обедненная прекалликреином альбуминовая фракция плазмы крови

Формула изобретения

1. Способ получения обогащенной альбумином фракции плазмы с пониженным содержанием активатора прекалликреина (РКА), включающий стадии: (а) восстановление пасты V, полученной фракционированием по Cohn, путем суспендирования пасты V в течение 6 ч при температуре -2±2°С в 1,6-кратной массе воды для инъекций при рН 7,2-7,6; (b) осуществление стадии концентрирования фракции, полученной на стадии (а), (с) нагревание фракции, полученной на стадии (b) в диапазоне от 50 до 70°С в течение времени, достаточного для пастеризации фракции, (d) фасовку полученной фракции для использования, и (е) проведение стадии инкубации при следующих условиях: 10 дней при температуре 30-32°С или 4 недели при 20-25°С.

2. Способ по п.1, в котором после фасовки проводят вторую стадию пастеризации.

3. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором пастеризацию проводят в течение, по меньшей мере, 9 ч при температуре 58-65°С.

4. Альбуминсодержащая фракция плазмы с пониженным содержанием активатора прекалликреина (РКА), полученная способом по любому из пп.1-3.

5. Альбуминсодержащая фракция плазмы по п.4, содержащая РКА менее чем 12 МЕ/мл, предпочтительно 10 МЕ/мл, где РКА определяют согласно четвертому изданию Европейской фармакопеи.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способу получения обогащенной альбумином фракции с пониженным содержанием активатора прекалликреина (РКА) и к альбуминсодержащей фракции с пониженным содержанием прекалликреина активатора (РКА), получаемой в соответствие со способом настоящего изобретения.

Препараты, содержащие альбумин, используются в качестве растворов для инфузии пациентам, нуждающимся в таком лечении. Для обеспечения наиболее физиологически приемлемого замещения жидкой среды организма пациентам вводят не только физиологические концентрации солей, но и альбумин в качестве наполнителя. Альбуминовые препараты могут содержать активатор прекалликреина, наличие которого может приводить к нежелательным побочным эффектам, что может быть связано с влиянием активатора прекалликреина на ренин-ангиотензиновую систему. Для получения препаратов альбумина, содержащего пониженное количество активатора прекалликреина, обычно применяют комбинацию способов выделения альбуминовой фракции по Cohn с последующей очисткой ее хроматографическими методами (Veron J.-L. et al., Biotech. Blood Prot. 227 (1993), pp.183-188, и Matejtschuk P. et al., Br. J. Anaesth. 85 (2000), pp.887-895).

Цель настоящего изобретения заключается в снижении содержания РКА во фракциях, полученных из плазмы, содержащих альбумин. Другая цель настоящего изобретения состоит в получении альбуминсодержащей фракции с пониженным содержанием РКА.

Указанные цели достигаются с помощью способа получения фракции, обогащенной альбумином с пониженным содержанием активатора прекалликреина (РКА), включающего следующие стадии:

(a) восстановление пасты V (фракционирование по Коху (Cohn)),

(b) выполнение стадии концентрирования фракции, полученной на стадии (а),

(c) нагревание фракции, полученной на стадии (b), в диапазоне от 50°С до 70°С в течение времени, достаточного для ее пастеризации, и

(d) необязательную фасовку полученной фракции для использования, и

(e) инкубирование в течение 10 дней при температуре 30-32°С или 4 недели при 20-25°С или по режиму пастеризации, определенному в Европейской фармакопее, четвертое издание, стр.352.

В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения после фасовки осуществляют вторую стадию пастеризации по режиму не менее 9 часов при температуре 58-65°С.

Стадию инкубации (с) проводят при 50-70°С, по меньшей мере, в течение 5 часов, в частности, в течение 10 часов.

Начиная с восстановления пасты V можно необязательно добавлять фильтрующие присадки и проводить фильтрацию на фильтре с размером пор приблизительно 0,2 мкм. При необходимости можно регулировать значение рН. Значение рН следует устанавливать в интервале 7,2-7,6. Обычно проводят ультрафильтрацию до содержания белка 8% (мас./об.) с последующей диафильграцией и еще одной стадией ультрафильтрации с целью концентрации белка. В результате указанных операций концентрация белка составляет, по меньшей мере, 20%. После этого может быть осуществлена еще одна стадия фильтрации, предпочтительно с использованием мембраны с размером пор приблизительно 0,2 мкм.

В систему можно добавлять стабилизаторы в количестве 0,08 ммоль/г альбумина, в качестве которых можно использовать N-ацетил DL-триптофан и каприлат натрия, после чего рН снова устанавливают в интервале 6,7-7,3. По достижении установившейся концентрации белка и натрия осуществляется пастеризация в объеме при температуре 58-65°С в течение, по меньшей мере, 9 часов. После этого проводят стерилизующую фильтрацию. Образец выдерживают при 2-25°С в течение менее 2 недель. Стерильную альбуминовую массу подвергают окончательной фильтрации и фасуют. После фасовки можно проводить вторую стадию пастеризации при условиях, аналогичных описанным выше. Технологическая схема может быть дополнена еще одной стадией выдерживания в термостате. После визуального контроля препарат готов к хранению и применению.

Способ настоящего изобретения также предусматривает получение альбуминсодержащей фракции с пониженной концентрацией активатора прекалликреина (РКА).

Содержание РКА в альбуминовой фракции настоящего изобретения составляет менее 12 МЕ/мл, предпочтительно 10 МЕ/мл согласно анализу в соответствии с Европейской фармакопеей, четвертое издание, 2.6.15, стр. 147-148.

Далее настоящее изобретение дополнительно разъясняется с помощью примеров, не ограничивающих область изобретения.

Примеры

Пример 1:

Пасту V суспендировали в течение более 6 часов при температуре -2±2°С в 1,6-кратной массе воды для инъекций. В продукт добавляли фильтрующие присадки и полученный препарат перемешивали в течение 30 минут. Объемный фильтр предварительно промывали водой для инъекций и затем 10% (об./об.) этанолом. Полученный раствор осветляли пропусканием через объемный фильтр и через 0,2 мкм мембранный фильтр. После этого фильтр промывали 10% раствором этанола в воде для инъекций. С помощью 3М раствора гидроксида натрия устанавливали значение рН равное 7,4±0,2.

Концентрацию белка, равную 8%, получали в результате ультрафильтрации через мембраны с пределом отсечки по молекулярной массе 10 кДальтон. Концентрат подвергали диафильтрации c использованием 3-кратного количества 0,5М раствора хлористого натрия с последующей диафильтрацией c использованием 3 кратного количества воды для инъекций. После диафильтрации раствор альбумина концентрировали до содержания белка около 22% в результате ультрафильтрации при +15°C. Полученный раствор осветляли пропусканием через объемный фильтр и через 0,2 мкм мембранный фильтр. Объемный фильтр подвергали предварительной промывке водой для инъекций.

После этого 0,0106 г каприловой кислоты/г белка и 0,0182 г N-ацетил-DL-триптофана/г белка растворяли в 10% (мас./об.) растворе гидроксида натрия и при медленном перемешивании полученный раствор добавляли в раствор альбумина. Значение рН раствора устанавливали равным 7,0±0,3. Концентрацию белка в альбуминовом растворе устанавливали равной 200±10 г/л в результате добавления воды для инъекций. Концентрацию натрия устанавливали добавлением хлористого натрия на значении 150±7,5 ммоль/л. Полученный раствор перемешивали при 58-65°С в течение, по меньшей мере, 9 часов. Альбуминовый раствор подвергали стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр, предназначенный для стерилизации с номинальным размером пор 0,2 мкм. Тест на целостность стерилизующего фильтра проводили до и после использования по методике, рекомендованной в документации производителя. Стерильно отфильтрованный альбумин хранят при температуре в интервале 2-25°С в течение не более 2 недель. В асептических условиях, с использованием финишного 0,2 мкм стерилизующего фильтра, стерильным раствором заполняли депирогенные флаконы для инфузии, которые закрывали стерилизованными каучуковыми пробками и герметизировали алюминиевыми колпачками. Стерилизующий фильтр тестировали на целостность до и после использования флаконов, следуя методике, рекомендованной производителем. Объем заполнения флаконов контролировали в процессе заполнения. Пастеризацию проводили в соответствии с Европейской фармакопеей. Контейнеры с готовым препаратом выдерживали в термостате в соответствии с требованиями Европейской фармакопеи. После термостатирования все флаконы подвергали визуальному исследованию на наличие примесей, мутности, наличие дефектов флаконов и колпачков. Препараты с дефектами отбраковывали. Все флаконы хранили при 2-25°С.

Пример 2:

Пасту V суспендировали в течение более 6 часов при температуре -2±2°С в 1,6-кратной массе воды для инъекций. В продукт добавляли фильтрующие средства и полученный препарат перемешивали в течение 30 минут. Объемный фильтр предварительно промывали водой для инъекций и затем 10% раствором этанола. Полученный раствор осветляли пропусканием через объемный фильтр и через 0,2 мкм мембранный фильтр. После этого фильтр промывали 10% раствором этанола в воде для инъекций. Значение рН устанавливали равным 7,4±0,2 с помощью 3М раствора гидроксида натрия. Концентрацию белка, равную 8%, получали в результате ультрафильтрации через мембраны с пределом отсечки 10 кДальтон. Концентрат подвергали диафильтрации c использованием 3 кратного количества 0,5М раствора хлористого натрия и последующей диафильтрации c использованием 3-кратного количества воды для инъекций. После диафильтрации раствор альбумина концентрировали до содержания белка около 26% в результате ультрафильтрации при температуре <+15°C. Полученный раствор осветляли пропусканием через объемный фильтр и через 0,2 мкм мембранный фильтр. Объемный фильтр подвергали предварительной промывке водой для инъекций. После этого 0,0106 г каприловой кислоты/г белка и 0,0182 г N-ацетил-DL-триптофана/г белка растворяли в 10% растворе гидроксида натрия и при медленном перемешивании полученный раствор добавляли в раствор альбумина. Значение рН раствора устанавливали равным 7,0±0,3. Концентрацию белка в альбуминовом растворе устанавливали равной 250±12 г/л добавлением воды для инъекций. Концентрацию натрия устанавливали равной 150±7,5 ммоль/л добавлением хлористого натрия. Полученный раствор перемешивали при 58-65°С в течение, по меньшей мере, 9 часов. Альбуминовый раствор подвергали стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр, предназначенный для стерилизации с номинальным размером пор 0,2 мкм. Тест на целостность стерилизующего фильтра проводили до и после использования по методике, рекомендованной в документации производителя. Стерильно отфильтрованный альбумин хранят при температуре в интервале 2-25°С в течение не более 2 недель. В асептических условиях, с использованием финишного 0,2 мкм стерилизующего фильтра, стерильным раствором заполняли депирогенные флаконы для инфузии, которые закрывали стерилизованными каучуковыми пробками и герметизировали алюминиевыми колпачками. Стерилизующий фильтр тестировали на целостность до и после использования, следуя методике, рекомендованной производителем. Объем заполнения флаконов контролировали в процессе заполнения. Пастеризацию проводили в соответствии с Европейской фармакопеей. Контейнеры с готовым препаратом выдерживали в термостате в соответствии с требованиями Европейской фармакопеи. После термостатирования все флаконы подвергали визуальному исследованию на наличие примесей, мутности, наличие дефектов флаконов и колпачков. Препараты с дефектами отбраковывали. Все ампулы хранили при 2-25°С.

Пример 3:

Пасту V суспендировали в течение более 6 часов при температуре -2±2°С в 1,6-кратной массе воды для инъекций. В продукт добавляли фильтрующие присадки и полученный препарат перемешивали в течение 30 минут. Объемный фильтр предварительно промывали водой для инъекций и затем 10% раствором этанола. Полученный раствор осветляли пропусканием через объемный фильтр и через 0,2 мкм мембранный фильтр. После этого фильтр промывали 10% раствором этанола в воде для инъекций. С помощью 3М раствора гидроксида натрия устанавливали значение рН 7,4±0,2. Концентрацию белка, равную 8%, получали в результате ультрафильтрации через мембраны с пределом отсечки 10 кДальтон. Концентрат подвергали диафильтрации c использованием >3-кратного количества 0,5М раствора хлористого натрия и последующей диафильтрации c использованием <3-кратного количества воды для инъекций. После диафильтрации раствор альбумина концентрировали до содержания белка около 22% в результате ультрафильтрации при температуре ниже +15°C. Полученный раствор осветляли пропусканием через объемный фильтр и через 0,2 мкм мембранный фильтр. Объемный фильтр подвергали предварительной промывке водой для инъекций. После этого 0,0106 г каприловой кислоты/г белка и 0,0182 г N-ацетил-DL-триптофана/г белка растворяли в 10% растворе гидроксида натрия и при медленном перемешивании полученный раствор добавляли в раствор альбумина. Значение рН раствора устанавливали равным 7,0±0,3. Концентрацию белка в альбуминовом растворе устанавливали равной 200±10 г/л добавлением воды для инъекций. Концентрацию натрия устанавливали равной 150±7,5 ммоль/л добавлением хлористого натрия. Полученный раствор перемешивали при 58-65°С в течение, по меньшей мере, 10 часов. Альбуминовый раствор подвергали стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр, предназначенный для стерилизации, с номинальным размером пор 0,2 мкм. Тест на целостность стерилизующего фильтра проводили до и после использования по методике, рекомендованной в документации производителя. Стерильно отфильтрованный альбумин хранят при температуре в интервале 2-25°С в течение не более 2 недель. Концентрацию белка в альбуминовом растворе, равную 50±2,5 г/л, устанавливали добавлением воды для инъекций. Значение рН системы устанавливали равной 7,0±0,3. Содержание натрия устанавливали равным 150±7,5 ммоль/л в результате добавления хлористого натрия. Альбуминовый раствор хранили при температуре 2-25°С в течение не более 24 часов до заполнения флаконов. В асептических условиях, с использованием финишного 0,2 мкм стерилизующего фильтра, стерильным раствором заполняли депирогенные флаконы для инфузии, которые закрывали стерилизованными каучуковыми пробками и герметизировали алюминиевыми колпачками. Стерилизующий фильтр тестировали на целостность до и после использования, следуя методике, рекомендованной производителем. Объем заполнения флаконов контролировали в процессе заполнения. Пастеризацию проводили в соответствии с Европейской фармакопеей. Контейнеры с готовым препаратом выдерживали в термостате в соответствии с требованиями Европейской фармакопеи. После термостатирования все флаконы подвергали визуальному исследованию на наличие примесей, мутности, наличие дефектов ампул и колпачков. Препараты с дефектами отбраковывали. Все флаконы хранили при 2-25°С.

Активатор прекалликреина

Активатор прекалликреина (РКА), инициирующий превращение прекалликреина в калликреин, может быть проанализирован на его способность к расщеплению хромофорной группы синтетического пептидного субстрата, в результате чего можно спектрофотометрически измерить скорость расщепления и рассчитать концентрацию РКА путем сравнения с эталонной кривой, откалиброванной в Международных единицах активности.

Международная единица представляет собой активность определенного количества Международного Стандарта, состоящего из лиофилизированного активатора прекалликреина. Эквивалент Международного Стандарта в Международных единицах активности установлен Всемирной Организацией Здравоохранения.

Приготовление прекалликреинового субстрата

Во избежание коагуляционной активации кровь или плазма, используемая для получения прекалликреина, должны контактировать только с пластиком или стеклянными поверхностями, обработанными силиконом. 9 объемов человеческой крови примешивают к 1 объему раствора антикоагулянта (ACD, CPD или 38 г/л цитрата натрия), в который добавлен бромид гексадиметрина в количестве 1мг/мл. Полученную смесь центрифугируют в течение 5 минут при 3600 × g. Плазму отделяют и центрифугируют в течение 20 минут при 6000 × g с целью осаждения тромбоцитов. Плазму, обедненную тромбоцитами, отделяют и в течение 20 часов подвергают диализу с использованием 10 объемов буфера А. Диализованную плазму пропускают через хроматографическую колонку, содержащую систему агароза-DEAE для ионообменной хроматографии, уравновешенную буфером А и имеющую объем, равный удвоенному объему плазмы. Колонку элюируют буфером А со скоростью 20 мл/см² /ч. Собирают фракции элюата и регистрируют оптическое поглощение при длине волны 280 нм (2.2.25). Объединяют фракции, содержащие первый белковый пик, причем объем пула составляет 1,2 объема плазмы, обедненной тромбоцитами.

Объединенный субстрат тестируют на отсутствие калликреиновой активности, смешивая 1 часть с 20 частями предварительно нагретого раствора хромогенного субстрата, используемого в анализе, и полученную смесь термостатируют при 37°С в течение 2 минут. Субстрат подходит для дальнейшего использования, если увеличение оптического поглощения не превышает 0,001 в минуту. К объединенному субстрату добавляют раствор хлористого натрия с концентрацией 7 г/л и полученную систему фильтруют с использованием мембранного фильтра (пористость 0,45 мкм). Фильтрат замораживают порциями и хранят при -25°С; субстрат можно сушить вымораживанием перед хранением.

Все операции, начиная с хроматографии до замораживания порций, следует завершать за один рабочий день.

Анализ

Анализ предпочтительно проводить с использованием автоматизированного анализатора ферментов при 37°С, используя такие объемы, концентрацию субстратов и времена термостатирования, которые обеспечивают линейность скорости реакции, по меньшей мере, до концентрации 35 МЕ/мл. Стандарты, образцы и прекалликреиновый субстрат при необходимости можно разбавлять буфером В.

Разбавленные стандарты или образцы культивируют в течение 10 минут в присутствии прекалликреинового субстрата, при этом объем неразбавленного образца не должен превышать 1/10 общего объема инкубационной смеси с целью избежания ошибок, вызванных изменением ионной силы и значением рН инкубационной смеси. Смесь или ее часть инкубируют в присутствии, по меньшей мере, равного объема раствора подходящего синтетического хромогенного субстрата в буфере В, обладающего известной специфичностью к калликреину (например, N-бензоил-L-пролил-L-фенилаланил-L-аргинин-4-нитроанилид ацетат R или D-пролил-L-фенилаланил-L-аргинин-4-нитроанилид-дигидрохлорид R). Во временном интервале от 2 до 10 минут регистрируют скорость изменения оптического поглощения в минуту при длине волны, специфической для используемого субстрата. Для каждой смеси образцов или стандартов готовят контрольный образец, используя буфер В вместо прекалликреинового субстрата.

Корректируют величину А/мин, вычитая значение, полученное для контрольного образца. Строят калибровочную кривую с использованием полученных значений для эталонного препарата и соответствующих концентраций; полученную кривую используют для определения РКА-активности исследуемого препарата.

Буфер А

Трис (гидроксиметил)аминометан	6,055 г
Хлористый натрий	1,17 г
Бромид гексадиметрина	50 мг
Азид натрия	0,100 г

Указанные ингредиенты растворяют в воде, с помощью 2М хлористоводородной кислоты устанавливают значение рН 8,0, и систему разбавляют водой до объема 1000 мл.

Буфер В

Трис (гидроксиметил)аминометан	6,055 г
Хлористый натрий	8,77 г

Указанные ингредиенты растворяют в воде с помощью 2М хлористоводородной кислоты устанавливают значение рН 8,0 и систему разбавляют водой до объема 1000 мл.

Технологическая стадия	Величина РКА (согласно изобретению)	Величина РКА (сравнительный пример)
После IPBP* и стерилизующей фильтрации	3 МЕ/мл	n.a.**
После пастеризации в конечном резервуаре	<2 МЕ/мл	5 МЕ/мл
После инкубации	4 МЕ/мл	18 МЕ/мл

Технологическая стадия	Величина РКА (согласно изобретению)	Величина РКА (сравнительный пример)
После IPBP* и стерилизующей фильтрации	<2 МЕ/мл	n.a.**
После пастеризации в конечном резервуаре	<2 МЕ/мл	2 МЕ/мл
После инкубации	3 МЕ/мл	12 МЕ/мл

Технологическая стадия	Величина РКА (согласно изобретению)	Величина РКА (сравнительный пример)
После IPBP* и стерилизующей фильтрации	<2 МЕ/мл	n.a.**
После пастеризации в конечном резервуаре	<2 МЕ/мл	5 МЕ/мл
После инкубации	2 МЕ/мл	20 МЕ/мл

*IPBP в процессе пастеризации в массе

** n.a. не применялось