Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

способ получения белкового препарата из цианобактерий

Классы МПК:A23J3/20 белки из микроорганизмов или одноклеточных водорослей
A23J3/32 с использованием химических веществ
C12N1/12 одноклеточные водоросли; питательные среды для них
C09B61/00 Красители природного происхождения, получаемые из природных сырьевых материалов
Автор(ы):,
Патентообладатель(и):Мазо Владимир Кимович (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2006-05-31
публикация патента:

Изобретение относится к пищевой, микробиологической промышленности, а именно к способам извлечения биологических препаратов из цианобактерий, и может быть использовано для обогащения пищевых продуктов и получения биологически активных веществ. Способ включает водную экстракцию, фракционную преципитацию сернокислым аммонием концентрацией от 20 до 70% от насыщения, по завершению каждой стадии проводят центрифугирование с отделением белкового осадка, обработку которого далее осуществляют на диэтиламиноэтиловом активированном носителе методом ионообменной хроматографии, с последующей обработкой на мембранной установке до содержания солей не более 5% и сушкой готового продукта до влажности не более 3%. В качестве цианобактерий берут сухую биомассу спирулины, обогащенную селеном, хромом и другими эссенциальными микроэлементами. Изобретение позволяет упростить и снизить себестоимость готового продукта и получить белковый препарат с высокой степенью очистки, содержащий при этом фикоцианин и эссенциальные микроэлементы, получить продукт как источник этих микроэлементов и (или) пищевого красителя, допускающее применение в промышленных масштабах и приводящее к получению высокоочищенного препарата фикоцианина. 4 з.п. ф-лы, 6 табл., 2 ил. способ получения белкового препарата из цианобактерий, патент № 2320195

Рисунки к патенту РФ 2320195

способ получения белкового препарата из цианобактерий, патент № 2320195 способ получения белкового препарата из цианобактерий, патент № 2320195

Изобретение относится к пищевой, микробиологической промышленности, а именно к способам извлечения биологических препаратов из цианобактерий, и может быть использовано для обогащения пищевых продуктов и получения биологически активных веществ.

В настоящее время известны способы получения белковых препаратов, в том числе способ выделения фикоцианина из биомассы водорослей.

Известен способ, в котором выделение белковой фракции проводят, осаждая фикоцианин из водного экстракта биомассы под действием риванола. Данный способ не применим в пищевой промышленности, поскольку риванол не относится к числу веществ (пищевых добавок), которые можно использовать в составе пищевой продукции. (Minkova K.М., Tchernov A.A., Tchorbadjieva M.I., et al., Purification of C-phycocyanin from Spirulina (Arthrospira) fusiformis. // J. Biotechnol. - 2003. - V.102, N 1. - P.55-59.)

Известен способ, включающий выделение фикоцианина из сине-зеленой водоросли с использованием стадий хроматографии на гидроксиапатите и сефакриле HR-200. (Li В., Zhang X., Gao M., Chu X. Effects of CD59 on antitumoral activities of phycocyanin from Spirulina platensis // Biomed Pharmacother. - 2005. - V.59, N 10. - P.551-560.)

Указанный способ также трудно использовать при получении фикоцианина в крупных масштабах ввиду его низкой производительности.

Наиболее близким аналогом к заявленному способу является способ получения белкового препарата из цианобактерий, включающий одностадийную обработку цельного экстракта [микроводоросли] путем экстракции, преципитации сернокислым аммонием, за чем следует ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-сефарозой Cl-6В. Чистый фикоцианин был получен из Spirulina, Phormidium и Lyngbya с отношением D620/D280, характеризующим чистоту препарата; равным соответственно 4.42, 4.43 и 4.59 (Patel A, Mishra S, Pawar R, Ghosh PK. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. // Protein Expr. Purif. - 2005. - V.40, N 2. - P.248-255).

Способ охарактеризован авторами как «одностадийный», тогда как на самом деле имеется не менее 3 стадий (экстракция, преципитация сернокислым аммонием и хроматография на ДЭАЭ-сефарозе). Кроме того, в неявном виде проводятся еще не менее двух стадий диализа для удаления сернокислого аммония и других солей, применяемых при выделении. Поэтому «одностадийность» не может рассматриваться как преимущество метода.

Применяется метод колоночной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе, который позволяет получить препарат очень высокой чистоты (которая не требуется для целей пищевого использования фикоцианина). При этом данная стадия малопроизводительна, требует сложного специального оборудования (промышленные колонки, насосы, детекторы, градиентные смесители), что в итоге приводит к сильному удорожанию продукта.

Технической задачей заявленного изобретения является упрощение способа, снижение себестоимости готового продукта и получение белкового препарата с высокой степенью очистки, содержащего при этом фикоцианин и эссенциальные микроэлементы, и, кроме того, получение продукта как источника этих микроэлементов и (или) пищевого красителя, допускающее применение в промышленных масштабах и приводящее к получению очищенного препарата фикоцианина с содержанием основного вещества не менее 40% и величиной D620/D280 не менее 2,0.

Поставленная задача решается в способе получения белкового препарата из цианобактерий, включающем водную экстракцию, постадийную преципитацию сернокислым аммонием и обработку на диэтиламиноэтиловом активированном носителе, при этом в качестве цианобактерий берут сухую биомассу спирулины, обогащенную эссенциальными микроэлементами, проводят постадийную преципитацию сернокислым аммонием в количестве от 20 до 70% от насыщения, по завершению каждой стадии проводят центрифугирование с отделением белкового осадка, обработку которого далее осуществляют на диэтиламиноэтиловом активированном носителе методом ионообменной хроматографии, с последующей обработкой на мембранной установке до содержания солей не более 5% и сушкой готового продукта до влажности не более 3%.

В качестве цианобактерий берут сухую биомассу спирулины, обогащенную селеном, хромом и другими эссенциальными микроэлементами.

Кроме того, проводят не менее 4 стадий преципитаций и дополнительно перед обработкой на диэтиламиноэтиловом активированном носителе методом ионообменной хроматографии белковую фракцию обрабатывают буферным раствором до получения рН 4,0-4,2.

В настоящее время широкое распространение получает использование в питании человека различных продуктов, получаемых биотехнологическим путем. В их числе продукты на основе биомассы микроводорослей, таких как спирулина (Arthrospira spp.). Спирулина характеризуется высоким (более 60%) содержанием биологически полноценного белка, эссенциальных полиненасыщенных жирных кислот (гамма-линоленовая кислота), микроэлементов (железо), витаминов. В результате выращивания спирулины в присутствии минеральных солей селена, йода, цинка, меди, марганца, хрома можно получить биомассы, дополнительно обогащенные этими микроэлементами в органически связанной, легко усваиваемой в организме и малотоксичной форме.

Использование спирулины в питании имеет определенные ограничения, связанные с ее органолептическими свойствами: специфическим вкусом и запахом продукта, наличием у некоторых людей его индивидуальной непереносимости. Предлагаемый способ позволяет получать белковые препараты, обладающие повышенной пищевой ценностью и улучшенными органолептическими и функциональными свойствами.

Белковый препарат, полученный заявленным способом, содержит достаточное количество такого компонента, как фикоцианин. Фикоцианин - белок, входящий в состав фотосинтезирующих пигментных комплексов спирулины - фикобилисом. В составе биомассы спирулины он представлен несколькими изоформами, включая аллофикоцианин и С-фикоцианин. Последний является преобладающим в количественном отношении. Его содержание может составлять по разным данным от 4 до 9% по массе сухих веществ спирулины. С-фикоцианин состоит из 2 типов субъединиц молекулярной массой 17-21 кД, организованных в нативном белке в гексамерный комплекс. Каждая субъединица содержит ковалентно связанный хромофор фикоцнанобилин, определяющий его биологическую активность. Структура фикоцианобилина приведена на фиг.1. Как видно из этой структуры, фикоцианобилин является веществом, родственным билирубину сыворотки крови, и, подобно ему, обладает свойствами гасителя свободных радикалов. Благодаря этому фикоцианин является активным пищевым антиоксидантом и демонстрирует комплекс физиологических эффектов, к числу которых относятся:

- индукция апоптоза опухолевых клеток и подавление их пролиферации;

- селективное ингибирование циклооксигеназы-2;

- подавление апоптоза, вызванного вирусной инфекцией;

- снижение концентрации фактора некроза опухоли в тканях,

- снижение содержания в воспаленных тканях медиаторов воспаления: гистамина, простагландинов, лейкотриенов;

- ингибирование окислительного стресса клетки за счет способности реагировать с разнообразными свободными радикалами, а также пероксинитритом;

- предотвращение перекисного окисления липидов, повреждения ДНК, разрушения клеточных мембран и гибели клетки.

Фикоцианин известен как пищевой краситель. Он обладает интенсивным максимумом поглощения в видимой области спектра при длине волны 620 нм, вследствие чего растворы фикоцианина достаточно высокой степени очистки имеют интенсивно синий («васильковый») цвет. Такой белковый препарат можно использовать, например, в напитках для цвета. Другие окрашенные компоненты спирулины, в том числе хлорофиллы, каротиноиды, ухудшают чистоту этого цвета, сдвигая его в сторону зеленого или желто-зеленого. Кроме того, использование препаратов фикоцианина с большим количеством балластных белков в качестве компонента жидких продуктов затруднено наличием значительного пенообразования. Вследствие этого для использования в качестве натурального пищевого красителя фикоцианин должен быть достаточно глубоко очищен. Показателем степени очистки является величина отношения оптических плотностей раствора при двух длинах волн D620/D280. В цельном водном экстракте биомассы этот показатель составляет величину порядка 0,3-0,4, что соответствует содержанию фикоцианина 6-8% от общего белка. В фикоцианине 100%-ной чистоты этот показатель составляет 4,98. Однако для использования в пищевой промышленности препарата фикоцианина его отношение D620/D280 должно быть не меньше 2 (что соответствует содержанию основного вещества 40%).

Способ осуществляют следующим образом.

Сухую биомассу спирулины, обогащенную эссенциальными микроэлементами, взвешивают и добавляют от 9 до 11 частей очищенной (дистиллированной или деионизованной) воды на 1 часть массы спирулины. Смесь перемешивают мешалкой в течение не менее 16 часов, после чего осаждают нерастворимый в воде остаток центрифугированием при ускорении не менее 3500 g. К надосадочной жидкости добавляют сернокислый аммоний в количестве от 20 до 30% от насыщения (от 140 до 210 г на 1 литр белкового раствора). Смесь выдерживают не менее 30 минут, после чего центрифугируют при ускорении не менее 3500 g до полного осаждения нерастворимой фракции. К надосадочной жидкости добавляют сернокислый аммоний до количества от 45 до 55% от насыщения (от 140 до 210 г на 1 литр надосадочной жидкости), после чего центрифугируют как указано выше. Осадок белков растворяют в минимально возможном количестве воды и переосаждают не менее 2 раз сернокислым аммонием в количестве от 45 до 70% от насыщения. Окончательный белковый осадок растворяют в минимальном количестве воды и удаляют соль путем обработки на мембранной установке (методом диализа или диафильтрации), обеспечивающей удаление не менее 98% солей. В растворе белков устанавливают величину рН от 4,0 до 4,2 путем добавления соответствующего буферного раствора. Смесь центрифугируют как указано выше, осадок белков растворяют в ацетатном буфере с рН 5,2 концентрацией не ниже 0,01 и не выше 0,06 М, содержащем не менее 0,01 и не более 0,05 М хлористого натрия, и добавляют ДЭАЭ-активированный носитель (целлюлоза или сефароза или сефадекс или их аналог) в количестве не менее 100 см3 на 1 г сухих веществ препарата). Жидкую фракцию удаляют на фильтре, носитель с адсорбированным фикоцианином промывают не менее 3 раз ацетатным буфером вышеуказанного состава, жидкость полностью удаляют на фильтре и добавляют равное (по объему носителя) количество ацетатного буфера рН 5,2, содержащего не менее 0,4 и не более 0,6 М хлористого натрия.

Жидкую фракцию отделяют на фильтре, промывают носитель не менее двух раз указанным буфером, фильтраты объединяют и добавляют к ним сернокислый аммоний в количестве от 45 до 70% от насыщения. Белки осаждают центрифугированием.

Осадок белков диспергируют в минимальном количестве воды и освобождают от солей путем обработки на мембранной установке, до содержания солей не более 5%. Окончательный раствор высушивают методом лиофильной сушки до содержания влаги в продукте не более 3% по массе. Сухой продукт представляет собой белковый продукт с содержанием фикоцианина 50-60%. Продукт готов для введения в любые пищевые продукты, как жидкие, так и любой другой консистенции.

Пример 1. Навеску 50 г сухой биомассы хромсодержащей спирулины помещают в стеклянный стакан объемом 1000 см3 и добавляют 500 см 3 дистиллированной воды. Смесь помещают на магнитную мешалку и подвергают интенсивному перемешиванию в течение 16 часов. Смесь центрифугируют при ускорении 3900 g в течение 1 часа в центрифуге с охлаждением до +4°С. Осадок удаляют, а супернатант объемом 370 см3 охлаждают до 0°С в бане со льдом и к нему добавляют 123 см3 насыщенного при 0°С раствора сернокислого аммония (НСА), что составляет 25% доли насыщенного раствора сернокислого аммония. Далее смесь центрифугируют при ускорении 3900 g и температуре +4°С. Осадок (темно-зеленого цвета) удаляют. К супернатанту (сине-зеленого цвета) объемом 465 см3 добавляют 247 см 3 НСА. Смесь центрифугируют при 3900 g и температуре +4°С. Супернатант объемом 510 см3 - мутный, желто-зеленого цвета удаляют, а осадок интенсивно синего цвета диспергируют в минимально возможном количестве дистиллированной воды. После диспергирования осадка объем смеси составил 350 см 3, его переносят в стакан объемом 1000 см 3 и смешивают с равным объемом - 350 см 3 НСА, что соответствует 50% доли насыщенного раствора сернокислого аммония.

Смесь центрифугируют при 3900 g и температуре +4°С. Супернатант объемом 500 см 3 лимонно-желтого цвета удаляют. С осадком (интенсивно синего цвета) процедура растворения в воде, осаждения НСА и центрифугирования повторяют еще 2 раза как описано выше. Последовательные супернатанты были соответственно бледно-желтым и бесцветным. Они были удалены. Окончательный осадок (после третьего переосаждения) диспергируют в воде с добавлением ЭДТА, его объем составил 330 см 3. Этот раствор помещают в мешочки из целлофановой мембраны и подвергают диализу против дистиллированной воды в стеклянной банке (диализаторе) объемом 3000 см3 на магнитной мешалке в холодильнике при температуре +4°С. Диализат (бесцветный) удаляют, а ретентат (интенсивно синего цвета) центрифугируют 1 час при 3900 g и температуре +4°С. Незначительный осадок (черного цвета с зеленоватым оттенком) удаляют, супернатант, имеющий объем 385 см3, разливают порциями по 80-100 см3 в стеклянные банки объемом 500 см3, замораживают в морозильной камере при температуре -18°С и подвергают сублимационной вакуумной сушке при комнатной температуре. Масса продукта после высушивания 7,8 г.

150 см3 ДЭАЭ-сефарозы переносят на стеклянный фильтр диаметром 10 см и 5-кратно отмывают объемом 100 см3 ацетатного буфера 0,05 М рН 5,2, с 0,05 М хлористого натрия на колбе Бюхнера над вакуумом. Отмытую смолу переносят в стеклянный флакон на 500 см 3. Навеску 1 г лиофильно высушенной белковой фракции биомассы спирулины, содержащей фикоцианин, растворяют в 100 см 3 вышеуказанного буфера. Раствор вносят во флакон с ДЭАЭ-сефарозой и помещают на встряхиватель. Содержимое флакона далее переносят на стеклянный фильтр, и смолу дробно отмывают порциями по 150 см3 вышеуказанного буфера. Фильтрат - пенящаяся мутная жидкость желто-зеленого цвета - удаляется. На фильтре остается окрашенная фикоцианином смола интенсивно-синего цвета. Смолу, собранную с фильтра, переносят в стеклянный флакон на 500 см3 и добавляют 200 см 3 ацетатного буфера 0,05 М рН 5,2 с 0,4 М хлористым натрием. Содержимое флакона далее переносят на стеклянный фильтр. Смола далее однократно промыта 200 см3 того же буфера и фильтраты объединены. Объем объединенного фильтрата - 380 см3. К полученному фильтрату добавляют 134,1 г безводного сернокислого аммония. Смесь осторожно перемешивают до полного растворения соли, после чего центрифугируют при ускорении 3900 g и температуре +4°С. Супернатант удаляют, а осадок диспергируют в минимальном объеме дистиллированной воды. Этот раствор помещают в мешочек из целлофановой мембраны и подвергают диализу в течение 24 часов против дистиллированной воды. Диализат (бесцветный) удаляют, ретентат (интенсивно синего цвета) подвергают сублимационной вакуумной сушке при комнатной температуре в темноте. Масса продукта после высушивания 0,160 г.

В результате осуществления способа получили белковый препарат с содержанием фикоцианина и хрома, пригодным для обогащения питьевого напитка.

Пищевая ценность, функциональные и органолептические показатели полученного препарата: характеризуется величиной D620/D280=2,18, что достаточно для его использования в качестве пищевого красителя, содержание фикоцианина 43% по массе продукта, содержание общего белка в препарате 90%, содержание золы 7% и влажность 3%, препарат представляет собой аморфный порошок темно-синего цвета, без вкуса и лишенный свойственного спирулине запаха, легко растворимый в воде с образованием раствора интенсивно синего цвета.

Достигнута очистка фикоцианина в 4,8 раза с выходом по пигменту (фикоцианобилину), равным 45% по отношению к цельному экстракту биомассы.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве качестве цианобактерий берут сухую биомассу спирулины, обогащенную селеном.

В результате осуществления способа получили белковый препарат с содержанием фикоцианина и селена, пригодного для обогащения пищевых продуктов, в том числе напитков.

Пищевая ценность, функциональные и органолептические свойства полученного препарата характеризуются величиной D620/D280=2,9, что достаточно для его использования в качестве пищевого красителя, содержание фикоцианина 58% по массе продукта, содержание общего белка в препарате 90%, содержание золы 7% и влажность 3%, препарат представляет собой аморфный порошок темно-синего цвета, без вкуса и лишенный свойственного спирулине запаха, легко растворим в воде с образованием раствора интенсивно синего цвета. Содержание селена в сухом продукте по данным определения микрофлуориметрическим методом составило 94±4 мкг/г.

Таким образом, суточная потребность взрослого человека в селене удовлетворяется 0,7 г сухого продукта.

Достигнута очистка фикоционина в 4,8 раза с выходом по пигменту (фикоцианобилину), равным 45% по отношению к цельному экстракту биомассы.

Пример 3. Навеску 50 г сухой биомассы хромсодержащей спирулины помещают в стеклянный стакан объемом 1000 см3 и добавляют 500 см 3 дистиллированной воды. Смесь подвергают интенсивному перемешиванию в течение 16 часов при температуре +4°С в холодильнике. Смесь центрифугируют при ускорении 3900 g в течение 1 часа в центрифуге с охлаждением до +4°С. Осадок удаляют, супернатант объемом 370 см охлаждают до 0°С в бане со льдом и к нему добавляют 123 см3 насыщенного при 0°С раствора сернокислого аммония (НСА), что соответствует 25% доли насыщенного раствора сернокислого аммония. Далее смесь центрифугируют при ускорении 3900 g и температуре +4°С. Осадок (темно-зеленого цвета) удаляют. К супернатанту (сине-зеленого цвета) объемом 465 см3 добавляют 247 см 3 НСА. Смесь центрифугируют при 3900 g и температуре +4°С. Супернатант объемом 510 см3 - мутный, желто-зеленого цвета - удаляют, осадок интенсивно синего цвета диспергируют в минимально возможном количестве дистиллированной воды. После диспергирования осадка объем смеси составил 350 см 3. Он перенесен в стакан объемом 1000 см 3 и смешан с равным объемом - 350 см3 НСА, что составляет 50% доли насыщенного раствора сернокислого аммония. Смесь центрифугируют при 3900 g и температуре +4°С. Супернатант объемом 500 см3 лимонно-желтого цвета удаляют. С осадком (интенсивно синего цвета) процедура растворения в воде, осаждения НСА и центрифугирования повторена еще 2 раза, как описано выше. Последовательные супернатанты были соответственно бледно-желтым и бесцветным. Они были удалены. Окончательный осадок (после третьего переосаждения) диспергирован в воде с добавлением ЭДТА, его объем составил 330 см 3. Этот раствор помещен в мешочки из целлофановой мембраны и подвергнут диализу против дистиллированной воды в стеклянной банке (диализаторе) объемом 3000 см3 на магнитной мешалке в холодильнике при температуре +4°С. Диализат (бесцветный) удаляют, ретентат (интенсивно синего цвета) центрифугируют 1 час при 3900 g и температуре +4°С. Незначительный осадок (черного цвета с зеленоватым оттенком) удаляют, супернатант, имеющий объем 385 см, разливают порциями по 80-100 см 3 в стеклянные банки объемом 500 см3 , заморожен в морозильной камере при температуре -18°С и подвергнут сублимационной вакуумной сушке при комнатной температуре. Масса продукта после высушивания 7,8 г.

Навеску 1 г лиофильно высушенной белковой фракции биомассы спирулины, содержащей фикоцианин, растворяют в 90 см воды и добавляют при охлаждении в бане со льдом 10 см3 1 М ацетатного буфера рН 4,0. Смесь выдерживают 30 минут, после чего центрифугируют при 3900 g и температуре +4°С. Супернатант отбрасывают, осадок растворяют в 200 см3 0,05 M ацетатного буфера рН 5,2 с 0,05 М хлористым натрием. В раствор добавляют (при комнатной температуре) 100 см3 ДЭАЭ-сефарозы (производства Pharmacia, Швеция), предварительно 5-кратно отмытой объемами по 100 см3 ацетатного буфера 0,05 М рН 5,2 с 0,05 М хлористого натрия. Смесь переносят во флакон на 500 см3 и помещают на встряхиватель. Содержимое флакона далее переносят на стеклянный фильтр, и смолу дробно отмывают порциями по 150 см3 вышеуказанного буфера. Фильтрат - жидкость бледно-зеленого цвета отброшен. На фильтре остается окрашенная фикоцианином смола интенсивно-синего цвета. Смолу собирают с фильтра, переносят в стеклянный флакон на 500 см3 и добавляют 200 см 3 ацетатного буфера 0,05 М рН 5,2 с 0,4 М хлористым натрием. Содержимое флакона далее перенесено на стеклянный фильтр и фильтрат отделен на воронке Бюхнера над вакуумом. Смола далее двукратно промыта 100 см3 того же буфера и фильтраты объединены. Объем объединенного фильтрата - 400 см 3. К полученному фильтрату добавлено при охлаждении в бане со льдом 141 г безводного сернокислого аммония. Смесь осторожно перемешивают до полного растворения соли и далее центрифугируют при ускорении 3900 g и температуре +4°С. Супернатант удаляют, осадок диспергируют в минимальном объеме дистиллированной воды. Этот раствор помещают в мешочек из целлофановой мембраны и подвергают диализу в течение 24 часов против дистиллированной воды. Диализат (бесцветный) отброшен, ретентат (интенсивно синего цвета) подвергнут сублимационной вакуумной сушке при комнатной температуре в темноте.

Полученный препарат фикоцианина из хромсодержащей спирулины пригоден для непосредственного использования в качестве пищевого красителя.

Пищевая ценность и функциональные свойства полученного препарата: характеризуется величиной D620/D280=2,9, что достаточно для его использования в качестве пищевого красителя, содержание фикоцианина 59% по массе продукта, содержание общего белка в препарате 90%, содержание золы 7% и влажность 3%, препарат представляет собой аморфный порошок темно-синего цвета, без вкуса и лишенный свойственного спирулине запаха, легко растворимый в воде с образованием раствора интенсивно синего цвета.

Достигнута очистка фикоцианина в 7,2 раза с выходом по пигменту (фикоцианобилину), равным 58% по отношению к цельному экстракту биомассы. Масса продукта после высушивания 0,150 г.

В результате очистки с использованием стадии сдвига рН удается повысить чистоту препарата фикоцианина с 43 до 59% и увеличить выход целевого продукта с 45 до 58%.

Таблица 1
Стадии фракционирования белка из хромсодержащей спирулины
№№ п/п СтадияОбъем см 3Число оптических единиц на весь образецОтношение D 620/D280 Выход по D280 % Выход по D620 % Содержание фикоцианина г на весь образец ИФА Выход фикоцианина по данным ИФА в % Кратность очистки по отношению D620/D 280
D280 D620
1Экстракт биомассы, осветленный центрифугированием370 41400170000,41 100100 3,71001
2Супернатант после 1-го осаждения НСА465 40900174000,43 99102 4,571231,05
3Осадок после 2-го осаждения НСА35029700 164000,55 71963,68 981,3
4 Осадок после 1-го переосаждения НСА 3102720016300 0,6065 963,1084 1,46
5Осадок после 2-го переосаждения НСА260 24500161000,66 5994 2,9781,6
6Осадок после 3-го переосаждения НСА330 21800155100,72 5391 2,7731,76
7Ретентат после диализа 38524700 152000,6260 892,2360 1,51

Таблица 2
Результаты фракционирования содержащей фикоцианин белковой фракции из биомассы хромсодержащей спирулины методом объемной ("batch") хроматографии на анионообменной смоле ДЭАЭ-сефарозе.
№№ п/п СтадияОбъем см 3Число оптических единиц на весь образецОтношение D 620/D280 Выход по D280 % Выход по D620 % Кратность очистки по отношению D620/D 280Содержание фикоцианина в образце %1
D280D 620
1 Белковая фракция, полученная методом сульфатаммонийного фракционирования по примеру №1, лиофилизованная100 209014400,69 100100 113,8
2 Препарат, очищенный на ДЭАЭ-сефарозе 25337737 2,181651 3,1543,7
1 Рассчитано по данным работы Bhaskar S.U., в которой для очищенного фикоцианина получено отношение D 620/D280, равное 4,98

Таблица 3
Результаты фракционирования содержащей фикоцианин белковой фракции из биомассы хромсодержащей спирулины методом сдвига рН (в аналитических масштабах)
№№ п/п Стадия Объем см3 Число оптических единиц на весь образец Отношение D620/D280 Выход по D280 %Выход по D620 %Содержание фикоцианина в образце %1Кратность очистки по отношению D620/D 280
D280 D620
1Белковая фракция, полученная методом сульфатаммонийного фракционирования по примеру №1, лиофилизованная 2,13,25 2,00,61100 10012,21
2Препарат, очищенный методом сдвига рН3,0 2,281,90,83 709516,7 1,36
1 Рассчитано по данным работы Bhaskar S.U., в которой для очищенного фикоцианина получено отношение D620 /D280, равное 4,98

Таблица 4
Стадии фракционирования белка из селенсодержащей спирулины
№№ п/п СтадияОбъем см 3Число оптических единиц на весь образецОтношение D 620/D280 Выход по D280 % Выход по D620 % Содержание фикоцианина г на весь образец ИФА Выход фикоцианина по данным ИФА в %1 Кратность очистки по отношению D 620/D280
D280D 620
1 Экстракт биомассы, осветленный центрифугированием 3904940020300 0,41100 1001,83100 1
2Супернатант после 1-го осаждения НСА500 45000188000,42 9192 1,861021,02
3Осадок после 2-го осаждения НСА33031300 178000,57 63881,54 841,35
4 Осадок после 1-го переосаждения НСА 3802850017900 0,6357 881,7193 1,53
5Осадок после 2-го переосаждения НСА360 25600169000,66 5183 1,51821,61
6Осадок после 3-го переосаждения НСА300 31500201000,64 6399 1,57851,56
7Ретентат после диализа 33023400 168000,7247 83-- 1,76

Таблица 5
Результаты фракционирования содержащей фикоцианин белковой фракции из биомассы селенсодержащей спирулины методом объемной ("batch") хроматографии на анионообменной смоле ДЭАЭ-сефарозе
№№ п/п СтадияОбъем см 3Число оптических единиц на весь образецОтношение D 620/D280 Выход по D280 % Выход по D620 % Содержание фикоцианина в образце %1 Кратность очистки по отношению D 620/D280
D280D 620
1 Белковая фракция, полученная методом сульфатаммонийного фракционирования по примеру №1, лиофилизованная80 568040800,72 100100 14,41
2 Препарат, очищенный на ДЭАЭ-сефарозе 2004901440 2,938,635 58,84,1
1 Рассчитано по данным работы Bhaskar S.U., в которой для очищенного фикоцианина получено отношение D 620/D280, равное 4,98

Таблица 6
Результаты повторного фракционирования содержащей фикоцианин белковой фракции из биомассы селенсодержащей спирулины методом объемной ("batch") хроматографии на анионообменной смоле ДЭАЭ-сефарозе
№№ п/пСтадия Объем см3 Число оптических единиц на весь образец Отношение D620/D280 Выход по D280 %Выход по D620 %Содержание фикоцианина в образце, %1Кратность очистки по отношению D620/D 280
D280 D620
1Белковая фракция, полученная методом сульфатаммонийного фракционирования по примеру №1, лиофилизованная 604260 30600,72100 10014,41
2Препарат, очищенный на ДЭАЭ-сефарозе230 48313802,86 11,34557,4 4,0
1 Рассчитано по данным работы Bhaskar S.U., в которой для очищенного фикоцианина получено отношение D620 /D280, равное 4,98

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения белкового препарата из цианобактерий, включающий водную экстракцию, преципитацию сернокислым аммонием и обработку на диэтиламиноэтиловом активированном носителе, отличающийся тем, что в качестве цианобактерий берут сухую биомассу спирулины, обогащенную эссенциальными микроэлементами, проводят постадийную преципитацию сернокислым аммонием в количестве от 20 до 70% от насыщения, по завершению каждой стадии проводят центрифугирование с отделением белкового осадка, обработку которого осуществляют на диэтиламиноэтиловом активированном носителе методом ионообменной хроматографии, с последующей обработкой на мембранной установке до содержания солей не более 5% и сушкой готового продукта до влажности не более 3%.

2. Способ получения белкового препарата из цианобактерий по п.1, отличающийся тем, что в качестве цианобактерий берут сухую биомассу спирулины, обогащенную селеном.

3. Способ получения белкового препарата из цианобактерий по п.1, отличающийся тем, что в качестве цианобактерий берут сухую биомассу спирулины, обогащенную хромом.

4. Способ получения белкового препарата из цианобактерий по п.1, отличающийся тем, что проводят не менее 4-х стадий преципитации.

5. Способ получения белкового препарата из цианобактерий по п.1, отличающийся тем, что дополнительно перед обработкой на диэтиламиноэтиловом активированном носителе методом ионообменной хроматографии белковую фракцию обрабатывают буферным раствором до получения рН 4,0-4,2.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2320195

patent-2320195.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A23J3/20 белки из микроорганизмов или одноклеточных водорослей

Патенты РФ в классе A23J3/20:
дрожжевой экстракт, содержащий двунатриевую соль инозината и двунатриевую соль гуанилата, и способ его получения -  патент 2456347 (20.07.2012)
способ получения пищевого белка, обогащенного биологически активными компонентами -  патент 2353099 (27.04.2009)
способ выделения экзолектинов из гриба-базидиомицета -  патент 2345132 (27.01.2009)
способ получения аминокислотного гидролизата -  патент 2277795 (20.06.2006)
способ получения съедобного биологически активного полуфабриката и съедобный биологически активный полуфабрикат, полученный этим способом -  патент 2231271 (27.06.2004)
способ получения съедобного биологически активного полуфабриката и съедобный биологически активный полуфабрикат, полученный этим способом -  патент 2230465 (20.06.2004)
способ получения биологически активного дрожжевого автолизата для посола мяса -  патент 2207759 (10.07.2003)
биостимулирующая кормовая добавка -  патент 2189762 (27.09.2002)
способ получения биологически активного пищевого полуфабриката и пищевой биологически активный продукт, полученный на его основе -  патент 2181018 (10.04.2002)
способ получения йодированного пищевого продукта -  патент 2134520 (20.08.1999)

Класс A23J3/32 с использованием химических веществ

Класс C12N1/12 одноклеточные водоросли; питательные среды для них

Патенты РФ в классе C12N1/12:
планктонный штамм водорослей parachlorella nurekis и его применение для уничтожения цианобактерий -  патент 2527895 (10.09.2014)
штамм микроводоросли chlorella vulgaris для получения липидов в качестве сырья для производства моторного топлива -  патент 2508398 (27.02.2014)
фотобиореактор -  патент 2508396 (27.02.2014)
способ получения биомассы зеленых микроводорослей, обогащенной жирными кислотами -  патент 2507251 (20.02.2014)
фотосинтезированные микроорганизмы, обогащенные селеном из селенсодержащих гидроксикислот, их применение в пище, косметике и фармации -  патент 2504578 (20.01.2014)
способ культивирования микроводорослей биотопливного назначения -  патент 2497944 (10.11.2013)
установка для выращивания планктонных водорослей -  патент 2485174 (20.06.2013)
золотистые водоросли и способ их производства -  патент 2478700 (10.04.2013)
способ извлечения биологически активных веществ из биомассы одноклеточной водоросли рода chlorella -  патент 2460771 (10.09.2012)
способ мониторинга распределения диатомовых микроводорослей в японском море -  патент 2460770 (10.09.2012)

Класс C09B61/00 Красители природного происхождения, получаемые из природных сырьевых материалов

Патенты РФ в классе C09B61/00:
способ получения пищевого концентрата полифенолов винограда -  патент 2529836 (27.09.2014)
способ получения натурального смесевого каротиноидно-антоцианового красителя -  патент 2516637 (20.05.2014)
способ получения антоцианового красителя из выжимок темных сортов ягод -  патент 2515478 (10.05.2014)
способ получения пищевого жирорастворимого красителя и пищевой жирорастворимый краситель (варианты) -  патент 2499015 (20.11.2013)
красители растительного происхождения и их применение в окрашенных композициях, в частности в косметических композициях -  патент 2492197 (10.09.2013)
красящая композиция для окрашивания пищевых продуктов, имитирующих крабовое мясо, и способ ее получения -  патент 2448136 (20.04.2012)
стабильные и биодоступные композиции изомеров ликопена для кожи и волос -  патент 2441398 (10.02.2012)
способ получения антоцианового красителя из выжимок темных сортов ягод -  патент 2426755 (20.08.2011)
полимерная окрашенная композиция -  патент 2420541 (10.06.2011)
пищевой синтетический краситель и способ его получения -  патент 2408631 (10.01.2011)

Наверх