штамм бактерий bacillus mucilaginosus, обладающий широким спектром фунгицидного действия, и биопрепарат на его основе
Классы МПК: | C12N1/20 бактерии; питательные среды для них A01N63/00 Биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, плесневые грибы, ферменты, сбраживающие материалы или вещества, полученные или экстрагированные из микроорганизмов или животных материалов |
Автор(ы): | Кандыба Екатерина Владимировна (RU), Назаров Абдынаби Ганиевич (RU) |
Патентообладатель(и): | Закрытое акционерное общество "Промышленно-инновационно-техническая компания "ПИТком" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2005-09-21 публикация патента:
20.12.2006 |
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 выделен из окультуренных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-8966. Биологический препарат, полученный на основе вышеуказанного штамма, предназначен для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям. Данная группа изобретений позволяет повысить урожайность сельскохозяйственных культур и их устойчивость к различным заболеваниям. Препарат может быть использован совместно с пестицидами в одной баковой смеси, что приводит к экономии горюче-смазочных материалов и снижению трудозатрат. 2 н.п. ф-лы, 5 табл.
Формула изобретения
1. Штамм бактерий Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, устойчивый к действию пестицидов, используемый для получения биологического препарата, предназначенного для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям.
2. Биологический препарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям, полученный путем 2-ступенчатой ферментации штамма бактерий Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, при этом первую ферментацию проводят на жидкой питательной среде Эшби с добавлением NH 4NO3 в течение 24-36 ч, а вторую - на среде Сурмана с мелассой в течение 48-60 ч, ферментации ведут при температуре (29±1)°C, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту, посевную культуру засевают из расчета 5-10% от объема питательной среды.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и микробиологии, в частности, к получению бактериальных препаратов, применяемых в растениеводстве для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям.
Известен штамм Bacillus mucilaginosus ВКПМ В-5987 (патент РФ №2081867, прототип) и препарат для получения бактериального удобрения, полученный на его основе.
Указанный штамм обладает способностью трансформировать нерастворимые и малорастворимые фосфаты в доступную для растений форму, а бактериальный препарат, полученный на его основе, повышает плодородие почвы, урожайность сельскохозяйственных культур, укореняемость черенков плодовых и декоративных культур.
Недостатком штамма является отсутствие у него антагонизма по отношению к фитопатогенным грибам и бактериям.
Технической задачей изобретения является получение нового штамма, способного трансформировать нерастворимые (малорастворимые) соединения фосфора и калия, обладающего широким спектром антагонистического действия и способного сохранять жизнеспособность в присутствии пестицидов, а также получение биопрепарата, который повышает урожайность сельскохозяйственных культур и их устойчивость к различным заболеваниям и может быть использован совместно с пестицидами.
Поставленная задача решается тем, что получен штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, на основе которого создан биологический препарат, повышающий урожайность сельскохозяйственных культур, их устойчивость к различным заболеваниям и который может быть использован совместно с пестицидами.
Штамм бактерий Bacillus mucilaginosus Вас-10 выделен из окультуренных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции по следующим признакам: технологичность (способность штамма расти в производственных условиях), хорошая продуктивность, в том числе и на регламентных средах, способность трансформировать нерастворимые (малорастворимые) соединения фосфора и калия, широкий спектр подавления фитопатогенной микрофлоры.
Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-8966.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки
При выращивании на картофельном агаре (масс.%: картофельный отвар - 98,0; агар - 2,0) и среде Александрова (масс.%: К2HPO4 - 0,2; MgSO4 - 0,05; FeCl2 - следы; сахароза - 0,5; силикаты - 0,1; СаСО3 - 0,01 (растирается с силикатами); агар - 2,0) при 29±1°С в течение 96 часов колонии светло-серые, гладкие с ровным краем, влажные, блестящие, слегка приплюснуты к поверхности агара, полный цикл развития завершается спорообразованием.
При выращивании на среде Сурмана с мелассой (масс.%: меласса - 0,5; К2HPO 4 - 0,03; MgSO4 - 0,01; NaCl - 0,05; KNO 3 - 0,1; СаСО3 - 1,0) при температуре 29±1°С в течение 48 часов культура представляет собой вязкую жидкость; при микроскопировании клетки крупные единичные палочки и споры до 120-180 млн./мл.
При выращивании на агаризованной среде Эшби (масс.%: сахароза - 2,0; К2HPO4 - 0,02; NaCl - 0,02; MgSO4 - 0,02; СаСО3 - 0,5; K2SO4 - 0,5; агар - 2,0) при температуре 29±1°С в течение 96 часов колонии выпуклые, бесцветные, прозрачные, слизистые, с ровным краем, вязкой консистенции, диаметром 3-5 мм.
При микроскопировании клетки неподвижные, крупные палочки правильной формы с округлыми концами, единичные.
На средах без источника азота (среда Эшби) споры не образуются. При перенесении вегетативных клеток со среды Эшби на картофельный агар или на среду Сурмана с мелассой способность к спорообразованию восстанавливается. Споры имеют овальную форму.
Размеры клеток варьируют при росте на различных питательных средах 1-1,4×4-7 мкм. Грамотрицательны, но окраска по Грамму может варьировать.
На МПА и МПБ рост отсутствует (иногда наблюдается очень слабое развитие).
Физиолого-биохимические признаки
Мезофил, рост возможен в интервале 15-35°С, оптимальная для роста и спорообразования температура 29±1°С.
Аэроб, при глубинной ферментации на жидкой питательной среде оптимальный режим аэрации-перемешивания 1 объем O2/1 объем питательной среды, что соответствует сульфитному числу 1.
Возможен рост при рН 5,5-8,0, оптимально для роста и спорообразования рН 6,8-7,2.
Отношение к источникам углеводов
Хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, лактозе, арабинозе, гидролизует крахмал. Плохо усваивает целлюлозу. Из спиртов усваивает маннит, глицирин, лактат. Не усваивает уксусную, молочную, янтарную, лимонную кислоты.
Отношение к источникам азота
В качестве источника азота может быть использован аммонийный азот, карбамид и нитраты.
Отношение к нерастворимым соединениям фосфора и калия
Штамм обладает способностью растворять силикаты, апатиты, трикальцийфосфат, нуклеонат натрия (табл.1).
Таблица 1. Влияние штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966 на нерастворимые фосфаты | ||
№№ п/п | Наименование показателя | Числовое значение показателя |
1 | Число жизнеспособных клеток (КОЕ) | 150 млн./мл |
2 | Накопление фосфора в жидкой культуре с внесением в среду (в пересчете на Р2O 5): | |
- нуклеонат натрия | 80,0 мг/мл | |
- трикальций фосфат | 21,0 мг/мл | |
- фторапатит | 4,0 мг/мл |
Отношение к фитопатогенным грибам и бактериям
Подавляет рост грибов Alternaria sp., Aspergilus niger, Pythium sp., Fusarium oxysporum, Penicillium citrinum, Penicillium expansum и бактерий Erwinia phytophtora, Rhizoctonia sp., Puccinia triticina, Erysiphe graminis, Septoria graminum, Actinomyces sp. Активность определяли методом «лунок» (Егоров Н.С. Микробы антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. М., «Высшая школа», 1965, с.131) через 3-6 суток роста тест-культур на диагностических средах (табл.2).
Таблица 2. Спектр антагонистической активности штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966 | |
Тест-культура | Зона подавления роста, мм |
Altemaria sp. | 4 |
Aspergilus niger | 3 |
Pythium sp. | 8 |
Fusarium oxysporum | 6 |
Penicillium citrinum | 5 |
Penicillium expansum | 5 |
Erwinia phytophtora | 4 |
Rhizoctonia sp. | 10 |
Puccinia triticina | 8 |
Erysiphe graminis | 7 |
Septoria graminum | 11 |
Actinomyces sp. | 4 |
Штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966 хранится на твердой питательной среде Эшби с добавлением NH4NO3 следующего состава, масс.%: сахароза - 2,0; К2HPO 4 - 0,02; NaCl - 0,02; MgSO4 - 0,02; NH 4NO2 - 0,02; СаСО3 - 0,5; K2 SO4 - 0,5; агар - 2,0. Температура выращивания 29±1°С, продолжительность выращивания 96 ч.
Штамм хранится в пробирках на скошенной агаризованной среде, при температуре 4±2°С до 3-х лет.
Таким образом, получен штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, имеющий следующие характерные особенности:
- хороший рост на производственных средах в условиях глубинной ферментации;
- способность трансформировать труднодоступный для растений фосфор и калий;
- широкий спектр подавления фитопатогенной микрофлоры в почве;
- способность сохранять активность при длительном хранении без лиофилизации при температуре 2-4°С.
Кроме того, показано (пример 4), что полученный штамм способен сохранять свою жизнеспособность в присутствии пестицидов, что позволяет использовать их в одной баковой смеси с препаратом, в основе которого лежит полученный штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966.
Биологический препарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям получен путем двухступенчатой ферментации штамма бактерий Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, при этом первую ферментацию проводят на жидкой питательной среде Эшби с добавлением NH4NO3 в течение 24-36 часов, а вторую - на среде Сурмана с мелассой в течение 48-60 часов, ферментации ведут при температуре 29±1°C, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту, посевную культуру засевают из расчета 5-10% от объема питательной среды.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение биологического препарата на основе штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966
Стерильную жидкую питательную среду состава, масс.%: сахароза - 2,0; К2HPO4 - 0,02; NaCl - 0,02; MgSO 4 - 0,02; NH4NO3 - 0,02; СаСО 3 - 0,5; K2SO4 - 0,5 в инокуляторе засевают посевной культурой из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивают в течение 30 часов при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту.
Полученной посевной культурой засевают ферментер с предварительно простерилизованной жидкой питательной средой, имеющей состав, масс.%: меласса - 0,5; К 2HPO4 - 0,03; MgSO4 - 0,01; NaCl - 0,05; KNO3 - 0,1; СаСО3 - 1,0, из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивание проводят при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту. Продолжительность выращивания 48 часов. Получают вязкую жидкую культуру, содержащую 180 млн. спор/мл.
В качестве готового продукта используют вязкую жидкую культуру Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966 с рН 7,5-7,8 и активностью КОЕ не менее 120 млн./мл.
Показано, что готовый продукт сохраняет свою активность в течение 9 месяцев при температуре от +4 до +30°С.
Готовый продукт фасуют в заранее простерилизованные канистры по 10 л и сдают на склад.
Пример 2. Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур.
Препарат, полученный по примеру 1, применяли для проведения испытаний в открытом грунте (площадь обработки 9 га, из расчета 200 мл/га):
- на озимой пшенице и ячмене в Курском НИИАПП (площадь обработки 9 га, обработка почвы перед посевом);
- на картофеле в Брянском филиале ВНИИКХ (обработка почвы перед посевом);
- на яровой пшенице и горохе в Казантуловском ОПХ (обработка посевов в фазе кущения и обработка почвы перед посевом соответственно) (см. табл.3).
Таблица 3. Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур | ||||
Обрабатываемые культуры | УРОЖАЙ, ц/га | Прибавка урожая | ||
контроль | препарат | ц/га | % | |
Озимая пшеница | 27,3 | 30,0 | 2,7 | 9,8 |
Яровая пшеница | 25,6 | 28,1 | 2,6 | 9,8 |
Ячмень | 19,1 | 21.4 | 2,3 | 12,0 |
Горох | 20,1 | 24,7 | 4,6 | 22,9 |
Картофель | 301,0 | 386,0 | 85,0 | 28,2 |
Данные испытаний, приведенные в табл.3, показывают, что препарат, полученный на основе штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, оказывает положительное влияние на урожайность ряда сельскохозяйственных культур.
Пример 3. Влияние препарата на степень поражения сельскохозяйственных культур болезнями.
В Козангуловском ОПХ определяли влияние препарата, полученного по примеру 1, на степень поражения болезнями гороха и яровой пшеницы.
Обработку посевов проводили препаратом на площади 10 га. Из расчета 200 мл/га.
Результаты, приведенные в табл.4, показывают, что препарат, полученный на основе штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, подавляет развитие различных заболеваний сельскохозяйственных культур.
Таблица 4. Влияние препарата на степень поражения гороха и яровой пшеницы различными болезнями. | |||||
Яровая пшеница | ГОРОХ | ||||
Корневые гнили, % | Аскохитоз, % | Ржавчина, % | Мучнистая роса, % | Корневые гнили, % | |
Контроль | 21,0 | 13,8 | 7,2 | 2.5 | 10,3 |
Препарат | 9,0 | 4,2 | 3,2 | 2,1 | 9,4 |
Пример 4. Влияние пестицидов на жизнеспособность штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966.
Проверку влияния пестицидов на жизнеспособность штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966 осуществляют путем сравнения жизнеспособности штамма в стандартном рабочем растворе биологического препарата и в рабочем растворе с добавлением химического препарата (пестицида).
Для этого к 1 литру воды добавляют 0,6 мл препарата, полученного по примеру 1, и рассчитанное количество пестицида. Смесь тщательно перемешивают в течение 30 минут и определяют число жизнеспособных клеток штамма в единице объема.
Концентрацию пестицида в смеси рассчитывали исходя из рекомендуемых норм расхода при полевых обработках зерновых культур.
Результаты, приведенные в табл.5, показали, что вышеперечисленные пестициды не оказывают существенного отрицательного влияния на жизнеспособность штамма, а следовательно, препарат, полученный на основе штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, при проведении полевых работ может быть использован с пестицидом в одной баковой смеси.
Таблица 5. Влияние пестицидов на жизнеспособность штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966. | ||||
№ п/п | Название пестицида | Концентрация пестицида в рабочем растворе (%) | Число жизнеспособных клеток (титр) в 1 мл смеси. | |
1 | Контроль (Биопрепарат без пестицида) | - | 110 млн | |
Гербициды | ||||
2 | Диален-супер | 0,27 | 107 млн | |
3 | Раундап | 1,0 | 103 млн | |
4 | Лонтрел-300 | 0,22 | 95 млн | |
Фунгициды | ||||
5 | Альто супер | 0,17 | 98 млн | |
6 | Фундазол | 0,2 | 90 млн | |
7 | Тилт | 0,17 | 60 млн | |
Протравители | ||||
8 | Виал | 0,17 | 110 млн | |
9 | Бункер | 0,17 | 105 млн | |
10 | Тэбу 60 | 0,17 | 102 млн | |
11 | Премис | 0,53 | 100 млн | |
12 | Суми 8 | 0,7 | 100 млн | |
13 | ТМТД | 1,3 | 100 млн | |
14 | ВИАЛ-ТТ | 0,13 | 100 млн | |
15 | Дивидент | 0.7 | 95 млн | |
16 | Фенорам супер | 0,7 | 88 млн | |
17 | Витарос | 1,0 | 80 млн |
Таким образом, показано, что препарат, полученный на основе штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, повышает урожайность многих сельскохозяйственных культур и увеличивает их устойчивость к различным заболеваниям.
Кроме того, препарат может использоваться совместно с пестицидами в одной баковой смеси, что приводит к экономии горюче-смазочных материалов и снижению трудозатрат.
Класс C12N1/20 бактерии; питательные среды для них
Класс A01N63/00 Биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, плесневые грибы, ферменты, сбраживающие материалы или вещества, полученные или экстрагированные из микроорганизмов или животных материалов