препарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов

Формула изобретения

Препарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, включающий наполнитель и нефтеразрушающие микроорганизмы, отличающийся тем, что в качестве нефтеразрушающих микроорганизмов он содержит ассоциацию четырех штаммов: Saccharomyces sp. ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» № Y-1036, Bacillus sp. KKM ГНЦ ВБ «Вектор» № В-1040, Bacillus sp. ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» № В-1039, Enterobacter sp. ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» № В-1038 в виде смеси их равных объемов с содержанием каждого компонента не менее 2×10¹² микробных тел/мл, а в качестве наполнителя он содержит смесь равных количеств сахарозы, желатина и агарозы при следующем соотношении компонентов, мас.%:

ассоциация четырех штаммов:

Saccharomyces sp. ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» № Y-1036,
Bacillus sp.KKM ГНЦ ВБ «Вектор» № В-1040,
Bacillus sp. ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» № В-1039,
Enterobacter sp. ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» № В-1038	40-60
смесь сахарозы, желатина и агарозы	Остальное

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к средствам борьбы при помощи микроорганизмов с загрязнением окружающей среды нефтью и нефтепродуктами, и может быть использовано для ликвидации последствий нефтяных разливов.

Известны препараты для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, содержащие органический субстрат в виде целлюлозного носителя, покрытого слоем сорбирующего вещества, бактерии из рода Micobakterium и Rhodococcus, тиомочевину и сахарозу (патент РФ №2191753, С02F 3/34 В09С 1/10, опубл. 27.10.2002 г.).

Недостатком известных препаратов является то, что органический носитель и сорбирующее вещество не обладают сорбирующей способностью по отношению к нефти и требуют дополнительных минеральных добавок для жизнедеятельности бактерий.

Известен также препарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, включающий наполнитель, нефтеразрушающие микроорганизмы в виде штаммов грибов Aspergillius niger S-1 и сахарозу (патент РФ №2280013 С02F 3/34, опубл. 20.07.2006 г.).

Недостатком этого препарата является невысокая активность наполнителя и микроорганизмов вследствие малых концентраций в исходном продукте и невозможность использования при низких температурах окружающей среды вследствие наличия в нем воды.

Наиболее близким техническим решением является препарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, включающий консорциум из двух бактериальных штаммов Acinetobacher oleovorum ЦМПМ В - 1878 и ВКПМ У - 4091 в питательной среде (Патент РФ №2038333 МПК С02F 3/34, опубл. 27.06.2005 г. - прототип).

Недостатком известного препарата является узкие диапазоны температуры (от 16°С) и pH (от 5 ед. pH) очищаемой от нефти среды, при которых он работает, и невысокая эффективность его применения.

Задачей настоящего изобретения является расширение области применения препарата и интенсификация процессов микробиологической деструкции нефтяных углеводородов за счет коммуникативного эффекта воздействия предложенных штаммов микроорганизмов.

Техническая сущность изобретения (препарат «Биоойл-Югра») заключается в том, что в известном препарате для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, включающем наполнитель, нефтеразрушающие микроорганизмы и сахарозу, в качестве нефтеразрушающих микроорганизмов используют ассоциацию четырех биологических штаммов в виде смеси их равных объемов не менее 2×10¹² микробных тел каждый компонент, а в качестве наполнителя - смесь равных количеств сахарозы, желатина и агарозы при следующем содержании компонентов, мас.%:

ассоциация штаммов (Saccharomyces sp.(DHl), Bacillus sp.(5a). Bacillus sp.(5b), En-terobacter sp.(16a) - 40-60;

смесь сахарозы, желатина и агарозы - остальное.

На предлагаемых чертежах показаны сравнительные диапазоны действия заявляемого препарата и консорциума по прототипу: на фиг.1 - температурные пределы; на фиг.2 - пределы pH; на фиг.3 - результаты опытных испытаний.

На фиг.1 представлен график изменения средней температуры почвы на глубине 10 см в период с мая по сентябрь для Ханты-Мансийского автономного округа - Югры, являющегося основным производителем российской нефти. На графике выделены зоны действия прототипа и предлагаемого препарата. Прототип работает при температуре почвы только выше 16°С. Это ограниченный период времени, начиная с середины июня до конца августа. Предлагаемый препарат работает при температуре от 4°С и выше. Это значительно более широкий (в 2 раза) временной промежуток, с июня по сентябрь.

Предлагаемый препарат представляет собой специально подобранную ассоциацию из четырех штаммов, которые обладают коммуникативным эффектом, при котором продукты жизнедеятельности одних из них являются катализатором жизнедеятельности других. Это дополнительно на 25-30% увеличивает количество деструктированной ими нефти. Если принять, что каждый штамм в отдельности переработает 1 условную единицу нефти, то предложенная ассоциация из четырех штаммов переработает 4 усл. ед. нефти плюс 1 усл. ед. (25% от 4 усл. ед.), итого 5 усл. ед. нефти, тогда как при равных условиях прототип, представляющий собой консорциум из двух штаммов, переработает только 2 усл. ед. нефти, т.е. эффективность предложенного препарата в 2,5 выше (5/2=2,5).

Прототип работает для очистки от нефти почв только с pH большей 5 ед. pH, тогда как в Ханты-Мансийском автономном округе присутствуют почвы с pH ниже 5 вплоть до 3,5 ед. pH. Предлагаемый препарат работает в более широком диапазоне pH, что демонстрирует фиг.2.

На фиг.3 представлены данные после обработки заявляемым препаратом «Биоойл-Югра» сырой нефти и почвы, загрязненной сырой нефтью. На графиках показано количество предельных углеводородов в сырой нефти и в образцах обработанной и необработанной загрязненной почвы. В сырой нефти присутствуют бензиновые и керосиновые летучие фракции до С10, а в почве их нет.

Технология биодеградации нефти и нефтепродуктов с помощью препарата «Биоойл-Югра» выгодно отличается от ныне применяемых химических, физических способов и их различных сочетаний относительно небольшими капиталовложениями, низким энергопотреблением, отсутствием вторичных отходов, сохранением естественных микроландшафтов, способностью к самоподдерживанию и саморегуляции, экологической безопасностью.

Характеристика штаммов микроорганизмов-деструкторов

Штамм бактерий Bacillus species 5а депонирован в коллекции НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» под №В-1040.

Таблица 1
Морфологические и биохимические характеристики штамма бактерий Bacillus species 5a
Показатели хар-ки	Описание характеристики штамма
Морфология колоний	Колонии белесые, непрозрачные, матовые. край ровный или мелкосфестончатый.
Морфология клеток	Подвижные, удлиненные, часто волнисты или изогнутые до тора палочки, размером 10×15-50 мкм по 1-2 редко в коротких це-
Окраска по грамму	Гр+
Реакция с КОН	Отрицательная
Споруляция на РПА (или РПА с Мп)	эндоспоры терминальные, овальные, близки к круглым, вздутые
Каталаза	+
Оксид аза	+
Восстановление нитратов	-
Арабиноза	-
Дулышт	.
Глюкоза	-
Лактоза	-
Сахароза	-
Манит
Цитрат	-
MR	-
FP	-
Индол	-
H 2S	-
Пенициллин	Рсs
Тетрациклин	Tcs
Стрептомицин	Str»
Рифампицин	Rf 5
Гентамицин	Gms
Отношение к O2	Аэроб
Желатин	-
Гемолиз	-
Плазмокоагуляция	-
Гидролиз эскулина	-
лизина	-+
орнитина	-+
аргинина	-+
К - образование кислоты; Г - образование газа; R - устойчивость; S - чувствительность

Штамм бактерии Bacillus species 5b получен из почвенного образца путем высева на мясопептонном агаре. Штамм относится к психрофильным бактериям-аэробам, образуют эндоспоры. Температура культивирования в ассоциации при нефтедеструкции 4-6°С.

Культурально-морфологические особенности штамма.

Колонии белесые, непрозрачные, матовые, край ровный или мелкофестончатый, центр плоский, диаметр до 3,5 мм. Клетки очень подвижные, по 1-2, удлиненные палочки, размером 1,0×1,5-3,0 мкм. Эндоспоры терминальные, овальные, близки к круглым, вздутые.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма.

Периодические пересевы 1 раз в 6 месяцев на рыбно-пептонном агаре с инкубацией при 25°С до споруляции с последующим хранением при 4°С.

Способ, условия и состав сред для размножения.

Культивирование при 25°С на питательных средах: мясопептонный агар (бульон) или рыбопептонный агар. Штамм не обладает гемолизной и плазмокоагулнрующей способностью, активно катаболизирует длинноцепочечные предельные углеводороды.

Штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным и не представляет опасности при работе с ним. Штамм бактерий Bacillus species 5b депонирован в коллекции НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» под № В-1039.

Таблица 2
Морфологические и биохимические характеристики штамма Bacillus species 5b
Показатели хар-ки	Описание характеристики штамма
Морфология колоний	Колонии белесые, непрозрачные, матовые, край ровный или мелкоАестончатый- ттентр плоский.
Морфология клеток	Подвижные, удлиненные палочки, размером 1,0 х 1,5-3,0 мкм; по 1-2, редко в коротких цепочках
Окраска по грамму	Гр+
Реакция с КОН	Отрицательная
Споруляция на РПА (или РПА сМп»	эндоспоры терминальные, овальные, близки к круглым, взлутые
Каталаза	+
Оксидаза	4-
Восстановление нитратов	-
Арабиноза	-
Дульцит	-
Глюкоза	-
Лактоза
Сахароза	-
Манит	-
Цитрат	-
и MR	-
FP	-
Индол	-
H, S	-
Пенициллин	Рс s
Тетрациклин	Tcs
Стрептомицин	Str*
Рифампицин	Ri*
Гентамицин	Cm*
Отношение к О2	Аэроб
Желатин	-
Гемолиз	-
Плазмокоагуляция	-
Гидролиз эскулина	-
лизина	-
орнитина	-
аргинина	-+
Среда Эндо	Роста нет
Таксономическая принадлежность	Bacillus species
К - образование кислоты; Г - образование газа; R - устойчивость; S - чувствительность

Штамм бактерий Enterobacter species 16a получен из почвенного образца путем высева на мясопептонном агаре. Штамм относится к мезофильным бактериям. Температура культивирования в ассоциации при нефтедеструкции 20-22°С.

Культурально-морфологические особенности штамма.

Колонии матовые, уплощенные, полупрозрачные, не окрашены, диаметр до 2-х мм. Клетки мелкие, палочки, подвижные, размер 0,5×1,0-2,0 мкм. Споруляция отсутствует.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма.

Периодические пересевы 1 раз в 6 месяцев на мясопептонном агаре с инкубацией при 25°С с последующим хранением при 4°С.

Способ, условия и состав сред для размножения.

Культивирование при 25°С на питательных средах: мясопептонный агар (бульон) и рыбо-пептонный агар. Штамм не обладает гемолизной и плазмокоагулирующей способностью, активно катаболизирует длинноцепочечные предельные углеводороды. Штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным и не представляет опасности при работе с ним.

Штамм бактерий Enterobacter species 16а депонирован в коллекции НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» под № В-1038.

Таблица 3
Морфологические и биохимические характеристики штамма Enterobacter species 16а
Показатели хар-ки	Описание характеристики штамма
Морфология колоний	Колонии матовые, уплощенные, полупрозрачные. не окрашены, диаметр до 2-х мм
Морфология клеток	Мелкие палочки, подвижные, размер 0,5×1,0-2,0 мкм
Окраска по грамму	Гр-
Реакция с КОН	Положительная
Споруляция на РПА (или РПА с Мп)	Отсутствует
Кататаза	+
Оксидаза	-
Восстановление нитра-	+
Арабиноза	КГ
Дульцит	-
Глюкоза	КГ
Лактоза	кг
Сахароза	-
Манит	кг
Цитрат	+
MR	+
FP	-+
Индол	-
H,S	-
Пенициллин	Рск
Тетрациклин	Tc*
Стрептомицин	StrK
Рифампицин	Rf«
Рентам и цин	GmK
Отношение к O:	Фак. Анаэроб
Желатин	-
Гемолиз	-
Плазмокоагуляция	-
Гидролиз эскулина	-
лизина	+ (краен.)
орнитина	+ (краен.)
аргинина	+ (краен.)
Среда Эндо	Темно розовые колонии со слабым метал-
Таксономическая принадлежность	Enterobacter species
К - образование кислоты Г - образование газа R - устойчивость S - чувствительность

Штамм дрожжей Saccharomyces species DH1 получен из почвенного образца путем высева на мясопептонном агаре. Штамм относится к мезофильным аэробам. Температура культивирования в ассоциации при нефтедеструкции 20-22°С.

Культурально-морфологические особенности штамма. Колонии пастообразные, кремоватые. непрозрачные, круглые, матовые, край ровный, выпуклые: водорастворимые пигменты отсутствует. Эукариот. Клетки округлые или несколько удлиненные. Вегетативное размножение-почкованием. Истинный и псевдомицелии отсутствует. Не образует хла-мидоспор и баллистоспор. Образование асков непосредственно из вегетативных клеток.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма.

Периодические пересевы 1 раз в 6 месяцев на мясопептонном агаре с инкубацией при 25°С с последующим хранением при 4°С.

Способ, условия и состав сред для размножения.

Культивирование при 25°С на питательных средах: мясопептонный агар (бульон) и рыбопептонный агар.

Штамм не обладает гемолизной и плазмокоагулирующей способностью, активно ка-таболизирует длинноцепочечные предельные углеводороды. Штамм Saccharomyces species DH1 депонирован в коллекции НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» под № Y-1036.

Таблица 4
Морфологические и биохимические характеристики шта.мма дрожжей Saccharomyces species DH-1
Показатели хар-ки	Описание характеристики штамма
Морфология колоний	Колонии пастообразные, кремоватые, непрозрачные, круглые, матовые, край ровный, выпуклые; водорастворимые пигменты отсутствуют
Морфология клеток	Эукариот. Клетки округлые или несколько удлиненные. Вегетативное размножение - почкованием. Истинный и псевдомицелий отсутствуют. Не образует хламидоспор и баллистоспор. Образование асков непосредственно из вегетативных клеток
Восстановление нит-	-
Глюкоза	+
Сахароза	+
Манит	+
Мальтоза	+
Гемолиз
Плазмокоагуляция	-
Таксономическая принадлежность	Saccharomyces species

Методика получения ассоциации штаммов микроорганизмов-деструкторов, используемых для очистки почв, почвогрунтов и вод от нефтяных загрязнений.

Все штаммы микроорганизмов культивируют отдельно. Посевная доза материала составляет 5 мл микробной массы с концентрацией 1×10 на 400 мл питательной среды (МБП 2/3+картофельный бульон 1/3). Температура культивирования для части штаммов (мезофиллы) 20-22°С. Температура культивирования для части штаммов (психрофилы) 4-6°С. Промышленная наработка проходит в тех же условиях, с последующей концентрацией микроорганизмов путем центрифугирования и слива надосадочной жидкости. Время культивирования 3 суток, конечный титр биомассы 108-109 микробных тел на 1 мл с последующим концентрированием (штаммы Bacillus spec. 5a и Bacillus spec. 5б до данной процедуры подвергались выдерживанию при низкой температуре 4°С).

Смешение штаммов в ассоциацию происходит в равных соотношениях только после лиофильной сушки. Каждый штамм испытывался на способность деструктировать предельные углеводороды (нефть). Каждый обладал такой активностью, как видно из паспортных данных. Однако их смесь дает значительно больший эффект.

Ассоциация содержит штаммы микроорганизмов-деструкторов, находящиеся в равных соотношениях в лиофильно высушенном виде:

штамм Saccharomyces sp. DH1 не менее 2×10¹² микробных тел;

штамм Bacillus sp. 5a не менее 2×10 ¹² микробных тел;

штамм Bacillus sp. 5b не менее 2×10¹² микробных тел;

штамм Enterobacter sp. 16а не менее 2×10¹² микробных тел.

Для получения препаративной формы на основе заявленной ассоциации микроорганизмов производят смешивание лиофильно высушенной ассоциации штаммов микроорганизмов со стабилизирующей добавкой и наполнителем (смесь желатина, сахарозы и агарозы в соотношении 1:1:1). Готовый препарат фасуют во флаконы по три грамма в 10 миллилитровые флаконы, закрывают резиновой пробкой и обвальцовывают алюминиевым колпачком.

Расконсервацию производят простым растворением в дехлорированной воде.

Пример. Все участки по результатам определения содержания нефтепродуктов в образцах почвы, отобранных в соответствии с ГОСТ 17.4.4.02-84 до начала проведения биологической рекультивации, были разделены в следующие группы:

1 - участки с содержанием нефтепродуктов до 20%,

2 - участки с содержанием нефтепродукторов в пределах 21-40%,

3 - участки с содержанием нефтепродукторов в пределах 41-60%,

4 - участки с содержанием нефтепродукторов более 60%.

Проведение работ по биологической рекультивации состояло из нескольких этапов. На первом этапе проводилось внесение водного раствора микроорганизмов - деструкторов нефти (препарат «Биоойл-Югра») и азотных удобрений (карбамид в дозе 100 кг/га) методом дождевания. Через 10-15 суток проводилось повторное внесение препарата и удобрения. Третий этап выполнялся только на необводненных участках и включал в себя проведение агротехнических мероприятий (рыхление ручным мотокультиватором) и посев многолетних трав и овса.

Все участки, на которых была проведена биологическая рекультивация, были обследованы на наличие нефти и нефтепродуктов два раза: до начала проведения работ (июнь) и после их окончания (август).

Результаты анализа содержания остаточной нефти в исследуемом грунте после окончания работ по биологической рекультивации показали среднюю степень деструкции нефти от 8,01% до 19,93% в 2005 году и от 7,96% до 31,08% в 2006 году. Максимальная степень деструкции нефти составила в 2005 году 36,83%, а в 2006 году - 57,9%. Необходимо отметить, что в 2006 году наблюдалось более выраженное уменьшение содержания нефтепродуктов в образцах почвы после проведения рекультивации.

Из данных таблиц 5 и 6 видно, что средние значения содержания нефтепродуктов в образцах почвы до проведения рекультивации в разделенных группах участков, обрабатываемых в 2005 и 2006 гг., приблизительно равны. Наблюдаются значительные отличия по содержанию нефтепродуктов после проведения рекультивации в группах участков №2, 3, 4 в 2005 и 2006 гг. Возможно это связано с более умеренными температурами лета 2006 года в сравнении с жарким летом 2005 года.

Результаты двух лет работ показывают, что препарат «Биоойл-Югра» эффективен для разливов нефти, произошедших от одного месяца до полутора лет назад. Разливы с более ранними сроками требуют, как правило, обработку в течение двух летних сезонов.

Таблица 5
Содержание нефти и нефтепродуктов в образцах почвы, 2005 год
Группа, содержание нефти		Кол-во участков в группе	Содержание нефтепродуктов в образцах почвы, %
			до проведения рекультивации	после проведения рекультивации
1	<20%	11	15,81±3,85	7,80±3,22
2	21-40%	31	30,92±6,28	18,23±5,74
3	41-60%	16	48,38±5,78	35,03±7,34
4	>60%	4	73,98±4,33	54,05±12,57

Таблица 6
Содержание нефти и нефтепродуктов в образцах почвы, 2006 год
Группа, содержание нефти г		Кол-во участков в группе	Содержание нефтепродуктов в образцах почвы, %
			до проведения рекультивации	после проведения рекультивации
1	<20%	39	15,94±2,82	7,98±3,17
2	21-40%	34	27,98±5,48	9,91±4,63
3	41-60%	9	49,38±5,02	19,51±13,05
4	>60%	5	71,84±7,87	40,76±18,95

ВЫВОДЫ:

1. Препарат «Биоойл-Югра» предназначен для очистки почв и вод от нефтяных загрязнений для применения на территории с низкими среднесуточными температурами со сглаженной амплитудой их колебания в течение суток.

2. Препарат «Биоойл-Югра» эффективно работает в диапазоне температур от 4°С и кислотности от pH=3,5 ед. pH (см. фиг.1-2).

3. При обработке препаратом «Биоойл-Югра» загрязненной почвы в полевых условиях (территория деятельности ОАО «Сургутнефтегаз», ХМАО) наблюдается значительное снижение концентрации нефти (в частности, предельных углеводородов, составляющих основное содержание нефти). Наблюдается снижение всех углеводородов как короткоцепочечных, так и длинноцепочечных (наибольшее снижение наблюдается при длине цепи с С24 до С35). Таким образом, при обработке препаратом «Биоойл-Югра» наблюдается снижение в 4,5 раза общего содержания нефти в 10 см слое почвы в полевых условиях за сезон (2,5 месяца).

Проведена оценка нефтедеструктирующих свойств препарата «Биоойл-Югра» и в лабораторных условиях. При обработке загрязненной воды (10% нефти) препаратом при температуре культивирования 15°С за 10 дней было утилизировано около 2/3 внесенной нефти.

Таблица 7
Сравнительная характеристика биодеградации нефти ассоциациями микроорганизмов в почве
Образец	Количество внесенной нефти (г/кг почвы)	Количество остаточной нефти через 60 суток (г/кг почвы)	Степень утилизации (%)
Контроль	18,8	11,6	38,3%
Деворойл	18,8	8,9	52,7%
МИА-74	18,8	3,7	80,3%
Контроль	100	78,6	21,4%
Консорциум по прототипу (патент РФ №2038333	100	36,6	63,4%
Предлагаемая ассоциация	100	10	90

ТЕХНИКО-ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ИЛИ ИНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ

1. Улучшение экологической обстановки в районах интенсивной добычи нефти.

2. Повышенная производительность очищающей способности ассоциации штаммов благодаря коммуникативному эффекту.

3. Препарат «Биоойл-Югра» применим в широком диапазоне температур и pH.