способ прогноза неблагоприятного затяжного течения ревматоидного увеита

Формула изобретения

Способ прогнозирования неблагоприятного затяжного течения ревматоидного увеита путем определения концентрации цитокина в сыворотке крови, отличающийся тем, что определяют содержание фактора роста сосудистого эндотелия на 3-7 дни от начала заболевания, при его содержании 750 пкг/мл и выше прогнозируют неблагоприятное затяжное течение заболевания.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано в медицинской практике для прогнозирования неблагоприятного затяжного течения ревматоидного увеита (РУ).

Способы прогноза течения РУ основаны на изучении при этом заболевании иммунопатологических изменений, сопровождающихся нарушениями числа и спектра субпопуляций лимфоцитов крови, изменениями уровня аутоантител к иммуноглобулину G, неденатурированной ДНК (В.И.Мазурова Клиническая ревматология, 2001, с.52-54) и локального цитокинового статуса (Л.Е.Теплинская с соавт. Воспалительные заболевания органа зрения, Челябинск, 2004, с.9-11).

Способ прогноза течения ревматоидного увеита путем определения концентрации фактора некроза опухоли альфа в острый период заболевания в сыворотке крови (патент РФ №2287164. - БИ - 2006. - №31. Мальханов В.Б., Зайнутдинова Г.Х., Марванова З.Р., Шевчук Н.Е.) взят за прототип.

Технический результат при использовании изобретения - более ранние сроки прогноза (первые 3-7 дней от начала заболевания) неблагоприятного затяжного течения увеита.

Указанный технический результат достигается за счет того, что в способе, заключающемся в определении концентрации цитокина в сыворотке крови, определяют содержание фактора роста сосудистого эндотелия на 3-7 дни от начала заболевания, при его содержании 750 пкг/мл и выше прогнозируют неблагоприятное затяжное течение заболевания.

Предлагаемый способ прогноза неблагоприятного затяжного течения ревматоидного увеита основан на изучении при этом заболевании содержания фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) в сыворотке крови. VEGF оказывает влияние на проницаемость сосудов, является мощным ангиогенным белком и участвует в процессах неоваскуляризации в патологических ситуациях. Подтверждением достоверности предлагаемого способа прогноза является совпадение показателей концентрации исследуемого фактора роста VEGF в сыворотке крови с неблагоприятным затяжным течением ревматоидного увеита в среднем в 85,7% случаев.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Взятие крови без антикоагулянта для получения сыворотки осуществляют натощак из локтевой вены обследуемых в строго стерильных условиях.

Определение уровня фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) в сыворотке крови больных проводят методом иммуноферментного анализа с применением стрептавидина в качестве индикаторного фермента с использованием тест-систем CYTELISA (США).

В лунки микропланшета вносят по 100 мкл лиофилизированный стандарт VEGF в разведении (концентрация 0-10 000 пкг/мл). В остальные лунки микропланшета вносят по 50 мкл исследуемых образцов сыворотки крови и 50 мкл раствора для разведения, затем в эти лунки добавляют по 25 мкл биотинилированных поликлональных антител к VEGF. Планшет инкубируют 3 часа при комнатной температуре, затем жидкость из лунок удаляют, и планшет 5 раз промывают буфером. Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

В каждую лунку микропланшета вносят по 50 мкл конъюгата стрептавидина. Планшет инкубируют в течение 45 мин при комнатной температуре. Жидкость из лунок удаляют и 5 раз промывают буфером. Планшет сушат путем постукивания по поверхности лабораторного стола, покрытого фильтровальной бумагой.

Во все лунки планшета вносят по 200 мкл смешанного раствора двух цветных реагентов. Микропланшет инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл стоп-реагента в каждую лунку. Общее время постановки исследования 2,5-3 часа.

Учет результатов проводят с использованием автоматического фотометра «Multiscan» при длине волны 490 нм, устанавливают нулевое поглощение по лунке со стандартом 0. Результаты выражают в пкг/мл. При содержании фактора роста сосудистого эндотелия 750 пкг/мл и выше прогнозируют неблагоприятное затяжное течение заболевания

У 16 больных с ревматоидным увеитом было изучено содержание фактора роста сосудистого эндотелия VEGF в сыворотке крови в острый период заболевания. Взятие крови без антикоагулянта для получения сыворотки осуществляли натощак из локтевой вены обследуемых в строго стерильных условиях.

Определение уровня VEGF в сыворотке крови больных проводили методом иммуноферментного анализа с применением стрептавидина в качестве индикаторного фермента.

В лунки микропланшета вносили по 100 мкл лиофилизированный стандарт VEGF в разведении (концентрация 0-10 000 пкг/мл). В остальные лунки микропланшета вносили по 50 мкл исследуемых образцов сыворотки крови и 50 мкл раствора для разведения, затем в эти лунки добавляли по 25 мкл биотинилированных поликлональных антител к VEGF. Планшет инкубировали 3 часа при комнатной температуре, затем жидкость из лунок удаляли, и планшет 5 раз промывали буфером. Проводили полную аспирацию оставшейся жидкости.

В каждую лунку микропланшета вносили по 50 мкл конъюгата стрептавидина. Планшет инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре. Жидкость из лунок удаляли и 5 раз промывали буфером. Планшет сушили путем постукивания по поверхности лабораторного стола, покрытого фильтровальной бумагой.

Во все лунки планшета вносили по 200 мкл смешанного раствора двух цветных реагентов. Микропланшет инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл стоп-реагента в каждую лунку. Общее время постановки исследования 3,5-4 часа.

Учет результатов проводили с использованием автоматического фотометра «Multiscan» при длине волны 490 нм, устанавливая нулевое поглощение по лунке со стандартом 0. Результаты выражали в пкг/мл. Нормальный уровень фактора роста сосудистого эндотелия VEGF в сыворотке крови у практически здоровых лиц (контрольная группа) был равен 36,2±4,1 пкг/мл.

У 7 (43, 75%) из 16 больных содержание VEGF в сыворотке крови в период клинического проявления увеита ревматоидной этиологии в период с 3 по 7 день болезни было выявлено в пределах 750 пкг/мл и выше. При этом неблагоприятное течение РУ наблюдали у 6 (85,7%) пациентов. Несмотря на проводимую противовоспалительную терапию, клинического улучшения не наступало, заболевание имело затяжное более 1 месяца течение с развитием осложнений: появились свежие преципитаты на эндотелии роговицы и задние синехии, наблюдали неоваскуляризацию радужки и в 3-х случаях - развитие увеальной катаракты. У 1 (14,3%) пациента заболевание протекало благоприятно с купированием воспалительного процесса и хорошими визуальными результатами к концу второй недели лечения.

У 9 (56,25%) из 16 больных РУ содержание VEGF в сыворотке крови на 3-7 день от начала заболевания было выявлено в пределах 100-350 пкг/мл. При этом у 7 (77,8%) из них клинически заболевание протекало благоприятно, и к концу 2-й недели воспалительный процесс был купирован. У 2 (22,2%) больных течение увеита характеризовалось как неблагоприятное - в течение 2-х недель сохранялась воспалительная реакция с перикорнеальной инъекцией и преципитатами на эндотелии роговицы. Лишь к концу 5-ой недели было отмечено стихание воспалительного процесса в глазу.

Таким образом, предлагаемый способ прогноза неблагоприятного затяжного течения ревматоидного увеита являлся правильным у 6 из 7 больных, что было достоверно в 85,7% случаев.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Больная Ш., 53 лет. Находилась на стационарном лечении по поводу ревматоидного увеита правого глаза. Определение VEGF в сыворотке крови проводилось по выше описанной методике. В острый период заболевания (на 5 сутки) содержание VEGF в сыворотке крови было равно 829,5 пкг/мл, на основании чего прогнозировали неблагоприятное затяжное течение увеита. Несмотря на проводимое противовоспалительное лечение, у пациентки сохранялись боли, биомикроскопически наблюдали появление свежих преципитатов, новых спаек и увеличение клеточной взвеси во влаге передней камеры. Сниженная до 0,09 острота зрения также не изменялась. Больная находилась на лечении в стационаре более 1 месяца. Следовательно, повышенное содержание VEGF в сыворотке крови (829,5 пкг/мл) в острой стадии заболевания совпало с прогнозом неблагоприятного затяжного течения РУ.

Пример 2. Больная Г., 43 лет, находилась на стационарном лечении по поводу ревматоидного увеита. Определение VEGF в сыворотке крови проводилось по выше описанной методике. В разгар заболевания (на 3 сутки) содержание VEGF в сыворотке крови было равно 1480,0 пкг/мл, было сделано предположение о неблагоприятном затяжном течении увеита. Проведенное в течение 4-х недель противовоспалительное лечение не улучшило клинической картины заболевания: острота зрения оставалась низкой, биомикроскопически на эндотелии роговицы выявлялись преципитаты и спайки радужки с передней капсулой хрусталика, происходила неоваскуляризация ее сосудами, что подтверждало прогноз неблагоприятного затяжного течения РУ.

Таким образом, высокое (750 пкг/мл и выше) содержание VEGF в сыворотке крови в острой стадии заболевания свидетельствует о прогнозе неблагоприятного затяжного течения РУ.

Пример 3. Больная К. находилась на стационарном лечении по поводу РУ. Определение VEGF в сыворотке крови проводилось по выше описанной методике. На 7 день от начала заболевания содержание VEGF в сыворотке крови составляло 156,9 пкг/мл. На основании установленного в пределах интервала (100-350 пкг/мл) значения VEGF в сыворотке крови больной был сделан прогноз благоприятного течения ревматоидного увеита. Действительно, уже к 12-14 суткам от начала заболевания было отмечено стихание воспалительного процесса, проявляющееся в исчезновении перикорнеальной инъекции и частичном рассасывании преципитатов на эндотелии роговицы, что подтверждало ранее предположенный прогноз благоприятного течения РУ.

Пример 4. Больная З., 59 лет. Диагноз: РУ. Было проведено определение содержания VEGF в сыворотке крови в период клинических проявлений РУ (на 4 день от начала заболевания), которое равнялось 285,0 пкг/мл и было предположено благоприятное течение ревматоидного увеита. Исчезновение болей, купирование воспалительного процесса и частичное рассасывание преципитатов на эндотелии роговицы, отмеченные уже на 12 день после начала заболевания, подтверждали прогноз благоприятного течения увеита.

Таким образом, предлагаемый способ прогноза неблагоприятного затяжного течения ревматоидного увеита позволяет оценить характер течения этого заболевания по содержанию VEGF в сыворотке крови пациентов в острой стадии (первые 3-7 дней) данной офтальмопатологии.