способ подготовки трансплантатов для реконструктивной хирургии

Формула изобретения

Способ подготовки трансплантатов, включающий отмывку в воде кадаверных тканей с последующим обезжириванием, проведением кислотно-щелочного гидролиза, выдерживанием в растворе поверхностно-активного вещества и их консервации в растворе этилового спирта, отличающийся тем, что кадаверную ткань помещают в раствор едкой щелочи 0,1 н - 0,05 н, рН 8,1-8,5, при температуре 18-21°С на 3,5-4,5 ч, раствор меняют через 25-30 мин, затем в 10-13%-ный раствор бикарбоната натрия рН 7,4-7,6 на 15-20 мин, при 3-5 кратной смене раствора, после этого в 10%-ный раствор соды и помещают в холодильник на 8-10 ч, затем отмывают дистиллированной водой 3-4 раза по 10-15 мин и помещают в 3,5-5%-ный раствор щавелевой или лимонной кислоты, рН 6,2-6,6 при 5-7 сменах раствора по 25-30 мин при температуре 18-21°С, промывают дистиллированной водой 3-4 раза по 10-15 мин, затем ткань помещают в 13,5%-ный раствор пищевой соды, рН 7,2-7,4 с экспозицией 20-30 мин, при 3-4 кратной смене раствора, при температуре 18-21°С, отмывают в дистиллированной воде до получения прозрачного раствора, затем материал помещают в раствор щавелево-кислого натрия 3,5-4,5% на 7-13 мин, 7-8 раз, при температуре 18-21°С, отмывают дистиллированной водой, полученный материал обрабатывают белково-полисахаридными комплексами, экстрагированными из нервной ткани, в течение 3,15-5,3 ч, при температуре 31-35°С, на водяной бане, при тщательном перемешивании, затем помещают в 96° этиловый спирт на 15-21 мин, после чего на 8-10 ч помещают в 80%-ный раствор этилового спирта, затем помещают на 10-15 мин при 2-кратной смене раствора в 93-96%-ный раствор этилового спирта, а консервацию проводят в 76%-ном растворе этилового спирта.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к пластической хирургии, и может быть использовано для реконструктивной хирургии и герниопластики.

Анализ существующих в настоящее время технологий подготовки трансплантационных материалов биологического происхождения для герниопластики позволил выявить то, что ни один из существующих способов подготовки трансплантатов не позволяет получить биоматериал для герниопластики, близкий по своим свойствам к оптимальным.

Прототипом изобретения является способ подготовки трансплантатов из биологических тканей (патент РФ №2094033 от 27.10.97 г.), который заключается в том, что кадаверные ткани после проверки на инфицирование сифилисом, вирусом гепатита и ВИЧ-инфекцией, после отмывания дистиллированной водой, подвергают обработке эфиром, раствором аммиака и додецил сульфата натрия. После чего трансплантат хранится в 70% растворе спирта.

Недостатком данного прототипа является отсутствие корригирующего влияния на неоваскулогенез, на репаративное восстановление нервной ткани регенерата, недостаточно выражена дифференцировка и специализация к тканевому ложу, сложность контроля за репаративными процессами при перестройке трансплантата в ожидаемые сроки.

Технический результат изобретения - получение новой ткани с низкой антигенной активностью, близкой по своим морфо-функциональным показателям к тканям реципиента, контроль за репаративными процессами, возможность заготовки достаточного количества трансплантационного материала при низкой их себестоимости.

Подготовка трансплантатов осуществляется по технологии, основанной на кислотно-щелочном гидролизе, позволяющей удалить из трансплантационного материала все клеточные элементы, липиды, низкомолекулярные белки, т.е. те компоненты, которые влияют на воспалительную реакцию, аллергические проявления, реакцию отторжения трансплантата, репаративные процессы, что, в свою очередь, улучшает качество герниопластики.

Суть технологии в следующем: кадаверные ткани (твердая мозговая оболочка (ТМО), стенка нижней полой вены, стенка брюшного отдела аорты) тщательно промывают дистиллированной водой при температуре 18-21°С в течение 3-5 часов. Затем помещают в раствор щелочи (NaOH или КОН) - 0,1 - 0,05 н., рН 8,1-8,5, при температуре 18-21°С на 3,5-4,5 часов. Раствор щелочи меняют через каждые 25-30 мин, в промежутках между этим тщательно отмывают водой от щелочи - в итоге в общей сложности ткань обрабатывается в течение 7-8 часов. При этом из тканей удаляют липиды, гликопротеиды, частично низкомолекулярные белки, происходит разрыхление клеточных элементов. Следующим этапом ткань помещают в 10-13% раствор бикарбоната натрия (NaHCO₃), рН 7,4-7,6. Обработка длится в течение 15-20 мин, при 3-5-кратной смене раствора. Затем помещается в 10% раствор соды и помещают в холодильник на 8-10 часов. Затем отмывают дистиллированной водой в 3-4 смены по 10-15 мин. Далее помещают в 3,5-5% раствор щавелевой или лимонной кислоты, рН 6,2-6,6. Обработка происходит при 5-7 сменах раствора по 25-30 мин каждая, при температуре 18-21°С (удаляются низкомолекулярные белки, гликопротеиды, нуклеопротеиды, липопротеиды и т.д.). В промежутках между обработкой в кислоте материал промывают дистиллированной водой по 10-15 мин. После обработки кислотой ткань помещается в 13,5% раствор пищевой соды, рН 7,2-7,4 в 3-4 смены раствора, при температуре 18-21°С. Затем отмывают в дистиллированной воде до получения прозрачного раствора: 1,5-2 часа, при температуре 21-23°С. Следующим этапом материал помещают в раствор щавелевокислый натрий 3,5-4,5%, время экспозиции 7-13 мин, кратность 7-8 раз, при температуре 18-21°С. Затем тщательно отмывают дистиллированной водой при той же температуре. После этого трансплантаты обрабатывают белково-полисахаридными комплексами, экстрагированными из нервной ткани в течение 3,15-5,3 часа, при температуре 31-35°С, на водяной бане с постоянным термометрированием, при тщательном перемешивании на магнитной мешалке. Затем этот трансплантационный материал помещают в 96° этиловый спирт на 15-21 мин, но не более 30 мин. Обработанные трансплантаты на 8-10 часов помещают в 80% раствор этилового спирта. Затем помещают на 10-15 мин, при 2-кратной смене раствора в 93-96% раствор этилового спирта с целью денатурации. После помещают в консервант 76% этиловый спирт, где и хранят до использования.

Фиг.1 - ТМО. 14 сутки после операции. Контакт трансплантата с тканями передней брюшной стенки живота. А - мышцы передней брюшной стенки.

Фиг.2 - ТМО. 14 сутки после операции. Отростки клеток между волокнами трансплантата. Разрыхление волокон трансплантата.

Фиг.3 - ТМО. 30 сутки после операции. Миграция клеток в месте контакта трансплантата с тканями передней брюшной стенки живота.

Фиг.4 - ТМО. 30 сутки после операции. Активация клеток в месте контакта тканей. Расширение перинуклеарных пространств. Большое содержание везикул в цитоплазме.

Фиг.5 - герниопластика у крыс аллотрансплантатом из вены. 60 сутки после операции. Лизис трансплантата. Формирование регенерата.

Фиг.6 - герниопластика у крыс аллотрансплантатом из вены. 60 сутки после операции. Расположение отростков клеток в зоне перестройки между волокнами трансплантата.

Фиг.7 - герниопластика у крыс аллотрансплантатом из аорты. 30 сутки после операции. Миграция клеток и разрыхление волокон трансплантата.

Фиг.8 - герниопластика у крыс аллотрансплантатом из аорты. 30 сутки после операции. Фибробласт с интенсивно окрашенной цитоплазмой. Ядро с перинуклеарными расширениями.

Фиг.9 - герниопластика аллотрансплантатом из аорты. 60 сутки после операции. Уменьшения явлений отека. Формирование регенерата.

Фиг.10 - герниопластика у крыс аллотрансплантатом из аорты. 60 сутки после операции. Разрыхление и разволокнение ткани трансплантата.

Пример 1. Стенку нижней полой вены тщательно отмывают дистиллированной водой в течение 4 часов при температуре 18°С. Далее помещают в раствор щелочи КОН 0,1 н., рН 8,2 при температуре 20°С на 4 часа. Раствор меняется через каждые 30 мин. В промежутках между этим проводится тщательное отмывание дистиллированной водой от щелочи. Затем ткань помещается в 12% раствор бикарбоната натрия рН 7,4. Обработка длится 15 мин, при 4-кратной смене раствора. После этого помещается в 10% раствор соды и помещается в холодильник на 9 часов. Затем отмывается дистиллированной водой в 3 смены по 15 мин. Далее помещается в 4% раствор щавелевой кислоты, рН 6,4. Обработка происходит при 7-кратной смене раствора, с экспозицией 25 мин. При температуре 21°С. После обработки кислотой материал помещают в 13,5% раствор пищевой соды, рН 7,2 в 4 смены раствора по 25 мин, при температуре 18-21°С. Затем отмывается в дистиллированной воде до получения прозрачного раствора в течение 2 часов при температуре 21°С. Следующим этапом материал помещают в раствор щавелевокислый натрий 4%, время экспозиции - 10 мин, кратность - 5 раз, при температуре 20°С, после чего тщательно отмывают дистиллированной водой, 30 мин, при температуре 21°С. Затем производилась обработка материала белково-полисахаридными комплексами, экстрагированными из нервной ткани в течение 4 часов, при температуре 33°С, на водяной бане с постоянным термометрировании, при тщательном перемешивании на магнитной мешалке. После чего трансплантационный материал помещали в 96° этиловый спирт на 15 мин. Обработанные трансплантаты на 10 часов помещают в 80% раствор этилового спирта. Затем помещают на 10 мин при 2-кратной смене раствора в 96% раствор этилового спирта. Готовый препарат помещается в 76% раствор этилового спирта, где и хранится до использования.

Пример 2. Стенку нижней полой вены тщательно отмывают дистиллированной водой в течение 3 часов при температуре 20°С. Далее помещают в раствор щелочи КОН 0,1 н., рН 8,5 при температуре 19°С на 3 часа. Раствор меняется через каждые 30 мин. В промежутках между этим проводится тщательное отмывание дистиллированной водой от щелочи. Затем ткань помещается в 13% раствор бикарбоната натрия рН 7,5. Обработка длится 20 мин при 5-кратной смене раствора. После этого помещается в 10% раствор соды и помещается в холодильник на 10 часов. Затем отмывается дистиллированной водой в 4 смены по 10 мин. Далее помещается в 5% раствор щавелевой кислоты, рН 6,6. Обработка происходит при 6-кратной смене раствора, с экспозицией 25 мин, при температуре 20°С. После обработки кислотой материал помещают в 13,5% раствор пищевой соды, рН 7,3 в 4 смены раствора по 25 мин, при температуре 20°С. Затем отмывается в дистиллированной воде до получения прозрачного раствора в течение 2 часов при температуре 21°С. Следующим этапом материал помещают в раствор щавелевокислый натрий 3,5%, время экспозиции - 10 мин, кратность - 7 раз, при температуре 20°С, после чего тщательно отмывают дистиллированной водой, 30 мин, при температуре 20°С. Полученный материал подвергался обработке белково-полисахаридными комплексами, экстрагированными из нервной ткани в течение 4,5 ч, при температуре 35°С, на водяной бане с постоянным термометрированием, при тщательном перемешивании на магнитной мешалке. Затем этот трансплантационный материал помещали в 96° этиловый спирт на 20 мин. Обработанные трансплантаты на 10 часов помещают в 80% раствор этилового спирта. Затем помещают на 10 мин, при 2-кратной смене раствора в 96% раствор этилового спирта. Готовый препарат помещается в 76% раствор этилового спирта, где и хранится до использования.

Преимущество нашего метода заключается в том, что в процессе подготовки трансплантационного материала не изменяется структура волокнистого каркаса, при этом из материала удаляются низкомолекулярные белки, гликопротеиды, липопротеиды, липиды и другие субстанции, т.е. те вещества, которые вызывают воспалительную реакцию, аллергические проявления, иммунологические нарушения в виде реакции отторжения.

Экспериментальные исследования проводились на белых половозрелых крысах обоего пола, массой от 185 до 220 г. Из эксперимента животные выводились на 3, 7, 10, 14, 21, 30, 45, 60, 90-е сутки. Патоморфологические исследования показали, что подготовка аллотрансплантатов по данной технологии позволяет исключить нежелательные последствия при репаративных процессах в виде воспалительных, аллергических проявлений, реакций отторжения трансплантата, что наблюдается в ареактивном послеоперационном течении процесса. Предложенная технология подготовки трансплантационного материала позволяет планировать сроки замещения трансплантата и окончательную перестройку ткани, схожую по морфо-функциональной структуре с тканями реципиента, что позволяет повысить качество трансплантируемых материалов, при их низкой себестоимости.