способ получения препаратов метафазных хромосом сельскохозяйственной птицы

Формула изобретения

Способ получения препаратов метафазных хромосом сельскохозяйственной птицы, включающий отбор проб крови и культивирование ее с митогеном, отличающийся тем, что в качестве митогена используют 0,1%-ный раствор конканавалина А (СоА) в дозе 20 мкг митогена на 1 мл культуры лимфоцитов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии, в частности к цитогенетике сельскохозяйственной птицы.

Известен способ получения препаратов хромосом птиц из клеток костного мозга [Гольдман И.Л., Добриянов Д.С., Карликов Д.В., Живалев И.К. Цитогенетическая лаборатория для исследования хромосом животных и птицы. // Вестник с.-х. науки, 1970, №3, с.96-100]. В данном случае колхицин, используемый для накопления митозов, вводят внутрибрюшинно, после чего производят забой птицы и отбор проб костного мозга, из которого делают мазки и используют для дальнейшего анализа. Однако необходимость забоя птицы делает невозможным прижизненную оценку кариотипа.

Известен способ получения препаратов хромосом птицы из культуры эмбриональных фибробластов [Трофимова Л.В. Особенности получения препаратов хромосом птиц / Методические рекомендации «Исследование хромосом сельскохозяйственных животных» - Л., 1976, с.47-56]. Колхицин вводят в полученную культуру эмбриональных фибробластов птицы. Недостатком данного метода является необходимость забоя птицы, а также потребность в дорогостоящем оборудовании для культивирования клеток.

Известен способ получения препаратов хромосом кур из лимфоцитов периферической крови, взятый в качестве прототипа. [Shoffner R.N., Awtar Kroshan, Haiden G.J. et al. Avion Chromosome Methodology //Poultry Science. -1967. - V.46. - P.334-338]. Данный метод основан на получении препаратов из стимулированных митогенами клеток белой крови. Он позволяет получать препараты митотических хромосом из культуры периферических лимфоцитов при прижизненном взятии материала. Однако у домашней птицы использование в качестве митогена фитогемагглютинина (ФГА) для получения препаратов хромосом характеризуется низкой эффективностью и относительно высокими материальными затратами.

Задача изобретения - удешевление способа и повышение выхода митотических клеток, пригодных для анализа.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ получения митотических препаратов хромосом птицы, включающий инкубацию лимфоцитов с митогеном, особенностью которого является то, что в качестве стимулятора клеточных делений используют 0,1% раствор конканавалина А (СоА) в дозе 20 мкг митогена на 1 мл культуры лимфоцитов.

Пример. Взятие крови у птицы осуществляют из крыльевой вены с помощью стерильного одноразового шприца, смоченного гепарином. Ввиду того, что эритроциты птиц содержат ядра, которые создают сильный митотически инертный фон, в значительной мере затрудняющий поиск метафаз, для постановки культуры используют не цельную кровь, а плазму с лейкоцитами. Для получения плазмы кровь выдерживают 2-3 часа в холодильнике при 4°С, либо в случае необходимости кровь центрифугируют при 500-700 об/мин в течение 10 минут.

Плазму с лейкоцитами в количестве 2 мл помещают в стерильные пластиковые флаконы, содержащие 8 мл среды RPMI 1640 или RPMI 1640Т, добавляют 0,1% раствор конканавалина А в концентрации 20 мкг/мл. Культивирование лимфоцитов осуществляют в термостате при температуре 38°С в течение 71 часа. На 68 часу культивирования в культуру вводят колхицин из расчета 0,3 мкг/мл.

По окончании культивирования содержимое флаконов переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин при 100 g. После чего надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в 10 мл гипотонического раствора (0,52% KCl) и инкубируют 40 мин при 38°С. После удаления гипотонического раствора центрифугированием в принятом режиме к осадку добавляют 3 мл свежеприготовленного, охлажденного фиксатора Лилли (метанол - ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1). Фиксируют при 4°С не менее 45 мин, за это время фиксатор трижды меняют, старый фиксатор удаляют центрифугированием.

После последней фиксации клеточную взвесь наносят на чистые, обезжиренные стекла и оценивают качество препарата под микроскопом при увеличении 20^х. Изменяя объем фиксатора, доводят концентрацию клеток до оптимума. Для приготовления основных препаратов хромосом клеточную взвесь по 12-14 капель наносят на стекла и высушивают препараты на воздухе.

Готовые цитологические препараты окрашивают 2-4% раствором красителя Романовского-Гимза или по одной из существующих прописей для дифференциальных окрасок и исследуют под световым микроскопом, анализируя хромосомы на стадии метафазы.

Метафазы домашней курицы, полученные по предлагаемому способу, представлены на фиг. 1.

У кур достоверно идентифицируются 5 пар макрохромосом и до 6 - субмикрохромосом. Первая, вторая и четвертая пары у них субметацентрические, третья, шестая, седьмая и одиннадцатая - акроцентрики, восьмая, девятая и десятая метацентрического типа, половая Z хромосома - метацентрик (фиг. 2).

По стимулирующему действию на клетки крови птицы конканавалин А (СоА) значительно превосходит известный способ с ФГА-П.

Сопоставление митотической активности данных лектинов приведено в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать препараты хромосом сельскохозяйственной птицы для цитогенетического анализа и имеет следующие преимущества: высокий выход митотических клеток, пригодных для анализа, уменьшенные затраты на митоген.

Таблица Влияние различных митогенов на стимуляцию деления лимфоцитов птицы
Вид птицы	Митотическая активность лектинов, % РБТЛ
	ФГА-П (фитогемагглютинин 20 мкг/мл)	СоА (конканавалин А 20 мкг/мл)
Курица (Gallus gallus)	0	++
Мускусная утка (Cairina moscata)	±	++
Гусь (Anser anser)	0	++
Примечание: 0 - митотическая активность отсутствует; ± - единичные митозы в отдельных культурах; ++ - нормальная митотическая активность.

Изобретение применимо в биологии, в частности в научно-исследовательских лабораториях, занимающихся цитогенетикой сельскохозяйственной птицы.