неинфекционный для человека аденовирус как вектор для заместительной генной терапии нарушений ангиогенеза, обеспечивающий эффективный синтез ангиогенина человека в трансфецированных клетках млекопитающих, способ индукции ангиогенеза, способ лечения ишемической болезни, композиция для индукции ангиогенеза и лечения ишемической болезни

Формула изобретения

1. Неинфекционный для человека рекомбинантный аденовирус птиц CELOAng как вектор для заместительной генной терапии нарушений ангиогенеза, обладающий следующими свойствами:

является репликативно-дефектным в клетках млекопитающих (включая человека);

включает фрагмент генома аденовируса CELO, в области которого, несущественной для репликации в клетках птиц, несет экспрессионную кассету, состоящую из промотора цитомегаловируса, кДНК гена ангиогенина человека и сигнала полиаденилирования гормона роста быка;

обеспечивает индукцию ангиогенеза.

2. Композиция для индукции ангиогенеза и лечения ишемической болезни, включающая фактор индукции ангиогенеза и физиологически приемлемый растворитель, отличающаяся тем, что в качестве фактора индукции ангиогенеза она содержит рекомбинантный аденовирус птиц по п.1 в эффективном количестве.

3. Способ индукции ангиогенеза, включающий введение в организм млекопитающего композиции для индукции ангиогенеза и лечения ишемической болезни, отличающийся тем, что в качестве таковой используют композицию по п.2.

4. Способ лечения ишемической болезни, включающий введение в организм млекопитающего композиции для индукции ангиогенеза и лечения ишемической болезни, отличающийся тем, что в качестве таковой используют композицию по п.2.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и может быть использовано в медицине для лечения кардиоваскулярных заболеваний.

Хронические облитерирующие заболевания сосудов являются одними из самых угрожающих здоровью людей в мире. Ишемические заболевания миокарда и нижних конечностей представляют, таким образом, серьезную медицинскую проблему, решение которой в настоящее время видят в улучшении кровоснабжения путем терапевтического ангиогенеза, т.е. в индукции развития дополнительной сети сосудов.

Ангиогенез - неоваскуляризация, развитие сети новых сосудов, процесс образования новых кровеносных сосудов - может быть индуцирован воздействием большого количества факторов прямого и непрямого действия.

К факторам прямого действия относится ряд белков, среди них фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), плацентарный фактор роста (PlGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), щелочной и кислый факторы роста фибробластов (FGF), ангиогенин и др. К непрямым индукторам относятся трансформирующий фактор роста (TGF), фактор некроза опухолей (TNF) и др. [Strydom D.J. The angiogenins. Cell.Mol.Life Sci., 1998, v.54, pp.811-824].

Одним из самых сильных ангиогенных факторов прямого действия является ангиогенин. Ангиогенин был обнаружен и очищен исключительно по его способности индуцировать неоваскуляризацию. При этом ангиогенин, по-видимому, оказывает свое действие на многих этапах сложного процесса ангиогенеза: он вызывает пролиферацию эндотелиальных клеток, инвазию эндотелиальных клеток в матрикс, стимулирует протеолитическую активность этих клеток и клеточную адгезию [Badet J. Angiogenin, a potent mediator of angiogenesis. Biological, biochemical and structural properties. Path.Biol, 1999, v.47, pp.345-351].

Известны способы индукции ангиогенеза в тканях взрослых организмов путем введения генетических конструкций на основе аденовирусов человека, несущих ген фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [Rajagopalan S., Shah M., Luciano A., Crystal R., Nabel E.G. Adenovirus-mediated gene transfer of VEGF(121) improves lower-extremity endothelial function and flow reserve. Circulation, 2001, v.107, pp.753-755], факторов роста фибробластов (FGF) [Shigematsu H. Adenovirus-mediated ex vivo gene transfer of basic fibroblast growth factor promotes collateral development in rabbit model of hind limb ischemia. Gene Ther., 2001, v.8, pp.837-845]. Они были испытаны на многих моделях, некоторые из них и на человеке [Zhang D., Gai L., Fan R., Dong W., Wen Y. Efficacy and safety of therapeutic angiogenesis from direct myocardial administration of an adenoviral vector expressing vascular endothelial growth factor 165. Clin. Med.J., 2002, v.115, pp.643-648]. При этом эффективность терапевтического эффекта во многих случаях остается незначительной. В первую очередь это связано с наличием у всех людей предсуществующего иммунитета к аденовирусам человека, которые использовались как векторы. Мощный иммунный ответ быстро нейтрализует вводимые конструкции [Harvey B.-G., Hackett N.R., El-Sawy T. et al. Variability of human systemic humoral responses to adenovirus gene transfer vectors administrated to different organs. J.Virol, 1999, v.73, pp.6729-6742], что снижает терапевтический эффект.

Таким образом, важным является создание новых векторов, для которых бы этот фактор отсутствовал. Для этого возможно использование в качестве векторов вирусов, которые присущи организмам, не относящимся к приматам. Таким вектором могли бы служить аденовирусы птиц, к которым у людей нет предсуществующего иммунного ответа и получение которых в препаративных количествах экономически существенно выгоднее. Последнее обстоятельство связано с тем, что аденовирусы птиц возможно размножать на дешевых куриных эмбрионах, а не в культивируемых клетках человека, как это осуществляется в случае аденовирусов человека.

Таким образом, создание новых эффективных и стабильных генетических конструкций, кодирующих различные ангиогенные факторы, способных к экспрессии при введении их человеку, является важной задачей.

Техническим результатом, достигнутым при реализации настоящего изобретения, является получение на основе неинфекционного для человека аденовируса птиц CELO рекомбинантного аденовируса CELOAng, кодирующего ангиогенин человека и обеспечивающего длительную индукцию ангиогенеза в организме животных и человека, а также возможность лечения ишемической болезни с использованием полученного рекомбинантного вируса. Важным преимуществом этой векторной системы является отсутствие предсуществующего иммунного ответа в организме человека и неспособность к репликации в клетках млекопитающих (включая человека). Преимущество рекомбинантного вируса, сконструированного на основе аденовируса птиц, перед рекомбинантами, создаваемыми на основе аденовирусов человека, заключается также в том, что аденовирус птиц CELO способен расти в куриных эмбрионах. При заражении в дозе 10⁷ БОЕ/эмбрион урожай вируса составляет 10⁹ -10¹⁰ БОЕ из одного эмбриона.

Указанный технический результат достигается тем, что полученный рекомбинантный аденовирус CELOAng в сайте делеции, несущественной для репликации вируса области (от 95,3 до 99,7 ед. карты), содержит экспрессирующую кассету, состоящую из промотора ранней области цитомегаловируса, кДНК гена ангиогенина и сигнала полиаденилирования гормона роста быка.

Для получения рекомбинантного аденовируса использовали метод гомологичной рекомбинации в культуре клеток. Предварительно кДНК гена ангиогенина была вырезана из плазмиды pAng3 с помощью рестриктаз Nhe I и Sma I и клонирована в плазмиде pCBEdlRV по сайтам Nhel и EcoRV. Плазмида pCBEdlRV несет фрагмент генома аденовируса CELO от 88,8 до 100 ед. карты, и в сайте делеции, несущественной для репликации вируса области (от 95,3 до 99,7 ед. карты) находится экспрессирующая кассета (промотор ранней области цитомегаловируса, полилинкер и сигнал полиаденилирования гена гормона роста быка). Сконструированную плазмиду pS415Ang использовали для получения рекомбинантного аденовируса в результате котрансфекции методом кальциево-фосфатной преципитации клеток линии LHM (гепатома кур) с фрагментом генома вируса CELO от 0 до 99,7 ед. карты (данный фрагмент образуется после рестрикции ДНК аденовируса CELO рестриктазой Swal). Процесс рекомбинации гомологичных участков геномной и плазмидной ДНК в клетках приводил к генерации рекомбинантного вируса CELOAng, содержащего ген ангиогенина под контролем промотора цитомегаловируса (CMV) в области делеции "несущественного" участка генома аденовируса. Во избежание возможной контаминации рекомбинантного аденовируса вирусом CELO дикого типа проводили очистку методом повторного получения индивидуальных аденовирусных бляшек на культуре клеток LHM.

Накопление рекомбинантного аденовируса CELOAng осуществляли в куриных эмбрионах, очистку и концентрирование аденовируса проводили по модифицированному методу Green.

Указанный технический результат достигается также тем, что в способе индукции ангиогенеза, включающем введение в живой организм млекопитающего фактора индукции ангиогенеза, отличительной особенностью является то, что для введения используют рекомбинантный аденовирус CELOAng.

Достигается указанный технический результат также тем, что в способе лечения ишемической болезни, включающем введение в организм фактора индукции ангиогенеза, отличительной особенностью является то, что в качестве такового используют рекомбинантный аденовирус CELOAng.

Целесообразно вводить 3×10⁹-3×10 ¹⁰ БОЕ рекомбинантного аденовируса CELOAng в виде раствора в физиологически приемлемом растворителе трехкратно с интервалом 3 дня.

Указанный технический результат достигается также тем, что в композиции для индукции ангиогенеза и лечения ишемической болезни, содержащей фактор индукции ангиогенеза и растворитель, в качестве фактора индукции ангиогенеза она содержит рекомбинантный аденовирус CELOAng, а в качестве растворителя - физиологически приемлемый растворитель.

На чертеже приведен геном рекомбинантного аденовируса птиц CELOAng.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pS415Ang.

2 мкг плазмидной ДНК pAng3 обрабатывают рестриктазами (по 10 ед) Nhe I и Sma I в буфере Y⁺/Tango (Fermentas), содержащем 10 мМ Tris-HCl (pH 7.4), 100 мМ KCl, 1 мМ MDTT, 1 мМ EDTA, 0,2 мг BSA, 50% glycerol, и из полученного гидролизата выделяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле фрагмент для вставки, содержащий ген ангиогенина (около 0,8 т.п.о.).

5 мкг плазмидной ДНК pCBEdlRV обрабатывают рестриктазами (по 10 ед) Nhe I и EcoRV в буфере Multicor (Promega), содержащем 10 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 100 мМ KCl, 1 мМ MDTT, 1 мМ EDTA, 0,2 мг BSA, 50% glycerol, и из полученного гидролизата выделяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле векторную часть плазмиды (около 7 т.п.о.).

0,5 мкг полученного вектора лигируют с 0,1 мкг фрагмента для вставки, содержащего ген ангиогенина в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 10 мМ MgCl₂, 1 мМ MDTT, 5 мМ дитиотриена, 0,1 мг АТР в присутствии 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4.

2 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.coli штамм DH5 . Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК pS415Ang и анализируют рестрикционным анализом при помощи эндонуклеаз BamHI и BstEII, а также при помощи эндонуклеазы EcoRI.

Пример 2. Конструирование рекомбинантного аденовируса CELOAng.

10 мкг плазмидной конструкции pS415Ang используют для котрансфекции клеток линии LMH совместно с 10 мкг фрагмента генома вируса CELO от 0 до 99.7 ед. карты. Этот фрагмент получают из ДНК вируса CELO после ее гидролиза рестриктазой Swa I.

Трансфекцию проводили методом кальциево-фосфатной преципитации по Graham. Клетки линии LMH рассеивали за 24 часа до трансфекции. Кальциево-фосфатный преципитат получали, смешивая 1 × HEBS буфер (5 г/л HEPES, 8 г/л NaCl, 0,37 г/л KCl, 0,125 г/л Na₂ HPO₄ × 2H₂О, 1 г/л глюкозы рН 7,1) с 20 мкг/мл препаратов ДНК. К полученной смеси по каплям добавляли 2,5 М CaCl₂ (50 мкл/мл), перемешивали, инкубировали смесь при комнатной температуре 30 мин и полученный преципитат вносили в культуральную среду из расчета 1 мл преципитата на 10 мл среды. После инкубации в СО₂-инкубаторе в течение 4,5 часов среду заменяли на покрытие с 0,5%-ной агарозой.

Процесс рекомбинации гомологичных участков геномной и плазмидной ДНК в клетках приводит к генерации рекомбинантного вируса CELOAng, содержащего ген Ang под контролем промотора цитомегаловируса (ЦМВ) в области делеции "несущественного" участка генома. Бляшки рекомбинантного аденовируса CELOAng, которые появлялись на 13 день после трансфекции, отбирали пастеровской пипеткой и полученный вирусный материал размножали на клетках линии LMH.

Возможную контаминацию препаратов CELOAng вирусом CELO дикого типа устраняют проведением очистки методом повторного получения индивидуальных вирусных бляшек на культуре клеток LMH. Отсутствие контаминации очищенных препаратов CELOAng доказывают проведением анализа при помощи ПЦР с использованием двух пар праймеров: первая пара комплиментарна участку гена Ang, вторая пара - участку делетированного (по EcoRV) фрагмента генома CELO.

Пример 3. Тестирование ангиогенной активности рекомбинантного аденовируса. CELOAng на экспериментальной модели.

Использованы крысы-самцы линии Вистар весом 200-250 г.

Животным давали эфирный наркоз, после чего на задней конечности в области передней большеберцовой мышци делали разрез кожи 4-5 мм длиной и под визуальным контролем в 3-4 инъекции вводили в М. tibialis anterior 3×10⁹ БОЕ аденовируса CELOAng (опытная группа) или CELO/SEAP (контрольная группа). Инъекции повторяли дважды с интервалом 3 дня, через 7 дней после последней инъекции животных выводили из эксперимента. Затем осуществляли забор передней тибиальной мышцы исследуемой конечности крысы. Для контроля возможного системного действия плазмид осуществляли забор тканей печени, почек и селезенки. Для гистологического исследования материал фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине и заключали в парафин.

Из исследуемой мышцы от каждой крысы получали 3 блока. Парафиновые срезы мышц окрашивали азокармином по Гейденгайну. В каждой из образцов при увеличении в 280 раз производили подсчет капилляров в 30-ти полях зрения. Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Фишера-Стьюдента.

Результат представлен в табл. 1.

Таблица 1
Среднее количество в одном поле зрения мышечной ткани на поперечных срезах М. tibialis anterior задних конечностей крыс.
Группа животных	Количество капилляров	р<0,01
CELOAng (опыт)	33,98±0,57
CELOSEAP (контроль)	28,97±0,6

Таким образом, при трехкратном с интервалом 3 дня введении в переднюю большеберцовую мышцу (М. tibialis anterior) крыс по 3×10⁹ бляшкообразующих единиц аденовируса CELOAng наблюдается статистически достоверное повышение числа капилляров в одном поле зрения мышечной ткани.

Пример 4. Клиническая апробация метода в отделении хирургии сосудов Российского научного центра хирургии РАМН.

В исследование включено 9 пациентов (8 мужчин, 1 женщина) в возрасте от 42 до 70 лет. Этиологией заболевания в 8 случаях был атеросклероз (в т.ч. в 1 случае в сочетании с сахарным диабетом) и в 1 случае - артериит. Патология артериального сосудистого русла у данных пациентов характеризовалась преимущественно дистальными формами поражения, т.е. выраженными окклюзионно-стенотическими поражениями подколенно-тибиального сегмента в сочетании с отсутствием гемодинамически значимых поражений сосудов аорто-подвздошно-бедренного сегмента. Данные варианты поражения были неблагоприятны для выполнения прямых реконструктивных сосудистых операций. На момент поступления в клинику дистанция безболевой ходьбы пациентов составляла от 40 до 100 метров, у пациентов имелись минимальные трофические изменения. Пациентам вводился рекомбинантный вирус CELOAng путем прямых внутримышечных инъекций в тибиальную группу мышц пораженной конечности трехкратно в равных дозах (3×10 ¹⁰ БОЕ аденовируса) с интервалом 3 дня.

Отдаленные результаты применения метода в клинике изучены у 7 больных в сроки от 6 до 22 месяцев. Эффективность лечения оценивалась по клиническим критериям (жалобы, дистанция безболевой ходьбы, наличие трофических расстройств), а также с использованием ультразвуковых и радиоизотопных методов. У всех пациентов с явлениями хронической ишемии после введения генно-инженерных конструкций наблюдался положительный эффект, выражающийся в увеличении дистанции безболевой ходьбы до 200-1000 м, заживлении имеющихся трофических дефектов. По данным ультразвукового исследования отмечалось увеличение лодыжечно-плечевого индекса давления, а также увеличение перфузии мышц нижних конечностей по данным радиоизотопных методов исследования. Сохранность конечностей в указанные сроки составила 100%. Каких-либо побочных эффектов (за исключением субфебрильной температуры в первые 2 дня после введения препарата) не наблюдалось.

Таким образом, на основе неифекционного для человека аденовируса птиц CELO получен рекомбинантный аденовирус CELOAng, кодирующий ангиогенин человека и обеспечивающий эффективную индукцию ангиогенеза. Новый рекомбинантный аденовирус CELOAng позволяет эффективно лечить ишемическую болезнь.