способ получения анатоксина bordetella pertussis
Классы МПК: | A61K39/10 Brucella; Bordetella, например коклюша C12N1/20 бактерии; питательные среды для них |
Автор(ы): | Захарова Нинель Сергеевна (RU), Бажанова Ирина Глебовна (RU), Брицина Марина Васильевна (RU), Мерцалова Наталия Устиновна (RU), Озерецковская Мария Николаевна (RU), Ермолова Елена Викторовна (RU), Зайцев Евгений Михайлович (RU), Валякина Татьяна Ивановна (RU), Комалева Равиля Люкмановна (RU), Несмеянов Владимир Андреевич (RU), Андронова Татьяна Михайловна (RU) |
Патентообладатель(и): | Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2005-01-20 публикация патента:
20.10.2006 |
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для производства бесклеточной коклюшной вакцины. Сущность способа заключается в получении анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, стабилизации его сахарозой, выделения из него токсического материала, детоксикации токсического материала формалином и сорбции анатоксина на геле гидроокиси алюминия. После сорбции полученного анатоксина на геле гидроокиси алюминия сорбированный препарат соединяют с глюкозаминилмурамилдипептидом в концентрации 0,02-0,2%. Кроме того, стабилизацию супернатанта осуществляют путем последовательного добавления сахарозы до концентрации 3-4% с последующим выдерживанием смеси при 4-10°С в течение 16-20 часов. Способ позволяет получать высокоактивный низкотоксичный анатоксин Bordetella pertussis, который может быть использован для получения бесклеточной коклюшной вакцины. 1 з.п. ф-лы.
Формула изобретения
1. Способ получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, стабилизации его сахарозой, выделения из него токсического материала, детоксикации токсического материала формалином и сорбции анатоксина на геле гидроокиси алюминия, отличающийся тем, что после сорбции полученного анатоксина на геле гидроокиси алюминия сорбированный препарат соединяют с глюкозаминилмурамилдипептидом в концентрации 0,02-0,2%.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стабилизацию супернатанта осуществляют путем последовательного добавления сахарозы до концентрации 3-4% с последующим выдерживанием смеси при 4-10°С в течение 16-20 ч.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для производства бесклеточной коклюшной вакцины.
Известен способ получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, выделения из него токсина с последующей детоксикацией формалином и сорбцией анатоксина на гидроокиси алюминия, токсин из супернатанта выделяют осаждением 3-7%-ным раствором гексаметафосфата натрия в присутствии 0,002-0,006 М растворов соляной, серной и трихлоруксусной кислот при рН 3,4-3,6, а детоксикацию токсина проводят в 8-12%-ном растворе сахарозы (RU 1369042, А 61 К 39/10, 1986 г.).
Проблема получения высокоэффективных низкотоксичных вакцин для профилактики коклюшной инфекции остается актуальной, поскольку применяемая в практике корпускулярная вакцина обладает высокой реактогенностью, а бесклеточные коклюшные вакцины характеризуются выраженной протективной активностью и более низкой токсичностью.
Повышение протективной активности бесклеточной коклюшной вакцины - одно из важных условий совершенствования этих препаратов.
Технический результат заявленного способа заключается в получении высокоактивного и низкотоксичного анатоксина Bordetella pertussis.
Для достижения указанного технического результата в способе получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, стабилизации его сахарозой, выделения из него токсического материала, детоксикацию токсического материала формалином и сорбцией анатоксина на геле гидроокиси алюминия, согласно изобретению после сорбции полученного анатоксина на геле гидроокиси алюминия сорбированный препарат соединяют с глюкозаминилмурамилдипептидом в концентрации 0,02-0,2%.
Кроме того, стабилизацию супернатанта осуществляют путем последовательного добавления сахарозы до концентрации 3-4% с последующим выдерживанием смеси при 4-10°С в течение 16-20 часов.
Сущность изобретения поясняется на следующих примерах выполнения способа.
Пример 1. Штамм 475a Bordetella pertussis 1 фазы со среды Борде-Жангу (2-ой пассаж) инокулируют до концентрации 3,0 -3,5 МОЕ в 1 мл в матрацы, содержащие 150-200 мл жидкой питательной среды и культивируют при 35,5°С в течение 5 суток. Супернатант отделяют от микробных клеток центрифугированием при 12500 оборотов в минуту в течение 60 минут.
К 1 л супернатанта добавляют последовательно сахарозу до концентрации 3%. Смесь помещают в холодильник при 4-10°С в течение 16 часов. Затем к 1 л смеси приливают последовательно 50 мл 20% раствора гексаметафосфата натрия, 2 мл 2 Н соляной, 2 мл 2 Н серной кислот и рН смеси доводят до 3,4 2 Н трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Осадок отделяют центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут и растворяют в 20 мл 0,07 М фосфатного буфера рН 7,5. К полученному препарату добавляют сахарозу до концентрации 10% и формалин до концентрации 0,4%. Детоксикацию препарата проводят в термостате при 37°С в течение 17 суток. Полученный анатоксин сорбируют на геле гидроокиси алюминия в концентрации 8 мкг белкового азота на 1 мг геля в 1 мл в течение 20 часов в холодильнике при 4-10°С. Сорбированный препарат соединяют с глюкозаминилмурамилдипептидом в концентрации 0,02%.
Пример 2. Штамм 475a Bordetella pertussis 1 фазы со среды Борде-Жангу (2-ой пассаж) инокулируют до концентрации 3,0-3,5 МОЕ в 1 мл в матрацы, содержащие 150-200 мл жидкой питательной среды и культивируют при 35,5°С в течение 5 суток. Супернатант отделяют от микробных клеток центрифугированием при 12500 оборотов в минуту в течение 60 минут.
К 1 л супернатанта добавляют последовательно сахарозу до концентрации 4%. Смесь помещают в холодильник при 4-10°С в течение 20 часов. Затем к 1 л смеси приливают последовательно 50 мл 20% раствора гексаметафосфата натрия, 2 мл 2 Н соляной, 2 мл 2 Н серной кислоты и рН смеси доводят до 3,5 2 Н трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Осадок отделяют центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут и растворяют в 20 мл 0,07 М фосфатного буфера рН 7,5. К полученному препарату добавляют сахарозу до концентрации 10% и формалин до концентрации 0,4%. Детоксикацию препарата проводят в термостате при 37°С в течение 17 суток. Полученный анатоксин сорбируют на геле гидроокиси алюминия в концентрации 8 мкг белкового азота на 1 мг геля в 1 мл в течение 20 часов в холодильнике при 4-10°С. Сорбированный препарат соединяют с глюкозаминилмурамилдипептидом в концентрации 0,2%.
Сравнительное изучение протективной активности анатоксинов, полученных предлагаемым и известным способами, показало, что препараты, полученные предлагаемым способом, были в 2 раза активнее препаратов, полученных известным способом. Средняя иммунизирующая доза (ED50) анатоксинов, полученных заявляемым способом, составляла 0,0992 (0,0830:0,1152) мкг белкового азота, а ED 50 анатоксина, полученного известным способом составляла 0,2144 (0,1856:0,2432) мкг белкового азота.
Различия были статистически достоверны при р>0,001.
Индекс резистентности к заражению вирулентной культурой Bordetella pertussis мышей, иммунизированных анатоксином, приготовленньм по заявляемому способу, составил 7,9-9,34, а мышей, иммунизированных анатоксином, приготовленным известным способом, составлял 3,1, что свидетельствует о более высокой напряженности иммунитета, вызываемого анатоксином, приготовленным заявленным способом.
Анатоксин, полученный заявленным способом, в иммунизирующей дозе для человека не сенсибилизировал мышей к гистамину дигидрохлориду (гибель составляла 0%), а анатоксин, полученный известным способом, вызывал гибель 14,28% мышей после введения гистамина, что свидетельствует о более низкой токсичности анатоксина, полученного заявленным способом.
Класс A61K39/10 Brucella; Bordetella, например коклюша
Класс C12N1/20 бактерии; питательные среды для них