рекомбинантная плазмида, экспрессирующая клонированный ген ace vibrio cholerae и штамм escherichia coli-продуцент accessory cholerae enterotoxin vibrio cholerae

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмида рАсе90, экспрессирующая клонированный ген асе (accessory cholera enterotoxin) Vibrio cholerae, встроенный по сайтам BamHI-HindIII в полилинкер векторной плазмиды pQE30, под контролем Т5-промотора.

2. Штамм Escherichia coli M15[pREP4]pAce90 (KM 194), несущий рекомбинантную плазмиду рАсе90 по п.1 - продуцент accessory cholera enterotoxin (Асе) Vibrio cholerae.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, медицинской микробиологии и может быть использовано для изучения свойств и биологической активности accessory cholera enterotoxin (Асе) Vibrio cholerae.

Исследования Асе требуют наличия его препаратов, наиболее перспективным способом получения которых является использование продуцентов - рекомбинантных штаммов кишечной палочки, содержащих клонированный ген асе.

Известен холерогенный штамм Vibrio cholerae E8946 (см. статью Trucksis М., Conn T.L., Wasserman S.S., Sears C.L. Vibrio cholerae ACE stimulates Ca ⁺ dependent Cl^-/НСО ₃ ^- secretion in T84 cells in vitro: American Journal of Cell Physiology, 279, 2000, C567-C577), из культуральной жидкости которого был выделен препарат Асе, представляющий собой термолабильный белок с молекулярной массой (ММ) 9 кДа, образующий димеры с ММ 18 кДа и обладающий способностью вызывать увеличение проницаемости культуры ткани кишечника в камерах Юссинга.

Недостатком известного продуцента является то, что кроме Асе он образует холерный токсин и множество биологически активных веществ, что значительно затрудняет отбор фракций, содержащих Асе, по биологической активности, а также необходимость соблюдения режима работы с возбудителями особо опасных инфекций, что возможно только в специализированных лабораториях учреждений противочумной системы.

Известен нехолерогенный рекомбинантный штамм Vibrio cholerae CVD110(pCVD630) (см. статью Trucksis M., Galen G.E., Michalski J. et al. Accessory cholera enterotoxin (Ace), the third toxin of a V.cholerae virulence cassette: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, 5267-5271), культуральная жидкость которого содержала Асе и вызывала накопление жидкости в изолированных петлях кишечника кролика и повышение тока короткого замыкания (I_sc) в ткани кишечника при исследовании в камерах Юссинга.

Однако использование этого продуцента также связано с необходимостью достижения высокой степени очистки Асе, что требует проведения многоступенчатого процесса с применением дорогостоящего оборудования.

За прототип выбран способ (см. статью Trucksis M., Conn T.L., Fasano A., Kaper J.B. Production of Vibrio cholerae accessory cholera enterotoxin (Ace) in the yeast Pichia pastoris: Infection and Immunity, 65, 1997, 4984-4988), заключающийся в клонировании и экспрессии гена асе холерного вибриона в составе хромосомной ДНК дрожжей Pichia pastoris.

Недостатком прототипа является длительный период его культивирования (36-48 часов) и необходимость использования в качестве индуктора крайне ядовитого метилового спирта, что сужает возможности его технологического использования.

Техническая задача изобретения - создание рекомбинантной плазмиды и штамма Escherichia coli, экспрессирующего клонированный ген accessory cholera enerotoxin (асе) Vibrio cholerae под контролем Т5-промотора, что обеспечивает ускоренное получение токсина.

Задача решается путем создания:

- новой рекомбинантной плазмиды рАсе90, экспрессирующей клонированный ген асе холерного вибриона в штаммах кишечной палочки;

- штамма Escherichia coli M15[pREP4]pAce90 - продуцента Асе холерных вибрионов посредством трансформации штамма Е.coli M15[pREP4] рекомбинантной плазмидой рАсе90.

На фиг.1 приведена схема векторной плазмиды pQE30 (QIAGEN), являющейся исходной для получения рекомбинантной плазмиды рАсе90.

На фиг.2 представлена схема конструирования рекомбинантной плазмиды рАсе90.

Плазмида pQE30 (см. фиг.1) несет ген устойчивости к ампициллину (bla) и содержит промоторно-операторную область, включающую Т5-промотор и два расположенных тандемом lac-оператора, обеспечивающих максимальную репрессию синтеза Асе в присутствии глюкозы, а также синтетический сайт связывания рибосомальной РНК, старт-кодон, последовательность триплетов, кодирующих синтез гексагистидина (6-His), полилинкер (MCS) и два терминатора транскрипции (t0 фага лямбда и Т1 из rrnB-оперона Е.coli). Экспрессия клонированных генов происходит при индукции изопропил- -D-тиогалактозидом (ИПТГ) и начинается с плазмидного старт-кодона, при этом образуется гибридный белок, перед первой аминокислотой которого располагается гексагистидиновый блок.

Плазмида рАсе90 представляет собой генно-инженерный вариант, полученный путем встраивания в вектор pQE30 гена асе V.cholerae O1 биовара eltor (см. фиг.2).

Будучи трансформирована в штаммы кишечной палочки Jm103 либо M15[pREP4], рекомбинантная плазмида экспрессирует клонированный ген под контролем Т5-промотора. Экспрессия гена подавляется в присутствии глюкозы и индуцируется ИПТГ.

Штамм E.coli M15[pREP4]pAce90 представляет собой генно-инженерный вариант, полученный путем трансформации рекомбинантной плазмиды рАсе90 в штамм E.coli M15[pREP4], и является продуцентом Асе V.cholerae. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под номером КМ 194.

Полученный штамм-продуцент характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические свойства

В жидких питательных средах (бульоне Хоттингера, мясо-пептонном бульоне) образует равномерную муть, на плотных - круглые, выпуклые, гладкие, белые полупрозрачные колонии с ровным краем, тестообразной консистенции.

Физиолого-биохимические свойства

Штамм разлагает с образованием кислоты и газа глюкозу, арабинозу и маннит, не разлагает сахарозу, на среде Эндо образует лактозонегативные колонии. Ауксотроф.

Устойчивость к антибиотикам

Штамм устойчив к 25-30 мкг/мл канамицина, что является следствием присутствия в исходном штамме плазмиды pREP4, и к 50-100 мкг/мл ампициллина за счет экспрессии гена bla, находящегося в составе векторной плазмиды pQE30.

Способ получения и использования рекомбинантной плазмиды и штамма-продуцента иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Клонирование гена асе и получение рекомбинантной плазмиды

Для ПЦР-синтеза гена асе используют праймеры, сконструированные заявителями на основе анализа нуклеотидной последовательности гена асе (AF 220606, AF 414369):

прямой - 5'-TTTTGGATCCGTGATGCTTATGATGGACAC-3' и

обратный - 5'-AAGAAAGCTTTAGGTTTAACGCTCGCAGGG-3'.

Поскольку амплификаты необходимо встроить в плазмидный вектор pQE30 в ориентации, обеспечивающей направление транскрипции под контролем Т5-промотора, на 5'-конце каждого праймера внесен сайт рестрикции для эндонуклеазы, образующей липкие концы: BamHI для прямого праймера и HindIII - для обратного (в приведенных последовательностях выделены жирным шрифтом и подчеркнуты) в соответствии с порядком расположения сайтов рестрикции в полилинкере векторной плазмиды.

Из штамма V.cholerae eltor 15500 фенольным методом выделяют хромосомную ДНК, которая служит матрицей для синтеза искомого гена.

300 мкл реакционной смеси для полимеразной цепной реакции содержат 0,5 нг ДНК-матрицы и следующие компоненты в указанных концентрациях: по 2,5 мкл каждого праймера, по 2,5 мМ всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 3 ед. Taq-полимеразы и 0,1 объема прилагаемого к ней 10-кратного буфера. Смесь разливают по 30 мкл в 0,5-мл пластиковые пробирки и осуществляют реакцию по следующей схеме: 94°С - денатурация (40 сек), 60°С - отжиг (40 сек), 72°С - синтез (40 сек). Всего проводят 30 циклов амплификации, в последнем цикле время синтеза увеличивают до 30 минут. По окончании реакции смесь подвергают электрофорезу в 0,7% агарозном геле в трис-ацетатном буфере в присутствии 0,5 мкг/мл бромистого этидия, затем просматривают в ультрафиолетовом свете, вырезают участок геля с амплифицированным фрагментом размером 311 п.н., выделяют последний элюцией, очищают смесью фенол: хлороформ: изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1 и осаждают этиловым спиртом.

Полученный таким образом ПЦР-амплификат и ДНК векторной плазмиды pQE30 гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII согласно рекомендациям фирмы - изготовителя ферментов, очищают в агарозном геле и лигируют с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и прилагаемого к ней буфера согласно рекомендациям изготовителя.

Лигазными смесями трансформируют компетентные клетки E.coli Jm103, приготовленные накануне обработкой хлористым кальцием. После стандартной процедуры трансформации (0°С - 40 мин, 42°С - 2 мин, 0°С - 5 мин) клетки разводят в 10 раз средой LB с 0,5% глюкозы, подращивают в течение 1 ч и высевают на агар LB, содержащий 50 мкг/мл ампициллина и 0,5% глюкозы. Посевы инкубируют при 37°С.

На следующие сутки выросшие ампициллинрезистентые колонии тестируют с помощью вышеприведенных праймеров и отбирают позитивные клоны, из которых выделяют плазмидную ДНК и подтверждают наличие вставок длиной 0,3 т.п.н. гидролизом этих плазмид эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII с последующим электрофорезом в агарозном геле.

Из штамма E.coli Jm103pAce90 выделяют плазмидную ДНК и трансформируют ей компетентные клетки E.coli M15[pREP4]. Рекомбинантные клоны отбирают на агаре LB, содержащим 50 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина.

Пример 2. Изучение экспрессии клонированного гена асе в E.coli

Для выявления способности рекомбинантов к синтезу Асе рекомбинантный штамм E.coli M15[pREP4]pAce90 (KM 194), а также контрольный штамм, содержащий векторную плазмиду pQE30 без вставки, выращивают в жидкой среде LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 3-4 ч при 37°С с шуттелированием при 150 об/мин и затем индуцируют 1 мМ ИПТГ в течение 1-2 ч, клетки осаждают центрифугированием, лизируют в буфере, содержащем 65 мМ трис-HCl рН 6,8, 1% SDS и 10 мМ 2-меркаптоэтанола, при температуре 96°С в течение 15 мин. Лизат подвергают электрофорезу в 16,5% ПААГ с SDS и окрашивают гель нитратом серебра. В лизате выявляется мажорная белковая полоса в области 13 кДа, отсутствующая в лизате контрольного штамма, что соответствует размеру искомого рекомбинантного белка, содержащего на N-конце гексагистидиновый блок. Процентное содержание 6His-белка определяют с помощью программы Quantity One, оно составляет 7-10% суммарных клеточных белков.

Пример 3. Изучение биологической активности препарата рекомбинантного белка Асе, полученного по примеру 1, in vivo

Осадок клеток, выращенных с индукцией ИПТГ, ресуспендируют в физилогическом растворе, разрушают ультразвуком на дезинтеграторе PG-100 MSE 150 W (Англия) с помощью конического стержня при частоте колебаний 20 кГц и амплитуде 12-16 мкм в течение 1 мин. Остатки клеток отделяют центрифугированием, а в прозрачных супернатантах (осветленных дезинтегратах) определяют содержание общего белка методом Лоури, доводят концентрацию до 500 мкг/мл и проводят тестирование на модели мышей-сосунков.

Животным весом 3-4 г (по 8 на каждый вариант) через задний проход вводят по 100 мкл препаратов (по 50 мкг общего белка на одно животное). Через 5 ч после введения животных умерщвляют и определяют FA (отношение веса желудка и кишечника к весу тела). Статистическую обработку результатов проводят с помощью программы "Primer of Biostatistics" v.4.03. Разница между FA контрольной и опытной групп должна быть статистически достоверной при Р<0,005.

Использование рекомбинантной плазмиды рАсе90 и штамма E.coli KM 194 позволит ускорить процесс получения белка Асе Vibrio cholerae для проведения широкомасштабных исследований его свойств и биологической активности. Дальнейшие исследования Асе с помощью продуцента, полученного заявителями, имеет принципиальное значение для оценки его роли в вирулентности и выяснения механизма действия на эукариотические клетки.

Рекомбинантный штамм E.coli KM 194 является перспективным в качестве продуцента Асе холерных вибрионов для изучения его биологического действия и влияния на активность других факторов вирулентности. Асе является единственным токсином, синтезируемым данным штаммом, поэтому в качестве препаратов могут быть использованы и неочищенные лизаты или дезинтеграты бактериальных клеток.

Преимуществом предлагаемого продуцента по сравнению с холерными вибрионами является также то, что его культивирование не требует соблюдения режима работы с возбудителями особо опасных инфекций.