способ выделения моногалактозилдиацилглицеринов из растительного сырья

Классы МПК:A61K31/7032  присоединенные к многоатомному спирту, те соединения, содержащие две или более свободные или этерифицированные гидроксильные группы, включая гидроксильную группу,образующую гликозидную связь, например моноглюкозилдиацилглицериды, лактобионовая кислота, ганглиозиды
C11B1/10 экстракцией 
B01D11/02 твердых веществ 
Автор(ы):,
Патентообладатель(и):Институт химии Дальневосточного отделения Российской академии наук (статус государственного учреждения) (Институт химии ДВО РАН) (RU),
Бурмистров Александр Сергеевич (RU),
Тен Петр Владимирович (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2004-12-27
публикация патента:

Изобретение относится к биохимии. Проводят экстракцию общих липидов из отходов переработки зерна риса. Разделение липидов осуществляют с использованием метода двумерной тонкослойной хроматографии с использованием смеси растворителей: по первому направлению - хлороформ, ацетон, метанол, муравьиная кислота, вода; по второму направлению - ацетон, бензол, муравьиная кислота, вода. Изобретение позволяет повысить чистоту продукта. 2 табл., 2 ил. способ выделения моногалактозилдиацилглицеринов из растительного   сырья, патент № 2280454

способ выделения моногалактозилдиацилглицеринов из растительного   сырья, патент № 2280454 способ выделения моногалактозилдиацилглицеринов из растительного   сырья, патент № 2280454

Формула изобретения

Способ выделения моногалактозилдиацилглицеринов из растительного сырья путем экстракции общих липидов, разделения и последующего выделения из них целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют отходы переработки зерна риса, а разделение осуществляют с использованием метода двумерной тонкослойной хроматографии с использованием смеси растворителей: по первому направлению - хлороформ, ацетон, метанол, муравьиная кислота, вода; по второму направлению - ацетон, муравьиная кислота, вода.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биохимии, конкретно к области получения гликолипидов, которые могут быть использованы в фармацевтической и косметологической промышленности, а также в качестве промежуточных соединений для синтеза новых материалов в биохимии, медицине, в том числе в иммунологии, и в других отраслях промышленности.

Начиная с 80-х годов прошлого столетия в связи с широкомасштабным изучением разнообразных биологических функций липидов, в том числе и гликолипидов, значительно возросла потребность в производстве как липидных фракций, так и индивидуальных препаратов из них. Было установлено, что гликолипиды являются рецепторами гормонов, токсинов, вирусов, проявляют противоопухолевую и антимикробную активности. Являясь структурными компонентами биологических мембран, гликолипиды оказывают влияние на множество мембранных процессов, в том числе на транспорт ионов и метаболитов, активность мембраносвязанных ферментов, межклеточные взаимодействия и рецепцию (Химическая энциклопедия: В 5 т.: т.2. /Редкол.: Кнунянц И.Г. (гл. ред.) - М.: Сов. энцикл., 1990. 671 с.; В.Г. Рыбин, Ю.Г. Блинов. Антимикробные свойства липидов // Изв. ТИНРО. 2001. Т.129. С.179-196.; С.В.Хотимченко. Липиды морских водорослей-макрофитов и трав: Структура, распределение, анализ. Владивосток: Дальнаука, 2003. 234 с.).

Было показано, что гликолипиды, в основном в виде глицерогликолипидов: моногалактозилдиацилглицеринов и дигалактозилдиацилглицеринов, присутствуют во всех растениях, но их количество и соотношение между ними в каждом растении индивидуально.

Определенный набор липидов выделяют из хвойных растений, однако содержание гликолипидов в них незначительно (патент РФ №2089208, опубл. 10.09.1997; Кислухина О.В. Выделение биологически активных липидов из низко-масличного сырья. Пищ. и перераб. Пром-сть: Сер. Масло-жировая пром-сть: Научно-технический инфор. Сб. 1995 Вып.1. - С.10-17). Как правило, они представляют собой набор неполярных и кислых липидов, получаемых путем обработки измельченного сырья 5-10% водным раствором щелочи при комнатной температуре и последующего их извлечения из полученной эмульсии экстракцией петролейным и диэтиловым эфирами.

Минимальное количество диглицеридов выделено из рисовой соломы (до 0,19% от общего количества экстрактивных веществ) в аппаратах Сокслета экстракцией с использованием набора экстрагентов (толуол-этанол 2:1), хлороформа, петролейного эфира, дихлорметана (В. Xiao X.F. Sun RunCang Sun. Extraction and characterization of lipophilic extractives from rice straw, i. Chemical composition // Journal of Wood Chemistry and Technology. 2001. Vol.21. №4. Р.397-411).

Большой набор гликолипидов (ГЛ), включающий галактозилглицерины (ТТЛ) - ацил-моногалактозилдиацилглицерины (Ас-МГДГ), моногалактозилдиацилглицерины (МГДГ), а также сфинголипиды (СФЛ), цереброзиды (ЦЗ) и керамидолигогексозиды (КОГ) - содержит экстракт липидной фракции семян аконита северного. Идентификацию этих соединений проводили по данным ИК-спектроскопии, химических превращений и хроматографической подвижности (С.Г.Юнусова, Э.Г.Зинурова, М.С.Юнусов. Гликолипиды семян аконита северного. Всероссийская конференция «Химия и технология растительных веществ», Сыктывкар, 25-30 сентября 2000 г, 48 с.).

Однако разделение полученной смеси ГЛ с выделением отдельных фракций, в том числе фракции моногалактозилдиацилглицеринов (МГДГ), из этой смеси известными методами колоночной хроматографии и препаративной хроматографии на силикагеле является чрезвычайно трудоемким и неэффективным процессом, в том числе и из-за используемого сырьевого источника, запасы которого незначительны.

На сегодняшний день актуальной задачей является не только поиск нетрадиционных источников липидов, но и получение липидов определенного состава, тем более, что растительные ГЛ и их отдельные фракции являются остродефицитной продукцией, а их выделение связано с переработкой значительного количества растительного сырья, в частности пищевого зерна, и большими капиталовложениями.

О возросших потребностях в липидных препаратах говорит и появление ряда фирм, которые стали выпускать разные вещества этого класса, в том числе МГДГ (Galactosyi diglyceride), структурной формулой

способ выделения моногалактозилдиацилглицеринов из растительного   сырья, патент № 2280454

где R1 и R2 - ацильные остатки. Gal - галактоза.

Стоимость реактива "Galactosyl diglycerid "с содержанием основного вещества примерно 95%, получаемого из непросеянной пшеничной муки, высушенного в вакууме, составляет (долл. США): 1 мг - 12.10; 5 мг - 39.30 и 10 мг - 65.00. (SIGMA (Chemical company): Biochemicals organic compounds for research and diagnostic reagents. 1992. P.454).

Основным источником выделения МГДГ на сегодня остается пшеничная мука, содержащая смесь гликолипидов, главным образом моногалактозилдиацилглицеринов - МГДГ и дигалактозилдиацилглицеринов - ДГДГ. Способ выделения фракции МГДГ из нее является наиболее близким к заявляемому. Способ состоит из нескольких стадий, включающих экстракцию и переэкстракцию общих липидов (ОЛ) с применением в качестве экстрагентов метанола и гексана, затем выделение из полученного экстракта смеси неочищенных ГЛ с последовательным использованием эфира и системы растворителей (бензол - ацетон и метанол) для очистки полученной фракции ГЛ, последующее разделение МГДГ и ДГДГ с помощью одномерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе хлороформ - уксусная кислота - вода и на заключительном этапе - выделение МГДГ экстракцией соответствующей зоны метанолом (Препаративная биохимия липидов. Под ред. Л.Д.Бергельсона. М.: Наука, 1981. 256 с.).

Однако известный способ выделения моногалактозилдиацилглицеринов основан, во-первых, на использовании сырья, представляющего собой ценный пищевой продукт и, во-вторых, содержащего как минимум смесь двух ГЛ, что приводит к необходимости использования больших объемов растворителей и делает известный способ многостадийным, а использование одномерной ТСХ не позволяет разделить с достаточной полнотой близкородственные по структуре гликолипиды.

Задача изобретения состоит в упрощении способа выделения фракции МГДГ из растительного сырья и повышении ее чистоты, что достигается за счет использования нового источника растительного происхождения.

Поставленная задача решается тем, что в способе выделения моногалактозилдиацилглицеринов из растительного сырья путем экстракции общих липидов, последующего их разделения и выделения целевого продукта, в качестве исходного сырья используют отходы переработки риса, а разделение липидов осуществляют с использованием двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Отходы переработки риса (РО) представляют собой возобновляемую биомассу, образующуюся в качестве отхода при очистке зерна на крупяных заводах и состоящую из рисовой шелухи, мучки или рисовых отрубей. Как правило, непереработанный отход риса используют как упаковочный материал, термо- и звукоизолирующий наполнитель в пластмассах, в производстве стройматериалов, в качестве адсорбента маслоподобных веществ, абразивов, топлива, в сельском хозяйстве в качестве добавки в корм животным, подстилочного материала, разрыхлителя почв. Подвергнутый физико-химической переработке отход используют для получения неорганических соединений кремния, углерода, а также ксилозы, сахарозы, фруктозы, фурфурола и фитиновых кислот.

Проведенные заявителем исследования состава липидных фракций из различных растительных отходов показали, что в отличие от известных растительных источников липидов, в том числе и пшеничной муки, липидная фракция отходов переработки риса содержит один доминирующий гликолипид - моногалактозилдиацилглицерин. Впервые обнаруженное заявителем данное свойство рисового отхода позволило значительно упростить процесс выделения МГДГ за счет сокращения количества технологических операций, повысить чистоту выделяемого продукта и дополнительно значительно удешевить стоимость способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Путем экстракции органическими растворителями исходного сырья выделяют фракцию общих липидов (ОЛ). Выделение ОЛ проводят стандартными методами, например, с использованием в качестве экстрагентов этанола и хлороформа - метод Блайя и Дайера (E.G Bligh, W.J. Dyer. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiol.,1959. - Vol.37, P.911-917) или смеси растворителей изопропанол-гексан - метод Шафера для растительных тканей (К. Schafer. Accelerated solvent extraction of lipids for determining the fatty acid composition of biological material // Anal. Chim. Acta, 1998, - Vol.358, P.69-77) с последующим вакуумным испарением растворителей. Как показали проведенные эксперименты, выход общих липидов (ОЛ) из образцов РО составляет 1,4-2,7 мас.% и зависит в общем случае от способа очистки зерна на предприятии, но не от примененного метода выделения ОЛ. Полученный маслообразный остаток ОЛ затем растворяют в одном из растворителей и проводят разделение липидов методом двумерной ТСХ в системе растворителей, которую, как правило, подбирают экспериментально по эффективности разделения компонентов липидов. Выделение МГДГ с хроматограммы осуществляют стандартным образом путем десорбции (элюирования) пятна МГДГ с адсорбентом этанолом или раствором хлороформа с метанолом, отделения адсорбента либо на воронке Бюхнера под вакуумом, либо центрифугированием и последующего вакуумного испарения растворителя.

В качестве отхода рисового производства используют отходы переработки зерна риса (РО), которые образуются при получении крупы на заводах. В частности, были исследованы образцы РО, полученные на крупяных заводах в Краснодарском крае (образцы РО1-3) и Ростовской области (образец РО-4). Для сравнения липидного состава использовали также образец зерна сои, выращенной в Амурской обл.

Двумерную ТСХ проводили по общепринятым методикам с использованием смеси известных растворителей, взятых в определенном соотношении, которая показала наилучший результат: 1-е направление: хлороформ, ацетон, метанол, муравьиная кислота, вода; 2-е направление: ацетон, бензол, муравьиная кислота, вода (М.Кейтс. - Техника липидологии. М.: Мир, 1975. 221 с.).

Качественный состав ОЛ различных образцов РО определяли по известной методике с помощью одномерной ТСХ с использованием одного из реагентов, проявляющих пятна (например, раствора серной кислоты в метаноле или раствора фосфорномолибденовой кислоты), а их идентификацию проводили по литературным значениям величин Rf (М.Кейтс. - Техника липидологии. М.: Мир, 1975. 221 с.; W.W. Christie. - Lipid analysis. Isolation, separation, identification and structural analysis of lipids - L., 1973. - P.153-154). Результаты представлены в табл. 1, где приведен состав полярных липидов в образцах РО и для сравнения - сои.

способ выделения моногалактозилдиацилглицеринов из растительного   сырья, патент № 2280454

Анализ полярных липидов, полученных по заявляемому способу из отходов рисового производства, проведенный с помощью двумерной ТСХ, представлен в табл.2 и на фиг.1, где приведена двумерная микро-ТСХ полярных липидов образца РО-1: 1-ФИ; 2-ФХ; 3-МГДГ. Для остальных образцов микро-ТСХ идентичны. Для сравнения на фиг.2 приведена двумерная микро-ТСХ полярных липидов образца сои, где 1-ФИ, 2-ФХ, 3-МГДГ, 4-ФС, 5-ФЭ, 6-СХДГ: 7-ДГТС, 8-Х 1, 9-X2, где X1 и Х2 - неидентифицированные соединения.

Таблица 2
Образец сырьяВыход ОЛ, % (относ, исх. сырья)Выход, % (относительно ОЛ)
МГДГФЛ
РО-11,44 0,600,12
РО-22,65 1,100,22
РО-32,641,60 0,32
РО-4 1,541,10 0,22
СОЯ2,43 6,001,20

Полученные данные показывают, что во всех образцах РО идентифицированы по одному ГЛ, представляющему собой МГДГ, и по два фосфолипида (ФЛ): ФИ, ФХ. По составу полярных липидов (ПЛ) образцы РО существенно отличаются от образца сои, который демонстрирует наличие большего числа полярных липидов.

Известно, что длина цепи ацильных групп и их степень ненасыщенности влияют на хроматографическую подвижность ГЛ (С.В.Хотимченко. Липиды морских водорослей-макрофитов и трав: Структура, распределение, анализ. Владивосток: Дальнаука, 2003, 234 с.). Поскольку при хроматографическом разделении ГЛ и ФЛ методом ТСХ не наблюдается деления МГДГ на две зоны, т.е. МГДГ образует одно пятно (пятно 3 на фиг.1), можно считать, что ацильные остатки моногалактозилдиацилглицерина R1 и R2 одинаковы, и следовательно, выделяемый МГДГ является гомогенным соединением, в котором R1 равно R2.

Предложенный способ иллюстрируется следующим примером.

Навеску 20 г сырья - РО-2 - заливают 200 мл смеси хлороформ-этанол (2:1) и экстрагируют ОЛ. Полученный экстракт упаривают на роторном испарителе при температуре 40°С, высушивают под вакуумом до постоянной массы и получают 0.52 г ОЛ, которые затем растворяют в 5 мл гексана и проводят двумерную ТСХ на хроматографической пластине в следующей системе растворителей: 1-е направление: хлороформ, ацетон, метанол, муравьиная кислота, вода; 2-е направление: ацетон, бензол, муравьиная кислота, вода. Для количественного выделения МГДГ хроматограмму опрыскивают дистиллированной водой, проявляющей пятна; отмечают нужное пятно, соскребают его с хроматографической пластины вместе с адсорбентом и помещают в сосуд. Затем проводят десорбцию (элюирование), обрабатывая вещество с адсорбентом этанолом. Раствор отфильтровывают от адсорбента центрифугированием и проводят вакуумное испарение растворителя. Выход МГДГ составляет 0.0057 г или 1,1 мас.% от массы общих липидов.

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2280454

patent-2280454.pdf

Класс A61K31/7032  присоединенные к многоатомному спирту, те соединения, содержащие две или более свободные или этерифицированные гидроксильные группы, включая гидроксильную группу,образующую гликозидную связь, например моноглюкозилдиацилглицериды, лактобионовая кислота, ганглиозиды

способы поддержания или увеличения роста или когнитивного развития -  патент 2523601 (20.07.2014)
фармацевтическая композиция для лечения гастроэзофагеальной рефлюксной болезни -  патент 2501549 (20.12.2013)
способ получения чистого моносиалоганглиозида gm1 для применения в медицине -  патент 2483736 (10.06.2013)
применение 5-метил-1,3-бенздиола или его производных в изготовлении лекарства и функционального продукта питания для лечения или предупреждения депрессии -  патент 2447887 (20.04.2012)
полисульфатированные гликозиды и их соли -  патент 2413734 (10.03.2011)
средство "экспортал", обладающее гастропротективным (противоязвенным) действием -  патент 2398589 (10.09.2010)
раствор для профилактики спайкообразования и способ профилактики спайкообразования -  патент 2395287 (27.07.2010)
лечение неврологической дисфункции с применением сульфаматов фруктопиранозы и эритропоэтина -  патент 2317086 (20.02.2008)
производное олигосахаридов -  патент 2290408 (27.12.2006)
способ лечения диабета -  патент 2266123 (20.12.2005)

Класс C11B1/10 экстракцией 

способ получения растительных экстрактов для косметики -  патент 2528693 (20.09.2014)
способ извлечения масла и протеинсодержащего продукта из высокомасличного растительного материала -  патент 2517855 (10.06.2014)
способ получения функциональных продуктов -  патент 2485806 (27.06.2013)
способ приготовления липидной биоактивной композиции -  патент 2482707 (27.05.2013)
способ получения фосфолипазы d -  патент 2472351 (20.01.2013)
способ комплексной переработки растительного сырья при получении силиконовых экстрактов -  патент 2465307 (27.10.2012)
способ получения богатых омега-3 жирными кислотами морских фосфолипидов из криля -  патент 2458112 (10.08.2012)
способ получения рыбного жира эйфитол -  патент 2456336 (20.07.2012)
способ получения комплексного продукта из семян льна -  патент 2435833 (10.12.2011)
способ безотходной переработки семян амаранта и технологическая линия для его осуществления -  патент 2426773 (20.08.2011)

Класс B01D11/02 твердых веществ 

способ получения спиртованных морсов для напитков -  патент 2529710 (27.09.2014)
применение ланохолестероловой фракции из шерстного жира в качестве биоэмульгатора для косметических антивозрастных средств -  патент 2526158 (20.08.2014)
способ экстракции цинка из донных осадков ионной жидкостью -  патент 2523469 (20.07.2014)
способ получения меланина из чаги -  патент 2523414 (20.07.2014)
способ выделения билогически активных компонентов из растительного сырья и средство на его основе -  патент 2523038 (20.07.2014)
способ получения фракции липофильных веществ из чаги -  патент 2522952 (20.07.2014)
способ получения средства, обладающего гепатопротекторным действием -  патент 2522281 (10.07.2014)
способ раздельного выделения дубильных веществ и флавоноидов из лекарственного растительного сырья -  патент 2522227 (10.07.2014)
комплекс биологически активных веществ для лечения и профилактики заболеваний сердечно-сосудистой системы -  патент 2520695 (27.06.2014)
средство, обладающее противоопухолевым и иммуномодулирующим действием -  патент 2519769 (20.06.2014)
Наверх