВ) из штамма вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus A А/17/Висконсин/05/84(Н3М2).

Применяемый до настоящего времени для профилактики гриппа среди взрослых и детей в составе тривалентной ЖГВ вакцинный штамм подтипа H3N2 А/17/Сидней/97/76 (Н3М2) [Патент РФ №2159812, БИ № 33, 27.11.2000] обладает необходимым составом генома 6:2, однако в настоящее время он утратил антигенную актуальность. Вследствие этого штамм не может создавать защиту во время эпидемии, вызванной новой антигенной разновидностью вируса гриппа A(H3N2).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма новой антигенной разновидности на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2) с использованием в качестве источника поверхностных антигенов эпидемического вируса А/Висконсин/67/2005 (Н3N2).

Вакцинный штамм А/17/Висконсин/05/84(Н3N2) получен методом классической генетической реассортации эпидемического вируса А/Висконсин/67/2005(Н3N2) с холодоадаптированным штаммом А/Ленинград/134/17/57(Н2N2) с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2N2).

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2N2) - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1986. - С.66-83]. Применяемые в настоящее время вакцинные штаммы ЖГВ получают методом реассортации современных эпидемических вирусов с холодоадаптированными (ХА) донорскими штаммами, в результате чего образуются реассортанты, имеющие смешанный геном. Гены, кодирующие гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно-актуального эпидемического штамма, а шесть генов внутренних и неструктурных белков (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS) - от безвредного ХА донора аттенуации.

Анализ генома полученного вакцинного штамма был выполнен при посредстве рестрикционного анализа ДНК-копий сегментов РНК, полученных с помощью полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР) [Klimov A.I. J.Virol. Method. - 1995. - №55. - Р.445-446]. Полученные с помощью ОТ-ПЦР ДНК-копии сегментов РВ2, РВ1, РА, NP, М и NS обрабатывали соответственно эндонуклеазами рестрикции Tru9l, Hindlll, BamHI, Asnl, EcoRI, Pvul, Ncil. Дополнительно копии сегментов РВ1, PA и М были обработаны рестриктазами BstXI, Asnl BciVI. Было показано, что сайты рестрикции в положениях нуклеотидной цепи, характерные для донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2), присутствуют в генах РВ2 (1459), РА (107 и 1045), NP(1066) и М(68 и 969). В то же время утрачены сайты рестрикции в генах РВ1(819 и 975) и NS(798), что также характерно для донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2). Таким образом, показано, что реассортант унаследовал 6 генов негликозилированных белков от донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2). Обработка ДНК-копии сегмента NA рестриктазой Sphl показала, что у реассортанта отсутствует сайт рестрикции в положении 78 нуклеотидной цепи, что свидетельствует о наследовании данного гена от эпидемического вируса A/Висконсин/67/2005(H3N2).

Принадлежность гемагглютинина родительскому эпидемическому вирусу A/Висконсин/67/2005(H3N2) подтверждена в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). РТГА проводили в 96-луночных планшетах для иммунологических реакций, в которые вносили последовательные падающие разведения иммунных антисывороток с шагом 2, соответствующие антигены в стандартной дозе (4 агглютинирующие единицы) и 1% взвесь эритроцитов кур. Титр антигемагглютинирующих антител выражали как величину, обратную наибольшему разведению сыворотки, при котором наблюдалось торможение агглютинации. Показано, что вакцинный кандидат А/17/Висконсин/05/84(Н3N2) антигенно идентичен родительскому эпидемическому штамму. Таким образом было подтверждено, что реассортант А/17/Висконсин/05/84(Н3N2) имеет формулу генома 6:2.

Для определения инфекционной активности делали ряд падающих десятикратных разведений исследуемого вирусного материала, зараженные РКЭ инкубировали при оптимальной (34°С), пониженной до 25°С или повышенной до 40°С температуре. К числу температурочувствительных (имеющих ts фенотип) относили вирусы, которые репродуцировались при повышенной температуре по сравнению с оптимальной с разностью в 5,0-6,0 lg ЭИД ₅₀ и более. Если разница титров при оптимальной и пониженной до 25°С температуре не превышала 3,0-3,5 lg EID ₅₀, вирусы относили к ХА группе. Было показано, что штамм А/17/Висконсин/05/84(Н3N2) является температурочувствительным (разность титров при 33°С и 39°С - 8,3 lgЭИД ₅₀/мл) и холодоадаптированным (разность титров при 33°С и 25°С - 3,0 lgЭИД₅₀/мл).

Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/Висконсин/05/84(Н3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму - антигенной специфичностью гемагглютинина эпидемического вируса А/Висконсин/67/2005(Н3N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов (6:2), температурочувствительностью, холодоадаптированностью, что коррелирует с безвредностью для человека, характерной для донора аттенуации. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского под №2413.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

Характеристика полученного штамма.

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33°С в течение 48 часов - 8,3 lg ЭИД ₅₀/ мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:256.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз). Характеристики штамма отражены в паспорте на вакцинный штамм А/17/Висконсин/05/84(Н3N2).

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма - А/17/Висконсин/05/84(Н3N2).

2. Серия - серия 1.

3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:

а) эпидемический вирус - А/Висконсин/67/2005(Н3N2);

б) донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2N2).

4. Количество пассажей - 7 в процессе рекомбинации.

5. Характеристика штамма до лиофилизации:

а) оптимальные условия репродукции - 33°, 48 часов;

б) гемагглютинирующая активность 1:256;

в) инфекционная активность 8,3 lg ЭИД ₅₀/ мл;

г) чувствительность к ингибиторам: ингибиторорезистентный;

д) разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 39°С - 8,3 lgЭИД₅₀/ мл;

е) разность в показателях инфекционной активности при 33°C и 25°С - 3,0 lgЭИД₅₀/ мл;

ж) структура генома реассортанта:

- гены от эпидемического вируса НА, NA;

- гены от донора аттенуации - РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS

6. Характеристика штамма после лиофилизации:

а) дата лиофилизации: 22.05.2006;

б) объем материала в ампуле: 1 мл;

в) количество доз в ампуле: 2;

г) инфекционная активность - 7.3 lg ЭИД₅₀/ мл;

д) гемагглютинируюшая активность -1:64.

7. Рекомендуемое разведение при вакцинации 1:2.

8. Антигенная специфичность:

а) гемагглютинина - идентичен вирусу А/Висконсин/67/2005(Н3N2) по данным РТГА с крысиной антисывороткой;

б) нейраминидазы - идентична вирусу А/Висконсин/67/2005(Н3N2) по данным ПЦР-рестриктазного анализа ДНК-копий генов.

9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении - безвреден.

10. Бактериологический контроль лиофилизированного материала: дата проведения - 29.05.2006 - стерилен.

11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.

Штамм А/17/Висконсин/05/84(Н3N2) ареактогенен при интраназальном введении для взрослых и детей 6-12 лет, что проверено на волонтерах.

Пример 1. При вакцинации 50-ти взрослых лиц интраназально рекомбинантным вакцинным штаммом А/17/Висконсин/05/84(Н3N2) с инфекционной активностью 7,3 lg ЭИД₅₀/мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С и средних реакций с кратковременным повышением температуры в диапазоне 37,6-38,5°С не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°С) наблюдались у одного привитого (1,96%) и у двух человек из группы плацебо (3,85%) (Табл.1). Таким образом, вакцинный штамм А/17/Висконсин/05/84(Н3N2) удовлетворяет требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам ЖГВ Приказом Минздрава РФ №156/29.

Таблица 1
Препарат	Число лиц	Температурные реакции
		37,1-37,5	37,6-38,5	>=38,6
ЖГВ	51	1 (1,96%)	0	0
Плацебо	52	2 (3,85%)	0	0

Пример 2. При вакцинации 50-ти детей 6-12 лет интраназально рекомбинантным вакцинным штаммом А/17/Висконсин/05/84(Н3N2) с инфекционной активностью 7,3 lg ЭИД₅₀ /мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С не наблюдалась. В одном случае отмечено развитие средней реакции в виде кратковременного повышения температуры до 37,6°С. Число слабых температурных реакций (до 37,5°С) составило 2 (4%). Катаральные явления наблюдались у 6 привитых (12%). В группе из 33 человек, получивших плацебо, слабые температурные реакции наблюдались у 2-х детей (6,1%), катаральные явления развились у 2-х детей (6,1%) (Табл.2). Показатель реактогенности, оцениваемый по развитию средних и тяжелых температурных реакций, составил 2%. Таким образом, вакцинный штамм А/17/Висконсин/05/84(Н3N2) удовлетворяет требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам ЖГВ фармакопейной статьей ФСП 42-0417, позволяющей использовать штамм для приготовления вакцины для взрослых и детей.

Таблица 2
Препарат	Число лиц	Температурные реакции			Катаральные явления
		37,1-37,5	37,6-38,5	>=38,6
ЖГВ	50	2 (4%)	1 (2%)	0	6 (12,0%)
Плацебо	33	2 (6,1%)	0	0	2 (6,1%)