способ определения концентрации фекальной панкреатической эластазы-1

Формула изобретения

Способ определения концентрации фекальной панкреатической эластазы-1, включающий определение концентрации эластазы-1 в 1 г кала с помощью иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что дополнительно, учитывая консистенцию кала, определяют массу сухого вещества кала, рассчитывают концентрацию фекальной панкреатической эластазы-1 в 1 г сухого вещества кала по формуле

где Cd - концентрация эластазы-1 в 1 г сухого вещества кала;

Са - концентрация эластазы-1 в 1 г кала, полученное с помощью иммуноферментного анализа;

M1 - любая масса кала, используемая для определения сухого вещества кала;

Md1 - масса сухого вещества кала, содержащаяся в M1,

и нормальными значениями концентрации фекальной эластазы-1 считают от 1000 до 2500 мкг на 1 г сухого вещества кала.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биохимической лабораторной диагностики по определению концентрации панкреатической эластазы-1 в кале.

Известен способ определения значений концентрации эластазы-1 с помощью иммуноферментного метода ScheBoPancreatic Elastase 1, Stool Test, ScheBoBiotech, Германия. Этот метод является "золотым стандартом" в неинвазивной лабораторной диагностике и оценке экзокринной функции поджелудочной железы. В отличие от других лабораторных тестов для диагностики заболеваний поджелудочной железы (активность амилазы и липазы в сыворотке для диагностики острого панкреатита и активности фекального химотрипсина и трипсина в диагностике экзокринной панкреатической недостаточности) определение панкреатической эластазы-1 имеет ряд преимуществ. В частности заместительная ферментная терапия не влияет на определение эластазы-1. Недостатком метода является то, что при водянистом стуле из-за разведения концентрация эластазы-1 в одном грамме кала понижается. Поэтому в инструкции по определению фекальной панкреатической эластазы-1 [ScheBoPancreatic Elastase I, Stool Test, ScheBoBiotech, Германия, 2002] рекомендуют смотреть на консистенцию кала и в случае патологического результата (менее 200 мкг/г кала) повторяют исследование при оформленном кале.

Изобретением решается задача по определению концентрации фекальной панкреатической эластазы-1, учитывая консистенцию кала, что позволяет оценить экзокринную функцию поджелудочной железы у больных с водянистым и/или "овечим" калом, не дожидаясь формирования нормального стула. В лабораторной диагностике плотность кала определяется по внешнему виду, однако поскольку плотность кала влияет на показатели фекальной панкреатической эластазы-1, то в предлагаемом способе плотность кала учитывается путем определения массы сухого вещества кала, что является объективным критерием. Оценка содержания фекальной панкреатической эластазы-1 проводится в расчете на 1 г сухого вещества кала, что дает возможность существенно повысить точность результатов.

Было проведено сравнение значений эластазы-1, полученных с помощью стандартного иммуноферментного метода и показателей эластазы-1, полученных по заявленному способу. Получено, что у практически здоровых людей (10 больных) получаемые по обоим способам показатели эластазы-1 соответствуют норме. Исследование было проведено также у 20 больных, у 10 из них отмечалась диарея, у 10 больных - плотные каловые массы. Полученные результаты показали, что предлагаемый способ является более точным, чем исследование фекальной панкреатической эластазы-1 по стандартному иммуноферментному методу.

В предлагаемом способе определения концентрации фекальной панкреатической эластазы-1 определяют массу сухого вещества кала и значение, полученное с помощью иммуноферментного метода, что позволяет уточнить и повысить точность результата. Формула для определения содержания эластазы-1 при водянистом кале и/или запорных каловых массах

Cd=(Са·М1)/Md1,

где Cd - концентрация эластазы-1 в 1 грамме сухого вещества кала;

Са - концентрация эластазы-1 в 1 грамме кала, полученное с помощью иммуноферментного анализа;

M1 - любая масса кала, используемая для определения сухого вещества кала;

Md1 - масса сухого вещества кала, содержащаяся в M1.

Полученное значение сравнивают с нормальным значением концентрации эластазы-1 от 1000 до 2500 и более мкг в 1 грамме сухого вещества кала.

Предлагаемый способ имеет следующее обоснование.

В норме кал состоит на 80-85% из воды и на 20-15% из спрессованной растительной клетчатки и калового детрита, пропитанного солями извести (В.Т.Морозова, И.И.Миронова, Р.Л.Марцишевская. Лабораторная диагностика патологии пищеварительной системы. Москва, 2001, с.63). Концентрация эластазы-1 в норме составляет от 200 до 500 и более мкг в 1 грамме кала. В кале нормальной консистенции на 1 часть детрита (сухого вещества кала) приходится 4 части воды. В 1 грамме кала содержится 1/5 грамма сухого вещества и 4/5 грамма воды.

Примем, что эластаза-1 содержится только в сухом веществе кала, тогда в 1/5 грамма детрита содержится в норме от 200 и более мкг эластазы-1. Отсюда следует, что в 1 грамме сухого вещества кала содержится эластазы-1 в 5 раз больше, т.е. от 1000 до 2500 и более мкг.

При изменении консистенции кала соотношение масс сухого вещества и воды будет изменяться, и как следствие этого будет изменяться концентрация эластазы-1 в 1 грамме кала, но не в массе сухого вещества кала. Поэтому правильнее определять концентрацию эластазы-1 не в кале, а в сухом веществе кала (детрите). Но определять концентрацию эластазы-1 в высушенном кале нельзя, поэтому полученный результат стандартньм иммуноферментным способом уточняют, учитывая содержание сухого вещества кала в последнем образце кала. Полученный результат сравнивают с нормой содержания эластазы-1 в сухом веществе кала (норма от 1000 до 2500 и более мкг на 1 г сухого вещества кала).

Жидкий кал может образовываться либо в результате гиперсекреции слизи, либо повышенной моторной функции кишечника, либо воспалительной экссудацией слизистых кишок, либо вследствие транссудации при нарушении кровообращения. То есть вся эта жидкость, которая отсутствует в нормально оформленном кале, будет разводить эластазу-1 и ее концентрация в 1 грамме кала будет уменьшаться, но общее количество на всю массу кала будет прежнее. "Способ определения концентрации фекальной панкреатической эластазы-1" позволяет получать значения концентрации эластазы-1 в жидком кале, не учитывая патологическую жидкость, которая отсутствует в нормально оформленном кале.

Осуществление способа.

Для измерения эластазы-1 берут 100 мг кала и определяют концентрацию эластазы-1 как написано в инструкции иммуноферментного метода ScheBoPancreatic Elastase I, ScheBoBiotech. Для чего: 1. Приготавливают буфер для образца/промывки и буфер для экстракции. 2. Гомогенизируют и экстрагируют образцы кала. 3. Закапывают 50 мкл экстрагированного разбавленного образца кала из каждого образца в каждые 2 прилегающие лунки. Инкубируют 60 минут при комнатной температуре. Промывают. 4. Инкубируют со вторым антителом (anti E1-bio). Добавляют 50 мкл/лунку 1:100 разбавленных моноклональных антител - anti E1-bio. Инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Промывают. 5. Инкубируют с POD-стрептавидином. Добавляют 50 мкл/лунку готовый к применению POD-стрептавидин (коричневый стаканчик с черной крышечкой). Инкубируют 30 минут в темноте при комнатной температуре. Промывают: опустошают лунки и промывают каждую лунку 3 раза 250 мкл буфера для образца/промывки. 6. Добавляют 100 мкл готового к применению раствора субстрата (красная крышечка) в каждую лунку. Инкубируют 20 минут в темноте при комнатной температуре (в темном месте). 7. Останавливают субстратную реакцию добавлением 100 мкл "stop" раствора в каждую лунку. 8. Измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм или от 405-492 нм. 9. Наносят концентрации стандартов относительно соответствующих им оптических плотностей на стандартную кривую в логарифмическом масштабе. Концентрации образцов могут быть считаны непосредственно со стандартной кривой, так как степень растворения учитывается при вычислении стандартов.

Определяют содержание сухого вещества кала в исследуемом образце кала. Для этого берут какое-либо количество кала (M1) из общего образца для исследования, из которого брали 100 мг кала для проведения иммуноферментного анализа, и высушивают его в сухожаровом шкафу, избавляясь от всей воды, содержащейся в кале. Затем измеряют массу полученного сухого остатка - это и будет масса сухого вещества кала - Md1. Пусть в 1 грамме кала содержится какая-то концентрация эластазы-1, определенная иммуноферментным методом, обозначим ее Са. Концентрацию эластазы-1 в 1 грамме сухого вещества кала (Cd) рассчитывают по формуле:

где Са - концентрация эластазы-1 в 1 грамме кала, полученное с помощью иммуноферментного анализа;

M1 - любая масса кала, используемая для определения сухого вещества кала;

Md1 - масса сухого вещества кала, содержащаяся в M1.

Сравнивают полученное значение эластазы-1 с нормой от 1000 до 2500 и более мкг эластазы-1 в 1 грамме сухого вещества кала.

У больных с патологией желудочно-кишечного тракта, в частности с патологией тонкого и толстого кишечника, очень часто отмечается водянистый стул, что мешает проведению иммуноферментного анализа для определения концентрации фекальной панкреатической эластазы-1. У таких больных необходимо провести мероприятия по лечению диареи и только после формирования нормального стула представляется возможным исследовать фекальную панкреатическую эластазу-1. Предлагаемый способ позволяет, не дожидаясь формирования нормального стула, исследовать эластазу-1 в жидком стуле. Кроме того, предлагаемый метод позволяет получать более точные показатели фекальной панкреатической эластазы-1 у больных с "овечим" калом, что важно для оценки лечебного эффекта проводимых терапевтических мероприятий на экзокринную функцию поджелудочной железы. У больных, страдающих запорами, при иммуноферментном исследовании значение фекальной панкреатической эластазы-1 будет ложно завышаться за счет нарушения соотношения в кале количества воды и сухого вещества кала. Это может привести к тому, что при стандартном иммуноферментном методе исследования у больных с сочетанием экзокринной панкреатической недостаточности и запорами определяемая концентрация эластазы-1 будет в пределах нормы, и следовательно, эластазная панкреатическая недостаточность не будет диагностирована, тогда как при расчете с помощью предложенного метода показатели эластазы-1 получаются ниже, что отражает имеющееся нарушение функции поджелудочной железы. Заявленный способ особенно ценен в тех случаях, когда у больных отмечается разжижение стула, связанное с патологией тонкого и толстого кишечника, которое не позволяет определять показатели фекальной панкреатической эластазы-1 до тех пор, пока не будут нормализированы соответствующие функции кишечника и стул не приобретет оформленный вид.

По предлагаемому способу было обследовано 30 больных. Из них 10 больных - с нормальными каловыми массами, 10 больных - с водянистым калом (диарея, мальабсорбция, болезнь Крона, синдром раздраженной кишки, язвенный колит), 10 больных с "овечим" калом (запоры). Было получено, что рассчитанные по предлагаемому способу показатели фекальной панкреатической эластазы-1 в группе практически здоровых людей соответствуют норме, как и показатели, полученные с помощью стандартного иммуноферментного анализа. В группе больных, страдающих заболеваниями кишечника, сопровождающихся диареей, показатели эластазы-1, полученные стандартным иммуноферментным методом, были ложно занижены. В группе больных, страдающих запорами, концентрация фекальной панкреатической эластазы-1 при определении стандартным иммуноферментньм методом, наоборот, ложно завышались.

Для подтверждения работоспособности способа приводятся следующие клинические примеры.

Пример 1. Больной с диареей. Концентрация эластазы-1, определенная с помощью стандартного иммуноферментного анализа, составила 230 мкг/г кала, то есть нормальное содержание. Для определения концентрации эластазы-1 по заявленному способу, определили массу сухого вещества кала, которая составила 0.3 г в 1 грамме кала. С учетом плотности кала, концентрация эластазы-1 составила 766(6) мкг/г сухого вещества кала (при норме от 1000 до 25000 мкг/г сухого вещества кала), что свидетельствует о наличии у больного панкреатической недостаточности умеренной выраженности, что подтвердилось при дальнейшем обследовании.

Пример 2. Больная с синдромом раздраженного кишечника. Концентрация фекальной панкреатической эластазы-1, определенная стандартным иммуноферментным методом, составила 290 мкг/1 г кала, то есть в пределах нормы. Масса сухого вещества кала в 1 грамме кала составила 0,4 г. При расчете по предлагаемому методу у больной выявляется умеренная панкреатическая недостаточность (концентрация эластазы-1 725 мкг/1 г сухого вещества), которая не была выявлена при стандартном исследовании. Наличие умеренной панкреатической недостаточности подтвердилось при дальнейшем обследовании больной.

Пример 3. Больная с болезнью Крона и хроническим панкреатитом. При исследовании с помощью стандартного иммуноферментного метода концентрация эластазы составила 180 мкг/1 г кала, то есть определяется умеренная степень панкреатической недостаточности. Однако при учете плотности кала (в 1 грамме кала содержалось 0,6 г сухого вещества) концентрация эластазы-1 составила 300 мкг/1 г массы сухого вещества кала, что соответствует выраженной панкреатической недостаточности. Более точное определение концентрации эластазы-1 позволило выбрать наиболее оптимальную схему лечения.

Пример 4. Практически здоровый больной А., 57 лет. Концентрация фекальной панкреатической эластазы-1, определенная стандартным иммуноферментным методом, составила 310 мкг/1 г кала, масса сухого вещества кала в 1 грамме кала составляла 0,17, при использовании предлагаемого метода получена концентрация эластазы-1 1823 мкг/1 г массы сухого вещества кала, что соответствует показателям нормы (1000-2500 мкг/г сухого вещества кала).

Таким образом, предлагаемый способ имеет важное значение для оценки экзокринной функции поджелудочной железы у больных с патологией желудочно-кишечного тракта, в частности с патологией тонкого и толстого кишечника. Использование способа позволяет определять содержание фекальной панкреатической эластазы-1 при любой консистенции кала, дает возможность контролировать содержание фекальной панкреатической эластазы-1 в динамике вне зависимости от изменения консистенции кала у пациентов. Способ позволяет повысить точность и объективность результатов.