ингибиторы фарнезилтрансферазы

Формула изобретения

1. Соединение формулы (I)

где R¹ представляет водород или группу формулы R⁵(C(O))-, где R⁵ представляет фенил, пиридил или N-метилпиперидин;

R² представляет водород, изопропил, циклопентил или N-метилтетрагидропиридил;

R ³ представляет водород или галоген;

R⁴ представляет водород или галоген;

L представляет -СН ₂-Z-, где Z представляет NH;

Y представляет S, S(O) или S(O)₂,

или его соль.

2. Соединение формулы (I) по п.1, где R³ представляет галоген.

3. Соединение формулы (I) по п.2, где R³ представляет фтор.

4. Соединение формулы (I) по любому из пп.1-3, где R⁴ представляет водород или фтор.

5. Соединение формулы (I) по любому из пп.1-3, где Y представляет S или S(O) ₂.

6. Соединение формулы (I) по любому из предшествующих пунктов, где хиральный атом углерода во 2-м положении между карбонилом и амином в формуле I имеет (S)-конфигурацию.

7. Соединение формулы (I) по любому из предшествующих пунктов, где хиральный атом углерода во 2-м и 4-м положениях пирролидинового кольца в формуле I имеет (S)-конфигурацию.

8. Изопропил-(2S)-2-({2-(4-фторфенэтил)-5-[({(2S,4S)-4-[(3-пиридинилкарбонил)сульфанил]тетрагидро-1Н-пиррол-2-ил}метил)амино] бензоил}амино)-4-(метилсульфанил)бутаноат или его соль.

9. (2S)-2-({2-(4-Фторфенэтил)-5-[({(2S,4S)-4-(меркапто)-тетрагидро-1Н-пиррол-2-ил}метил)амино]бензоил}амино)-4-(метилсульфанил)бутановая кислота или ее соль.

10. Изопропил-(2S)-2-({2-(4-фторфенэтил)-5-[({(2S,4S)-4-(меркапто) тетрагидро-1Н-пиррол-2-ил}метил)амино]бензоил}амино)-4-(метилсульфанил)бутаноат или его соль.

11. Соединение формулы (I)

где R¹ представляет бензоил, R² представляет N-метилпиперидин-4-ил; R³ представляет фтор; L представляет -СН₂-О-; Y представляет S.

12. Соединение формулы (I)

где R¹ представляет пиридил-3-илкарбонил, R ² представляет изопропил; R³ представляет фтор; L представляет -СН₂-O-; Y представляет SO ₂.

13. Соединение формулы (I)

где R¹ представляет бензоил, R² представляет N-метилпиперидин-4-ил; R³ представляет фтор; L представляет -CH₂-NH-; Y представляет S.

14. Соединение по п.8, представляющее собой гидрохлорид изопропил-(2S)-2-({2-(4-фторфенэтил)-5-[({(2S,4S)-4-[(3-пиридинилкарбонил)сульфанил]тетрагидро-1Н-пиррол-2-ил}метил)амино] бензоил}амино)-4-(метилсульфанил)бутаноата.

15. Соединение по любому из пп.1-14 для использования в качестве лекарственного средства для лечения рака, опосредованного через фарнезилирование ras.

16. Фармацевтическая композиция для лечения рака, опосредованного через фарнезилирование ras, содержащая соединение по любому из пп.1-14 вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

17. Соединение по любому из пп.1-14, предназначенное для получения лекарственного средства, используемого при лечении рака, опосредованного через фарнезилирование ras.

18. Способ получения соединения формулы (I), как определено в п.1, включающий взаимодействие соединения формулы (II)

где L, R³ и R⁴ имеют значения, указанные в п.1, R¹' представляет группу R¹, как она определена в п.1, или ее предшественник и R⁵ представляет защитную группу,

с соединением формулы (III)

где Y имеет значения, указанные в п.1; и R² ' представляет группу R², как она определена в п.1, или ее предшественник,

и после этого, при желании или если необходимо, осуществление одной или нескольких из следующих стадий:

а) удаление защитных групп R⁵;

b) превращение любых групп-предшественников R¹' и R²' в группы R¹ и R² и

с) превращение вышеуказанных групп в различные R¹ , R² группы.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к соединениям, которые ингибируют фарнезилирование генных продуктов посредством ингибирования фермента, фарнезилпротеинтрансферазы (ФПТ-аза, APTase). Кроме того, изобретение относится к способам получения соединений, фармацевтическим композициям и к способам лечения заболеваний, в частности рака, которые опосредованы через фарнезилирование.

Рак, как считают, влечет за собой изменение в экспрессии или функционировании генов, регулирующих рост и дифференциацию клеток. Не желая углубляться в теоретические рассуждения, нижеследующий текст излагает научную основополагающую информацию, имеющую отношение к ras при раке. Гены ras часто мутируют в опухолях. Гены ras кодируют белки, связывающие гуанозинтрифосфат (ГТФ, GTP), которые, как считают, вовлечены в сигнальную трансдукцию, пролиферацию и злокачественную трансформацию. Гены Н-, К и N-ras были идентифицированы как мутантные формы ras (Barbacid M, Ann. Rev. Biochem. 1987, 56:779-827). Для биологической активности требуется посттрасляционная модификация белка ras. Фарнезилирование ras, катализируемое ФПТ-азой, как считают, представляет существенную стадию в процессинге ras. Оно происходит путем переноса фарнезильной группы фарнезилпирофосфата (ФПФ, FPP) на цистеин при С-концевом тетрапептиде ras в структурном мотиве, называемом последовательностью (блоком) СААХ. После дополнительных посттрансляционных модификаций, включая протеолитическое расщепление у остатка цистеина последовательности СААХ и метилирование карбоксила цистеина, ras способен прикрепляться к клеточной мембране для передачи сигналов роста во внутреннюю часть клетки. В нормальных клетках, чтобы стимулировать рост клеток, активированный ras, как считают, действует в сочетании с факторами роста. В случае опухолевых клеток предполагают, что мутации в ras заставляют его стимулировать деление клеток даже в отсутствие факторов роста (Travis J, Science 1993, 260: 1877-1878), возможно благодаря тому, что ras постоянно находится в активированной ГТФ-ом форме, а не возвращается обратно в ГДФ (GDP)-инактивированную форму. Ингибирование фарнезилирования мутантных продуктов гена ras может блокировать или уменьшить активацию.

Один класс известных ингибиторов фарнезилтрансферазы базируется на аналогах фарнезилпирофосфата; смотри, например, европейскую патентную заявку ЕР 534546 от Merck. Имеются сообщения об ингибиторах фарнезилтрансферазы, основанных на имитации последовательности СААХ. Reiss (1990) in Cell 62, 81-8 раскрывает тетрапептиды, такие как CVIM (Cys-Val-Ile-Met). James (1993) in Science 260, 1937-1942 раскрывает пептидомиметические соединения на основе бензодиазепина. Lerner (1995) in J. Biol. Chem. 270, 26802, и Eisai в международной патентной заявке WO 95/25086 раскрывают дополнительные пептидомиметические соединения, содержащие Cys в качестве первого остатка. Европейский патент ЕР 696593 и PCT/GB96/01810 раскрывают дополнительные ингибиторы фарнезилтрансферазы, включая производные пирролидина. Кроме того, ряд ингибиторов фарнезилирования ras раскрыты и заявлены в PCT/GB99/00369.

Нами было обнаружено, что конкретное замещение пирролидина обеспечивает особые преимущества в плане ингибирования фарнезилтрансферазы.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается соединение формулы (I)

где R¹ и R² независимо выбраны из Н или фрагмента пролекарства;

R³ представляет водород или галоген;

R⁴ представляет водород или галоген;

L представляет -СН=СН- или -CH₂ -Z-, где Z представляет NH или О;

Y представляет S, S(O) или S(O)₂;

или его соль.

Используемый здесь термин «алкил» относится к группам с прямой или разветвленной цепью, которые могут, если не оговорено иначе, иметь от 1 до 20 и предпочтительно от 1 до 6 углеродных атомов. Термин "арил" включает фенил. Термин «галоген» включает фтор, хлор, бром или иод.

Термин «гетероциклил» или «гетероциклический» включают группы, имеющие от 4 до 10 атомов в кольце, вплоть до 5, из которых выбраны из кислорода, серы и азота. Кольца могут быть моно- или бициклическими и каждое кольцо может быть ароматического или неароматического типа.

Если валентность кольца позволяет, то атомы азота могут быть замещены либо водородом, либо группой-заместителем, такой как, алкил. Атомы серы в гетероциклическом кольце могут быть окислены в S(O) или S(O)₂ группы.

Примеры ароматических 5- или 6-членных гетероциклических кольцевых систем включают имидазол, триазол, пиразин, пиримидин, пиридазин, пиридин, изоксазол, оксазол, изотиазол, тиазол и тиофен. 9- или 10-членная бициклическая гетероарильная кольцевая система представляет ароматическую бициклическую кольцевую систему, включающую 6-членное кольцо, конденсированное либо с 5-членным кольцом, либо с другим 6-членным кольцом. Примеры 5/6 и 6/6 бициклических кольцевых систем включают бензофуран, бензимидазол, бензтиофен, бензтиазол, бензизотиазол, бензоксазол, бензизоксазол, пиридоимидазол, пиримидоимидазол, хинолин, изохинолин, хиноксалин, хиназолин, фталазин, циннолин и нафтиридин.

Предпочтительно моноциклические гетероарильные кольца содержат вплоть до 3 гетероатомов, а бициклические гетероарильные кольца содержат вплоть до 5 гетероатомов. Предпочтительными гетероатомами являются N и S, особенно N. Обычно присоединение гетероциклических колец к другим группам осуществляется через атомы углерода. Подходящими гетероциклическими группами, содержащими только N в качестве гетероатома, являются пиррол, пиридин, индол, хинолин, изохинолин, имидазол, пиразин, пиримидин, пурин и птеридин.

Гидрированные или другие замещенные формы вышеупомянутых ароматических колец, (которые являются неароматическими), такие как пирролидиновые, пиперидиновые или морфолиновые кольца, являются примерами неароматических гетероциклических групп.

В данной области известны различные формы пролекарств. В качестве примеров таких производных пролекарства, смотри

a) Design of Prodrugs, edited by H. Bundgaard, (Elsevier, 1985) and Methods in Enzymology, Vol. 42, p. 309-396, edited by K. Widder, et al. (Academic Press, 1985);

b) A Textbook of Drug Design and Development, edited by Krogsgaard-Larsen;

c) Н. Bundgaard, Chapter 5 «Design and Application of Prodrugs», by H. Bundgaard p. 113-191 (1991);

d) H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8, 1-38 (1992);

e) H. Bundgaard, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285 (1988) and

f) N. Kakeya, et al., Chem Pharm Bull, 32, 692 (1984).

Подходящими примерами групп R¹ являются водород или группы пролекарств формулы R⁵C(O)-, где R ⁵ представляет необязательно замещенную арильную или гетероциклильную группу. В частности, R⁵ представляет необязательно замещенный фенил, необязательно замещенный пиридил, необязательно замещенный фурил, необязательно замещенный изоксазол, необязательно замещенный тетрагидропиридил или необязательно замещенный тетрагидрофурил.

Подходящие заместители для R⁵ включают алкильные группы, такие как метильные, галоидалкильные группы, такие как трифторметил, гидрокси, алкокси, такая как метокси, или циано.

Предпочтительно R⁵ представляет фенил, пиридил или N-метилпиперидин.

Примеры групп пролекарств для R ² представляют in vivo расщепляемые сложноэфирные группы фармацевтически приемлемого сложного эфира, который расщепляется в организме человека или животного с получением исходной кислоты. Соответственно, R² вместе с карбоксигруппой, с которой он связан, образует фармацевтически приемлемые сложные эфиры, такие как C₁-₆алкиловые сложные эфиры или C₁-₆циклоалкиловые сложные эфиры, например метиловый, этиловый, пропиловый, изопропиловый, н-бутиловый или циклопентиловый; C₁-₆алкоксиметиловые сложные эфиры, например метоксиметиловый; C₁-₆алканоилоксиметиловые сложные эфиры, например пивалоилоксиметиловый; фталидиловые сложные эфиры; С₃-₈циклоалкоксикарбонилоксиС ₁-₆алкиловые сложные эфиры, например 1-циклогексилкарбонилоксиэтиловый; 1,3-диоксолан-2-илметиловые сложные эфиры, например 5-метил-1,3-диоксолан-2-илметиловый; C₁-₆алкоксикарбонилоксиэтиловые сложные эфиры, например 1-метоксикарбонилоксиэтиловый; аминокарбонилметиловые сложные эфиры и их моно- или ди-N-(C_1-6алкил) разновидности, например N,N-диметиламинокарбонилметиловые сложные эфиры и N-этиламинокарбонилметиловые сложные эфиры, и фармацевтически приемлемые сложные эфиры необязательно замещенных гетероциклических групп.

Так, в частности, R ² выбран из водорода, С_1-4алкильной группы, такой как изопропил, или циклопентила, или необязательно замещенной гетероциклической группы, такой как N-метилтетрагидропиридил.

R³ представляет соответственно атом галогена, в частности фтор.

R⁴ представляет предпочтительно водород или фтор, в частности представляет водород.

Связывающая группа L представляет предпочтительно группу формулы CH₂ -Z-, где Z представляет NH или О.

Группа Y представляет предпочтительно группу S, S(O) или S(O)₂. Следует понимать, что поскольку некоторые из соединений вышеопределенной формулы I могут существовать в оптически активных или рацемических формах вследствие наличия одного или нескольких асимметрических атомов углерода, изобретение включает в свой объем, по определению, любую такую оптически активную или рацемическую форму, которая обладает способностью ингибировать ФПТ-азу. Синтез оптически активных форм может быть осуществлен обычными способами органической химии, хорошо известными в данной области техники, например путем синтеза из оптически активных исходных веществ или путем разделения рацемической формы. Аналогично ингибирующую способность в отношении ФПТ-азы можно оценить, используя стандартные лабораторные методики, упоминаемые ниже.

Хиральные атомы углерода в 2 и 4-положениях пирролидинового кольца в формуле I предпочтительны в (S) конфигурации.

Хиральный атом углерода в 2-положении между карбонилом и амином в формуле I предпочтителен в (S) конфигурации.

Соединения формулы I могут образовывать соли, которые входят в объем изобретения. Фармацевтически приемлемые соли предпочтительны, хотя могут быть использованы и другие соли, например, для выделения или очистки соединений.

В том случае, когда соединение содержит основной фрагмент, оно может образовывать фармацевтически приемлемые соли с рядом неорганических или органических кислот, например хлористоводородной, бромистоводородной, серной, фосфорной, трифторуксусной, лимонной или малеиновой кислотой. В том случае, когда соединение содержит кислотный фрагмент, подходящей фармацевтически приемлемой солью изобретения является соль щелочного металла, например соль натрия или калия, соль щелочноземельного металла, например соль кальция или магния, соль аммония или соль с органическим основанием, которое предоставляет фармацевтически приемлемый катион, например соль с метиламином, диметиламином, триметиламином, пиперидином, морфолином или трис-(2-гидроксиэтил)амином. Конкретными солями соединений изобретения являются ацетаты, алкилсульфонаты, такие как метил- или этилсульфонат, фумараты, формиаты, сукцинаты и глюконаты.

Сольваты, например гидраты, также входят в объем изобретения и их можно получить общеизвестными способами.

Конкретные примеры соединений формулы (I) представлены в таблице 1.

Таблица 1
Соед.№	R1	R 2	R3	L	Y
1	Н	Н	F	-CH2NH-	S
2	Н	-СН(СН3) 2	F	-CH 2NH-	S
3			F	-СН 2О-	S
4		-СН(СН3) 2	F	-CH 2NH-	S
5			F	-CH 2NH-	S
6		-СН(СН3) 2	F	-CH 2NH-	S
7		-СН(СН3) 2	F	-СН 2О-	SO2
8		-СН(СН3) 2	F	-CH 2NH-	S
9		-СН(СН3) 2	F	-CH=CH-	S

В соответствии с другим аспектом изобретения предлагается соединение формулы (I) для применения в качестве лекарственного средства.

Кроме того, в соответствии с изобретением обеспечивается соединение формулы (I) для применения при изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания, опосредованного через фарнезилирование ras, в частности рака.

Соединение соответствующим образом включают в состав фармацевтической композиции для использования таким путем.

Таким образом, в соответствии с очередным аспектом изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая описанное выше соединение формулы (I) вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

В соответствии с другим аспектом изобретения предлагается способ лечения заболеваний, опосредованных через ras, особенно рака, путем введения эффективного количества соединения формулы (I) млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении.

В соответствии с другой особенностью изобретения предлагается соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль для применения в способе лечения человека или животного терапевтическим путем.

Кроме того, изобретение предлагает применение соединения формулы (I) для получения лекарственного средства для использования при лечении заболевания или состояния, опосредованного через фарнезилирование, такого как рак.

Конкретные разновидности рака, которые можно лечить соединением или композицией настоящего изобретения включают

- карциному, включая карциному мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, почки, печени, легкого, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и кожи;

- гемопоэтические опухоли лимфоидного происхождения, включая острый лимфоцитарный лейкоз, лимфому В-клеток и лимфому Беркитта;

- гемопоэтические опухоли миелоидного происхождения, включая острые и хронические миелогенные лейкозы и промиелоцитный лейкоз;

- опухоли мезенхимного происхождения, включая фибросаркому и рабдомиосаркому, и

- другие опухоли, включая меланому, семиному, тетратокарциному, нейробластому и глиому.

Соединения формулы I особенно полезны для лечения опухолей, имеющих высокий уровень мутации ras, таких как опухоли толстой кишки, легкого и поджелудочной железы. При введении композиции, содержащей одно из соединений (или комбинацию из соединений) данного изобретения, рост опухолей у хозяина-млекопитающего уменьшается.

Соединения формулы (I) можно также использовать для лечения заболеваний, других, чем рак, которые могут быть связаны с путями сигнальной трансдукции, функционирующими через ras, например нейрофиброматоз.

Кроме того, соединения формулы (I) могут быть полезны для лечения заболеваний, ассоциированных с СААХ-содержащими белками, отличными от ras (например, ядерные ламины и трансдуцин), которые также посттрансляционно модифицируются ферментом, фарнезилпротеинтрансферазой.

Композиции изобретения могут быть в форме, подходящей для перорального применения (например, в виде таблеток, лепешек, твердых и мягких капсул, водных или масляных суспензий, эмульсий, диспергируемых порошков или гранул, сиропов или эликсиров), для местного применения (например, в виде кремов, мазей, гелей или водных или масляных растворов или суспензий), для введения посредством ингаляции (например, в виде тонко измельченного порошка или жидкого аэрозоля), для введения посредством инсуффляции (например, в виде тонко измельченного порошка) или для парентерального введения (например, в виде стерильного водного или масляного раствора для внутривенного, подкожного или внутримышечного дозирования или в виде суппозитория для ректального дозирования).

Композиции изобретения можно получить стандартными способами, используя стандартные фармацевтические эксципиенты, общеизвестные в данной области. Так, композиции, предназначенные для перорального применения, могут содержать, например, один или несколько красителей, подслащивающих агентов, ароматизаторов и/или консервантов.

Подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты для композиций таблеток включают, например, инертные разбавители, такие как лактоза, карбонат натрия, фосфат кальция или карбонат кальция, гранулирующие и дезинтегрирующие средства, такие как кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связующие средства, такие как крахмал; смазки, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк; консерванты, такие как этил- или пропил-п-гидроксибензоат, и антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота. Композиции для таблеток могут быть покрыты или непокрыты (оболочкой) либо для того, чтобы модифицировать их распадаемость и последующее всасывание активного компонента внутри желудочно-кишечного тракта, либо для того, чтобы улучшить их стабильность и/или внешний вид, в любом случае для этого используют обычные средства для покрытия и способы покрытия, известные в данной области.

Композиции для перорального применения могут быть в форме твердых желатиновых капсул, в которых активный компонент смешивают с инертным твердым разбавителем, например карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный компонент смешивают с водой или маслом, таким как арахисовое масло, жидкий парафин или оливковое масло.

Водные суспензии обычно содержат активный компонент в тонко измельченной порошкообразной форме вместе с одним или несколькими суспендирующими средствами, такими как натрийкарбоксиметилцеллюяоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь; диспергирующими или увлажняющими средствами, такими как лецитин или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами (например, полиоксиэтиленстеарат), или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, получаемыми из жирных кислот и гексита, такие как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, получаемыми из жирных кислот и ангидридов гексита, например полиэтиленсорбитанмоноолеат. Водные суспензии могут также содержать один или несколько консервантов (таких как этил- или пропил-п-гидроксибензоат), антиоксидантов (таких как аскорбиновая кислота), красителей, ароматизаторов и/или подслащивающих средств (таких как сахароза, сахарин или аспартам).

Масляные суспензии могут быть составлены путем суспендирования активного компонента в растительном масле (таком как арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло или кокосовое масло) или в минеральном масле (таком как жидкий парафин). Масляные суспензии могут также содержать загуститель, такой как пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Для получения приятного на вкус перорального препарата могут быть добавлены подслащивающие средства, такие как средства, представленные выше, и ароматизаторы. Такие композиции могут быть законсервированы добавлением антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.

Диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для получения водной суспензии путем добавления воды, обычно содержат активный компонент вместе с диспергирующим или увлажняющим средством, суспендирующим средством и одним или несколькими консервантами. Примерами подходящих диспергирующих или увлажняющих средств и суспендирующих средств могут служить упомянутые выше соответствующие средства. Кроме того, могут присутствовать дополнительные эксципиенты, такие как подслащивающие вещества, ароматизаторы и красители.

Фармацевтические композиции изобретения могут быть в форме эмульсий масло-в-воде. Масляную фазу может представлять растительное масло, такое как оливковое масло или арахисовое масло, или минеральное масло, такое как, например, жидкий парафин, или смесь из любых вышеупомянутых масел. Подходящими эмульгирующими средствами могут быть, например, смолы природного происхождения, такие как аравийская камедь или трагакантовая камедь, встречающиеся в природе фосфатиды, такие как соя, лецитин, сложные эфиры или неполные сложные эфиры, полученные из жирных кислот и ангидридов гексита (например, сорбитанмоноолеат) и продукты конденсации вышеуказанных неполных сложных эфиров с этиленоксидом, такие как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Эмульсии могут также содержать подслащивающие средства, ароматизаторы и консерванты.

Сиропы и эликсиры могут быть составлены с подслащивающими средствами, такими как глицерин, пропиленгликоль, сорбит, аспартам или сахароза, и, кроме того, могут содержать средство для смягчения, консервант, ароматизатор и/или краситель.

Фармацевтическая композиция может быть также в форме стерильной инъецируемой водной или масляной суспензии, которая может быть получена известными способами, используя один или несколько из соответствующих диспергирующих или увлажняющих средств и суспендирующих средств, которые были упомянуты выше. Кроме того, стерильный инъецируемый препарат может быть в виде инъецируемого раствора или суспензии в нетоксичном парентерально-приемлемом разбавителе или растворителе, например в виде раствора в 1,3-бутандиоле.

Составы суппозитория можно получить смешением активного компонента с подходящим нераздражающим наполнителем, который представляет твердое вещество при обычных температурах, но становится жидким при ректальной температуре и поэтому будет плавиться в прямой кишке, освобождая при этом лекарственное средство. К подходящим эксципиентам относятся, например, масло какао и полиэтиленгликоли.

Композиции для местного применения, такие как кремы, мази, гели и водные или масляные растворы или суспензии, могут быть получены путем объединения в состав активного компонента с обычным, приемлемым для местного применения, наполнителем или разбавителем, используя обычный способ, хорошо известный в данной области.

Композиции для введения посредством инсуффляции могут быть в форме тонко измельченного порошка, содержащего частицы, имеющие средний диаметр, например, 30 мкм или гораздо меньше, при этом порошок, сам по себе, включает либо только активный компонент, либо он представляет порошок активного компонента, разбавленный одним или несколькими физиологически приемлемыми носителями, такими как лактоза. В таком случае порошок для инсуффляции удобно хранить в капсуле, содержащей, например, от 1 до 50 мг активного компонента, для применения с турбоингалятором такого типа, как используют для инсуффляции известного средства, кромогликата натрия.

Композиции для введения посредством ингаляции могут быть в виде стандартного аэрозоля под давлением, приспособленного для распыления активного компонента либо в виде аэрозоля, содержащего тонко измельченное твердое вещество, либо в виде жидких капель. Можно использовать обычные аэрозольные пропелланты, такие как летучие фторированные углеводороды или углеводороды, и аэрозольное устройство соответственно сконструировано таким образом, чтобы распылять контролируемое количество активного компонента.

Дополнительную информацию по составу можно найти в Chapter 25.2 in Volume 5 of Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990.

Количество активного компонента, которое объединяют с одним или несколькими эксципиентами, чтобы получить разовую дозированную форму, неизбежно будет варьироваться в зависимости от хозяина, подлежащего лечению, и конкретного пути введения. Например, композиция, предназначенная для перорального введения людям, обычно содержит, например, от 0,5 мг до 2 г активного средства, компаундированного с соответствующим и подходящим количеством эксципиентов, которое может варьироваться от примерно 5 до примерно 98 мас.% от общей массы композиции. Разовая дозированная форма обычно содержит от примерно 1 до примерно 500 мг активного компонента. Дополнительную информацию по путям введения и схемам приема лекарственного средства можно найти в Chapter 25.3 in Volume 5 of Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990.

Согласно общеизвестным принципам медицины уровень дозы соединения формулы I в случае применения его для терапевтических или профилактических целей будет естественно варьироваться в соответствии с природой и тяжестью состояний, возраста и пола животного или пациента и пути введения. Как упоминалось выше, соединения формулы I полезны для лечения заболеваний или медицинских состояний, которые обусловлены исключительно или частично воздействием фарнезилирования ras.

При использовании соединения формулы I для терапевтических или профилактических целей его обычно вводят так, чтобы получить суточную дозу в диапазоне, например, от 0,5 до 75 мг на 1 кг массы тела, которую принимают в течение суток, если требуется, в виде разделенных доз. В общем, можно применять более низкие дозы в том случае, когда используют парентеральный путь введения. Так, например, для внутривенного введения обычно используют дозу в диапазоне, например, от 0,5 до 30 мг на 1 кг массы тела. Аналогично в случае введения путем ингаляции обычно используют дозу в диапазоне, например, от 0,5 до 25 мг на 1 кг массы тела. Однако пероральное введение предпочтительно.

Соединения формулы (I), определенные выше, могут использоваться в качестве единственного лечения или могут включать, помимо соединения изобретения, одно или несколько других веществ и/или лечений. Такое комбинированное лечение может достигаться посредством одновременного, последовательного или раздельного введения индивидуальных компонентов лечения. В области онкологической медицины, для лечения каждого пациента с заболеванием рак, на практике используют комбинацию различных форм лечения. В онкологической медицине, помимо определенного здесь ранее лечения, ингибирующего цикл клетки, другим(ими) компонентом(ами) такого комбинированного лечения могут быть хирургическое вмешательство, радиотерапия или химиотерапия. Такая химиотерапия может охватывать три основные категории терапевтического средства

(i) другие средства, ингибирующие клеточный цикл, которые работают по тем же механизмам или по механизмам, отличающимся от изложенных здесь ранее;

(ii) цитостатические средства, такие как антиоэстрогены (например, фулвестрант, тамоксифен, торемифен, ралоксифен, дролоксифен, иодоксифен), прогестогены (например, мегестрол ацетат), ингибиторы ароматазы (например, анастрозол, летразол, воразол, ексеместан), антипрогестогены, антиандрогены (например, флутамид, нилутамид, бикалутамид, ципротерон ацетат), агонисты и антагонисты ЛГВГ (LHRH) (например, госерелин ацетат, лупролид), ингибиторы тестостерон-5-дигидроредуктазы (например, финастерид), антиинвазивные средства (например, ингибиторы металлопротеиназы, подобные маримастату, и ингибиторы функции рецептора активатора плазминогена урокиназы) и ингибиторы функции фактора роста (такие факторы роста включают, например, тромбоцитарный фактор роста и фактор роста гепатоцита; такие ингибиторы включают антитела фактора роста, антитела рецептора фактора роста, ингибиторы тирозинкиназы и ингибиторы серин/треонин киназы) и

(iii) антипролиферативные/антинеопластические средства и их комбинации, используемые в онкологической медицине, такие как антиметаболиты (например, антифолаты, подобные метотрексату, фторпиримидины, подобные 5-фторурацилу, аналоги пурина и аденозина, цитозин арабинозид); противоопухолевые антибиотики (например, антрациклины, подобные доксорубицину, дауномицину, эпирубицину и идарубицин, митомицину-С, дактиномицину, митрамицину); производные платины (например, цисплатин, карбоплатин); алкилирующие средства (например, мустард азота, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, циклофосфамид, ифосфамид, нитрозомочевины, тиотепа); антимитотические средства (например, винкаалкалоиды, подобные винкристину, и таксоиды, подобные таксолу, таксотеру); ингибиторы топоизомеразы (например, эпиподофиллотоксины, подобные етопозиду и тенипозиду, амсакрину, топотекану). В соответствии с этим аспектом изобретения обеспечивается фармацевтический продукт для комбинированного лечения рака, включающий соединение формулы (I), определенное выше, и дополнительное противоопухолевое вещество, определенное здесь ранее.

Хотя соединения формулы (I) представляют ценность, главным образом, как терапевтические средства для использования применительно к теплокровным животным (включая человека), они, кроме того, находят применение всякий раз, когда требуется ингибировать фарнезилирование. Поэтому они полезны в качестве фармакологических стандартов для выработки новых биологических тестов и для исследования новых фармакологических средств.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагаются индивидуальные соединения, представляющие собой конечные продукты и их соли, полученные в представленных ниже примерах.

Соединение изобретения или его соль можно получить любым известным способом, который применяется для получения таких соединений или структурно родственных соединений. Такие способы иллюстрируются нижеследующими представительными схемами, в которых, если не оговорено иначе, переменные группы имеют любое из значений, определенных для формулы I. Функциональные группы могут быть защищены и впоследствии с них может быть снята защита стандартными способами. Примеры защитных групп, таких как аминозащитные группы и группы, защищающие карбоксигруппы (а также способы осуществления защиты и возможные при соответствующих условиях способы снятия защиты), смотри T.W. Greene and P.G.M. Wuts, «Protective Groups in Organic Synthesis», Second Edition, John Wiley & Sons, New York, 1991. Обратите внимание, используемые сокращения перечислены непосредственно перед нижеследующими примерами.

Защитные группы могут быть удалены любым удобным способом, описанным в литературе или известным квалифицированному специалисту-химику, который предназначен для удаления рассматриваемой защитной группы, при этом такие способы выбирают так, чтобы осуществить удаление защитной группы с минимальным воздействием на группы, находящиеся где-либо в другом месте молекулы.

Конкретные примеры защитных групп представлены ниже для удобства, в которых термин «низший» означает, что группа, для которой его применяют, предпочтительно имеет 1-4 углеродных атома. Следует понимать, что эти примеры не являются исчерпывающими. И те конкретные примеры способов удаления защитных групп, которые приводятся ниже, аналогично не являются исчерпывающими. Использование защитных групп и способов снятия защиты, не упомянутых особо, находится, конечно, в пределах объема данного изобретения.

Карбоксизащитная группа может представлять остаток алифатического или аралифатического спирта, образующего сложный эфир, или остаток силанола, образующего сложный эфир (причем указанный спирт или силанол предпочтительно содержит 1-20 углеродных атомов).

Примеры карбоксизащитных групп включают (1-12С)алкильные группы с прямой или разветвленной цепью (например, изопропил, т-бутил); низший алкокси низшие алкильные группы (например, метоксиметил, этоксиметил, изобутоксиметил); низший алифатический ацилокси низшие алкильные группы (например, ацетоксиметил, пропионилоксиметил, бутирилоксиметил, пивалоилоксиметил); низший алкоксикарбонилокси низшие алкильные группы (например, 1-метоксикарбонилоксиэтил, 1-этоксикарбонилоксиэтил); арил низшие алкильные группы (например, п-метоксибензил, о-нитробензил, п-нитробензил, бензгидрил и фталидил); три(низший алкил)силильные группы (например, триметилсилил и т-бутилдиметилсилил); три (низший алкил)силил низшие алкильные группы (например, триметилсилилэтил) и (2-6С)алкенильные группы (например, аллил и винилэтил).

Способы, в частности, предназначенные для удаления групп, защищающих карбоксил, включают гидролиз, катализируемый кислотой, металлом или ферментом.

Примеры гидроксизащитных групп включают низшие алкенильные группы (например, аллил); низшие алканоильные группы (например, ацетил); низшие алкоксикарбонильные группы (например, т-бутоксикарбонил); низшие алкенилоксикарбонильные группы (например, аллилоксикарбонил); арил низшие алкоксикарбонильные группы (например, бензоилоксикарбонил, п-метоксибензилоксикарбонил, о-нитробензилоксикарбонил, п-нитробензилоксикарбонил); три низший алкил/арилсилильные группы (например, триметилсилил, т-бутилдиметилсилил, т-бутилдифенилсилил); арил низшие алкильные группы (например, бензил) и триарил низшие алкильные группы (например, трифенилметил).

Примеры аминозащитных групп включают формил, аралкильные группы (например, бензил и замещенный бензил, например п-метоксибензил, нитробензил и 2,4-диметоксибензил и трифенилметил); ди-п-анизилметильные и фурилметильные группы; низший алкоксикарбонил (например, т-бутоксикарбонил); низший алкенилоксикарбонил (например, аллилоксикарбонил); арил низшие алкоксикарбонильные группы (например, бензилоксикарбонил, п-метоксибензилоксикарбонил, о-нитробензилоксикарбонил, п-нитробензилоксикарбонил); триалкилсилил (например, триметилсилил и т-бутилдиметилсилил); алкилиден (например, метилиден); бензилиден и замещенные бензилиденгруппы.

Способы, предназначенные для удаления гидрокси- и аминозащитных групп, включают, например, гидролиз, катализируемый кислотой, основанием, металлом или ферментом, или протолитически для групп, таких как о-нитробензилоксикарбонил, или фторидными ионами для силильных групп.

Примеры защитных групп для амидных групп включают аралкоксиметил (например, бензилоксиметил и замещенный бензилоксиметил); алкоксиметил (например, метоксиметил и триметилсилилэтоксиметил); триалкил/арилсилил (например, триметилсилил, т-бутилдиметилсилил, т-бутилдифенилсилил); три алкил/арилсилилок-симетил (например, т-бутилдиметилсилилоксиметил, т-бутилдифенилсилилоксиметил); 4-алкоксифенил (например, 4-метоксифенил); 2,4-ди(алкокси)фенил (например, 2,4-диметилоксифенил); 4-алкоксибензил (например, 4-метоксибезил); 2,4-ди(алкокси)бензил (например, 2,4-ди(метокси)бензил, и алк-1-енил (например, аллил, бут-1-енил и замещенный винил, например 2-фенилвинил).

Аралкоксиметильные группы могут быть введены в амидную группу путем взаимодействия последней с соответствующим аралкоксиметилхлоридом и могут быть удалены каталитическим гидрированием. Алкоксиметильные, триалкил/арилсилильные и триалкил/силилоксиметильные группы могут быть введены путем взаимодействием амида с соответствующим хлоридом и удалены кислотой или в случае силилсодержащих групп ионами фторидов. Алкоксифенильные и алкоксибензильные группы соответственно вводят путем арилирования или алкилирования соответствующим галогенидом и удаляют окислением церийаммонийнитратом. Наконец, алк-1-енильные группы можно ввести взаимодействием амида с соответствующим альдегидом и удалить кислотой.

Кроме того, изобретение предлагает способ получения соединения вышеопределенной формулы (I), и этот способ включает взаимодействие соединения формулы (II)

где L, R³ и R⁴ такие, как определены в отношении формулы (I), R^1' представляет R ¹, определенную в отношении формулы (I), или ее предшественник и R⁵ представляет защитную группу, такую как БОК (ВОС),

с соединением формулы (III)

где Y такой, как определен в отношении формулы (I), и R^2' представляет группу R², определенную в отношении формулы (I), или ее предшественник;

и после этого, при желании или если необходимо, осуществление одной или нескольких из следующих стадий:

а) удаление защитных групп R⁵;

b) превращение любых групп R^1' и R^2' предшественников в группы R¹ R² и

c) превращение вышеуказанных групп в различные R¹, R² группы.

Реакцию между соединениями формулы (II) и (III) соответственно осуществляют в органическом растворителе, таком как дихлорметан, в присутствии основания, такого как DMAP и EDC, и необязательно в присутствии нуклеофильного катализатора, такого как 1-гидроксибензтриазол. Используют умеренные температуры, например от 0 до 50°С, удобно использовать температуру окружающей среды.

Группы R^1' и R^2' предшественников могут включать защитные группы, такие как сложноэфирные, которые не являются фармацевтически приемлемыми. Они могут быть превращены в водород или другие группы пролекарства, используя обычные способы, проиллюстрированные ниже.

Удаление защитных групп R⁵ можно выполнить, используя обычные способы, такие как взаимодействие с ТФУ (TFA) и/или триэтилсиланом.

Соединения формулы (II) соответственно получают путем удаления защитных групп из соединения формулы (IV)

где R^1', R³, R⁴, R⁵ и L такие, как определены в отношении формулы (II), и R⁶ представляет защитную группу, в частности алкильную группу, такую как метил. Снятие защиты соответственно осуществляют, используя сильное основание, такое как гидроксид щелочного металла, в частности гидроксид натрия. Реакцию соответственно осуществляют в растворителе, таком как водный спирт, в частности водный метанол, при повышенных температурах, удобно проводить при температуре кипения растворителя.

Соединения формулы (IV), где L представляет -CH₂NH-, можно получить сочетанием соединения формулы (V)

где R³, R⁴ и R⁶ такие, как определено выше,

с альдегидом формулы (VI)

где R^1' и R⁵ такие, как определено выше.

Подходящие условия сочетания включают использование восстанавливающего агента (например, боранпиридин с уксусной кислотой, NaCNBH₃, ВН₃, водород плюс катализатор, LiHBEt₃, диизобутилалюминийгидрид, литийалюминийгидрид, борогидрид) в присутствии подходящего растворителя, например метанола или этанола и уксусной кислоты.

Альдегиды формулы (VI) можно получить восстановлением соединений формулы (VII)

где R^1' и R⁵ такие, как определено выше, R⁶ представляет алкил, такой как метил, и R ⁷ представляет алкокси, такую как метокси.

Используют подходящие сильные восстанавливающие агенты, такие как литийалюминийгидрид или ДИБАЛ (DIBAL). Реакцию осуществляют в растворителе, таком как тетрагидрофуран, при низких температурах, например от -50 до 0°С, в частности примерно при -40°С.

Соединения формулы (VII) соответственно получают взаимодействием соединения формулы (VIII)

где R⁸ представляет удаляемую группу, такую как метансульфонилоксигруппу,

с соединением формулы (IX)

где R^1' такая, как определено выше, и, в частности, представляет трифенилметильную или тритильную группу. Условия реакции должны быть очевидны для специалиста в данной области, но, как правило, реакцию осуществляют в органическом растворителе, таком как этанол, при умеренных температурах, например от 0 до 60°С и предпочтительно примерно при 40°С.

Соединения формулы (VIII) можно получить взаимодействием соединений формулы (X)

где R⁵ и R⁶ и R⁷ такие, как определено выше,

с соединением формулы (XI)

где R⁸ такой, как определен выше, и Z представляет удаляемую группу, такую как галоген, в частности хлор. Реакцию соответственно осуществляют в органическом растворителе, таком как дихлорметан, в присутствии слабого основания, такого как триэтиламин. Используют умеренные температуры, например от 0 до 30°С.

Соединения формулы (X) соответственно получают взаимодействием соединения формулы (XII)

где R⁵ такой, как определен выше, с соединением формулы (XIII)

где R⁶ и R⁷ такие, как определено выше.

Конкретным примером соединения формулы (XIII) является N,O-диметилгидроксиламин. Реакцию соответственно осуществляют в присутствии основания (такого как N-метилморфолин с EDCI) и в органическом растворителе, таком как дихлорметан.

Соединения формулы (XII) можно получить N-защитой соответствующего гидроксипроизводного пролина, используя известные способы.

Соединения формулы (V) соответственно получают гидрированием соединения формулы (XIV)

где R³, R⁴ и R⁶ такие, как определено выше.

Гидрирование соответственно проводят в присутствии катализатора, такого как палладиевый катализатор.

Соединения формулы (XIV) соответственно получают взаимодействием соединения формулы (XV)

где R⁶ такой, как определен выше, и Z представляет удаляемую группу, такую как галоген, такой как бром или хлор, предпочтительно хлор,

с соединением формулы (XVI)

где R³ и R⁴ такие, как определено выше.

Реакцию соответственно осуществляют в присутствии основания, такого как трибутиламин, предпочтительно карбонат натрия, тетрабутиламмонийбромид, и катализатора, такого как палладиевый катализатор, такой как хлорид бис(трифенилфосфин)палладия(II), в подходящем растворителе, предпочтительно диметилформамиде.

Соединения формулы (IV), где Z представляет -CH₂ O-, можно получить взаимодействием соединения формулы (XVII)

где R³, R⁴ и R⁶ такие, как определено выше,

с соединением формулы (XVIII)

где R^1' и R⁵ такие, как определено выше.

Реакцию соответственно осуществляют в условиях, аналогичных условиям, описанным выше для реакции между соединениями формул (V) и (VI).

Соединения формулы (XVIII) соответственно получают восстановлением соединения формулы (VI), например, используя восстанавливающий агент, такой как литийалюминийгидрид. Восстановление осуществляют в обычных условиях в растворителе, таком как тетрагидрофуран.

Соединения формулы (XVII) можно получить, осуществляя защиту соответствующей карбоновой кислоты, например, путем этерификации кислоты, используя спирт, в частности алкиловый спирт, такой как метанол. Реакцию соответственно осуществляют в присутствии сульфурилхлорида или т.п., при повышенных температурах, удобно при температуре кипения растворителя.

Кислоту как таковую можно получить путем снятия защиты с соединения формулы (XIX)

где R³ и R⁴ такие, как определено выше, R¹⁰ и R¹¹ представляют защитные группы, такие как алкил, в частности метильные группы.

Подходящие условия реакции снятия защиты включают нагревание соединения с подходящим реагентом, таким как гидрохлорид пиридина, до высоких температур, таких как, например, от 200 до 250°С, и предпочтительно примерно при 220°С.

Соединения формулы (XIX) получают гидрированием соединения формулы (XX)

где R³, R⁴, R¹⁰ и R ¹¹ такие, как описано выше.

Подходящие условия гидрирования включают условия, приведенные выше для гидрирования соединения формулы (XIV).

Соединения формулы (XX) можно получить взаимодействием соединения формулы (XXI)

где R¹⁰ и R¹¹ такие, как определено выше, и Z" представляет удаляемую группу, такую как галоген, в частности бром,

с соединением формулы (XVI), определенным выше, используя условия, аналогичные условиям, изложенным выше для реакции между соединениями формулы (XV) и (XVI).

Соединения формулы (IV), где L представляет -СН=СН-, соответственно получают взаимодействием соединения формулы (VI), определенного выше, с соединением формулы (XXII)

где R³, R⁴ и R⁶ такие, как определено выше, R¹² представляет ион фосфата, такой как диэтилфосфат, или трифенилфосфиновую группу.

Реакция представляет реакцию Виттинга и ее соответственно проводят в обычных условиях. Подходящими условиями реакции являются использование основания (например, карбонат калия, гидрид металла, алкоксид металла) в присутствии органического растворителя (например, ТГФ (THF), толуол, ДМСО (DMSO)), необязательно в присутствии водного растворителя (2-фазная система) и необязательно в присутствии средства, образующего комплекс с катализатором, которое солюбилизирует ионы щелочного металла в неполярных растворителях, таких как 1,4,7,10,13-пентаоксациклопентадекан (также называемый 15-Краун-5) или 1,4,7,10,13,16-гексаоксациклооктадекан (также называемый 18-Краун-6).

Соединения формулы (XXII) соответственно получают путями, такими как описанные в PCT/GB98/000230 и в конкретном примере 19 той заявки. Детали получения также суммированы далее в схеме 3 ниже.

Если необходимо или желательно, группы R¹ и R² можно заменить на другие различные такие группы после любого из вышеупомянутых способов получения, используя обычную химию, и примеры этого рассматриваются здесь ниже.

Биологическую активность испытывают следующим образом. Фарнезилпротеинтрансферазу (ФПГ, FPT) частично очищают от человеческой плаценты фракционированием раствором сульфата аммония, а затем (разовой) анионообменной хроматографией на Q-Сефарозе® (Pharmacia, Inc), по существу, как описано Ray and Lopes-Belmonte (Ray К Р and Lopes-Belmonte J (1992) Biochemical Society Transations 20 494-497). Субстрат для ФПТ представлял Kras(CVIM С-концевая последовательность). кДНК (cDNA) для онкогенного vall2 варианта c-Ki-ras-2 4В человека получали из плазмиды pSWll-1 (АТСС). Затем ее субклонировали в полилинкер соответствующего вектора экспрессии, например, рIC147. Kras получали после экспрессии в штамме E.Coli, BL21. Об экспрессии и очистке c-KI-ras-2 4B и vall2 варианта в E.coli также сообщали Lowe et al. (Lowe P.N. et al., J. Biol. Chem. (1991) 266, 1672-1678).

Инкубационные пробы с ферментом, содержавшие 300 нМ меченного тритием фарнезилпирофосфата (DuPont/New England Nuclear), 120 нМ ras-CVIM, 50 мМ Трис HCl, рН 8,0, 5 мМ MgCl₂, 10 мкМ ZnCl₂, 5 мМ дитиотеитола и соединения, добавляли при соответствующих концентрациях в ДМСО (DMSO) (3% конечная концентрация в испытываемом образце и контроле-наполнителе). Инкубирование осуществляли в течение 20 минут при 37°С и прерывали кислым этанолом, как описано Pompliano et al. (Pompliano D.L. et al., (1992) 31, 3800-3807). Затем высадившийся белок собирали на пленках (В) фильтра из стеклянного волокна, используя харвестер клеток Tomtec®, и подсчитывали меченную тритием метку в сцинтилляционном счетчике Wallac® 1204 Betaplate.

Хотя, как ожидалось, фармакологические свойства соединений формулы I изменяются при изменении структуры, в общем, в вышеупомянутом испытании соединения формулы I имели ИК₅₀ (IC ₅₀) в диапазоне, например, от 0,01 до 200 мкМ.

Для испытанных соединений настоящего изобретения при эффективной дозе не наблюдали проявления физиологически неприемлемой токсичности.

Далее изобретение иллюстрируется нижеследующими неограничивающими его примерами, в которых, если не оговорено иначе

(i) выпаривание осуществляют при помощи роторного испарения в вакууме и процедуры обработки осуществляют после удаления остаточных твердых веществ фильтрацией;

(ii) операции осуществляют при комнатной температуре, т.е. в диапазоне 18-25°С и в атмосфере инертного газа, такого как аргон;

(iii) колоночную хроматографию (согласно флэш-методике) и жидкостную хроматографию среднего давления (СДЖХ, MPLC) осуществляют на диоксиде кремния Merck Kieselgel (Art. 9385) или на обращенной фазе Merck Lichroprep RP-18, поставляемой Е.Merck, Darmstardt, Germany;

(iv) выходы приводятся только для иллюстрации и они необязательно достигают максимального значения;

(v) конечные продукты формулы I имеют удовлетворительные данные микроанализа и их структуры подтверждены методами ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии; значения химических сдвигов измеряли по дельта-шкале; были использованы нижеследующие аббревиатуры: с (s) - синглет; д (d) - дублет; т (t или tr) - триплет; м (m) - мультиплет; ш (br) - широкий;

(vi) промежуточные соединения, как правило, охарактеризованы неполностью, и чистоту оценивали методом тонкослойной хроматографии, инфракрасной спектроскопии (ИК, IR) или ЯМР-спектрометрии;

(vii) точки плавления не корректировали и определяли, используя автоматический прибор для определения точки плавления типа Mettler SP62 или аппаратуру с масляной баней (инерционно-масляное оборудование); точки плавления для конечных продуктов формулы I определяли после кристаллизации из подходящего органического растворителя, такого как этанол, метанол, ацетон, простой эфир или гексан, из одного или из их смеси, и

(viii) на протяжении всего описания заявки были использованы нижеследующие сокращения:

БОК (ВОС) трет -бутоксикарбонил

ДЦК (DCCI) 1,3-дициклогексилкарбодиимид

ДМА (DMA) N,N-диметилацетамид

ДМАП (DMAP) 4-диметиламинопиридин

ДМФ (DMF) N,N -диметилформамид

ДМСО (DMSO) диметилсульфоксид

EDC(EDC) 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид

ЭЭДХ (EEDQ) 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин

ГОБТ (НОВТ) 1-гидроксибензотриазол

NMM (NMM) N-метилморфолин

NMM-O (NMM-O) 4-метилморфолин-N-оксид

ТФУ (TFA) трифторуксусная кислота

ТГФ (THF) тетрагидрофуран

(TMSI) триметилсилилиодид

ТПАП (TRAP) тетрапропиламмонийперрутенат

Пример 1

Получение соединения №6 таблицы 1

Применяемый способ получения в целом раскрыт на схеме 1 ниже. В частности, смесь соединения (xv), где R представлял N-метилпиперидин (4,8 г), триэтилсилана (10 мл) и ТФУ (200 мл) перемешивают при температуре окружающей среды в течение 1 часа в атмосфере азота. ТФУ выпаривают и остаток растворяют в этилацетате (50 мл). Добавляют HCl в простом эфире (1М, 100 мл), а затем еще простой эфир (100 мл). Полученное белое твердое вещество выделяют центрифугированием, затем промывают простым эфиром и вновь центрифугируют (всего 4 раза). Твердое вещество сушат в высоком вакууме, получая соединение 6 в таблице 1 в виде гидрохлоридной соли (4,5 г).

Соединение 6

Данные ¹H-ЯМР (ДМСО d₆) : 1,14 (6Н, м), 1,7 (1Н, м), 1,8-2,11 (7Н, м), 2,02 (3Н, с), 2,29-3,0 (10Н, м), 2,66 (3Н, д), 3,16 (1Н, м), 3,2-3,52 (3Н, м), 3,62 (1Н, м), 3,78 (1Н, м), 4,0 (1Н, м), 4,46 (1Н, кв), 4,9 (1Н, м), 6,60 (2Н, м), 6,9-7,10 (3Н, м), 7,19 (2Н, м), 8,59 (1Н, д).

МС (ES+) (с электрораспылением) m/z 673,7 (М+Н)⁺ .

Исходное вещество, соединение (xv) на схеме 1, где R представлял N-метилпиперидин, получают следующим образом.

Соединение (xii) является известным соединением и его получают, как описано в примере 6 заявки PCT/GB99/00369. Смесь соединения (xii) (50 г), гидрохлорида изопропилового сложного эфира L-метионина (19,0 г), ДМАП (DMAP) (42,6 г) и EDC (20,0 г) в дихлорметане (500 мл) перемешивают при температуре окружающей среды в течение 18 часов. Раствор промывают водной лимонной кислотой (1 М), насыщенным раствором соли и сушат. Затем разбавляют таким же количеством изогексана и наносят непосредственно на флэш-колонку с диоксидом кремния, элюируют смесью этилацетат/изогексан (20:80, 20:70), получая соединение (xiii) на схеме 1 (58,6 г) в виде твердой белой пены.

Соединение (xiii)

Данные ¹ H-ЯМР (CDCl₃) : 1,26 (6Н, м), 1,38 (9Н, с), 1,41 (1Н, м), 1,58 (1Н, м), 2,02 (1Н, м), 2,05 (3Н, с), 2,15-2,4 (2Н, м), 2,47-2,7 (2Н, м), 2,7-2,98 (6Н, м), 3,06-3,34 (2Н, м), 3,9 (1Н, м), 4,79 (2Н, м), 5,08 (1Н, м), 6,34 (1Н, д), 6,38 (2Н, м), 6,91 (3Н, м), 7,09 (2Н, м), 7,18-7,35 (9Н, м), 7,43 (6Н, м).

МС (ES+) (с электрораспылением) m/z 890,5 (М+Н)⁺.

ТФУ (80 мл) добавляют в быстро перемешиваемый раствор соединения (xiii) (58,6 г) и триэтилсилана (80 мл) в дихлорметане (4 л) в атмосфере азота. Затем раствор перемешивают при температуре окружающей среды в течение 4,5 часов, подщелачивают насыщенным раствором бикарбоната натрия и дихлорметановый слой отделяют. После сушки и выпаривания до меньшего объема (500 мл) содержимое наносят непосредственно на флэш-колонку с диоксидом кремния и элюируют смесью этилацетат/гексан (30:70, 50:50), получая соединение (xiv) на схеме 1 (35,5 г) в виде белого твердого вещества.

Соединение (xiv)

Данные ¹H-ЯМР (CDCl ₃) : 1,25 (6Н, м), 1,46 (9Н, с), 1,5 (1Н, м), 1,68 (1Н, м), 1,70 (1Н, д), 2,00 (1Н, м), 2,08 (3Н, с), 2,21 (1Н, м), 2,56 (2Н, м), 2,75-2,97 (4Н, м), 3,05 (1Н, м), 3,26 (2Н, м), 3,4 (1H, м), 3,85-4,3 (2Н, м), 4,8 (2Н, кв), 5,05 (1H, м), 6,35 (1H, д), 6,6 (2Н, м), 6,92 (3Н, м), 7,1 (2Н, м).

MC (ES+) (с электрораспылением) m/z 648,7 (М+Н)⁺.

Смесь соединения (xiv) (4,5 г), N-метилпиперидин-4-карбоновой кислоты (1,5 г), N-метилпиперидина (3,5 г), EDC (1,6 г) и ГОБТ (НОВТ) (0,94 г) в дихлорметане (100 мл) перемешивают в атмосфере азота в течение 18 часов. Затем наносят непосредственно на флэш-колонку с диоксидом кремния и элюируют смесью этилацетат/изогексан (1:1), этилацетатом, смесью метанол/этиацетат (10:90, 20:80), получая соединение xv на схеме 1, где R представляет N-метилпиперидин, (4,8 г) в виде белой пены.

Данные ¹H-ЯМР (ДМСО d₆) : 1,15 (6Н, м), 1,4 (9Н, с), 1,69 (1H, м), 1,7-2,0 (7Н, м), 2,01 (3Н, с), 2,11 (3Н, с), 2,4-2,6 (4Н, м), 2,63-2,82 (6Н, м), 3,04 (2Н, м), 3,28 (1H, м), 3,42 (1H, м), 3,7-4,0 (3Н, м), 4,44 (1H, м), 4,9 (1H, м), 5,82 (1H, т), 6,6 (2Н, м), 6,9 (1H, м), 7,03 (2Н, т), 7,38 (2Н, м), 8,55 (1H, д).

MC (ES+) (с электрораспылением) m/z 773,6 (М+Н)⁺.

Пример 2

Получают соединения 4 и 8 таблицы 1, используя способ, аналогичный способу, описанному в примере 1, из соединения (xiv) на схеме 1, используя соответствующие промежуточные соединения.

Соединение (xv) на схеме 1, где R представляет фенил

Данные ¹H-ЯМР (CDCl ₃) : 1,28 (6Н, м), 1,50 (9Н, с), 1,50 (1H, м), 1,90 (1H, м), 2,05 (1H, м), 2,07 (3Н, с), 2,23 (1Н, м), 2,57 (2Н, м), 2,69 (1H, м), 2,82 (2Н, м), 2,90 (2Н, м), 3,27 (2Н, м), 3,46 (1Н, м), 4,1 (1H, м), 4,23 (1Н, м), 4,80 (2Н, м), 5,07 (1Н, м), 6,40 (1Н, d), 6,68 (2Н, м), 6,93 (3Н, м), 7,1 (2Н, м), 7,46 (2Н, м), 7,59 (1Н, м), 7,94 (2Н, д).

МС (ЕС+) (с электрораспылением) m/z 752,71 (M+H)⁺.

Соединение 4 в таблице 1

Данные ¹H-ЯМР (ДМСО d₆) : 1,16 (7Н, м), 1,82 (1Н, м), 1,98 (2Н, м), 2,01 (3Н, с), 3,4-3,9 (6Н, м), 3,22 (1Н, м), 3,42 (2Н, м), 3,80 (2Н, м), 4,20 (1Н, м), 4,47 (1Н, кв), 4,90 (1Н, м), 6,62 (2Н,м), 6,93-7,10 (3Н, м), 7,19 (2Н, м), 7,57 (2Н, т), 7,70 (1Н, т), 7,89 (2Н, д), 8,60 (1Н, д).

MC (ES+) (с электрораспылением) m/z 652 (М+Н) ⁺.

Соединение (xv) на схеме 1, где R представляет 3-пиридил

Данные ¹H-ЯМР (CDCl₃) : 1,27 (6Н, м), 1,49 (9Н, с), 1,50 (1Н, м), 1,92 (1Н, м), 2,04 (1Н, м), 2,10 (3Н, с), 2,23 (1Н, м), 2,56 (2Н, м), 2,70 (1Н, м), 2,83 (2Н, м), 2,92 (2Н, м), 3,28 (2Н, м), 3,45 (1Н, м), 4,14 (1Н, м), 4,25 (1Н, м), 4,80 (2Н, м), 5,08 (1Н, м), 6,40 (1H, д), 6,65 (2Н, м), 6,93 (3Н, м), 7,10 (2Н, м), 7,42 (1Н, м), 8,18 (1Н, м), 8,80 (1Н, м), 9,13 (1Н, м).

MC (ES+) (с электрораспылением) m/z 753,71 (M+H)⁺.

Соединение 8 в таблице 1

Данные ¹H-ЯМР (ДМСО d₆) : 1,15 (6Н, м), 1,20 (1Н, м), 1,86 (1H, м), 1,97 (2Н, м), 2,02 (3Н, с), 2,40-2,92 (5Н, м), 3,29 (1Н, м), 3,37-3,60 (2Н, м), 3,68-3,94 (2Н, м), 4,28 (1H, м), 4,48 (1H, м), 4,89 (1H, м), 6,67 (2Н, м), 7,00 (4Н, м), 7,19 (2Н, т), 7,68 (1H, м), 8,33 (1H, м), 8,61 (1H, д), 8,88 (1Н, м), 9,06 (1Н, м).

MC (ES+) (с электрораспылением) m/z 653,56 (М+Н)⁺.

Пример 3

Получение соединения 7 таблицы 1

Соединение 7 таблицы 1 синтезируют из соединения (xxviii) на схеме 2, используя способ, аналогичный способу, описанному в примере 1, для превращения соединения (xv) на схеме 1 в соединение 6.

Соединение 7 таблицы 1

Данные ¹H-ЯМР (ДМСО d₆+CD ₃COOD) : 1,1-1,25 (6Н, м), 1,8-2,05 (1Н, м), 2,05-2,35 (2Н, м), 2,6-3,05 (5Н, м), 2,95 (3Н, с), 3,05-3,4 (3Н, м), 3,82 (1Н, дд), 4,0-4,2 (1Н, м), 4,2-4,4 (3Н, м), 4,4-4,6 (1Н, м), 4,85-5,0 (1Н, м), 6,9-7,1 (4Н, м), 7,1-7,3 (3Н, м), 7,65 (1Н, дд), 8,3 (1Н, дд), 8,87 (1Н, дд), 9,07 (1Н, д).

MC (ES+) (с электрораспылением) m/z 686,5 (М+Н)⁺.

Анализ

Рассчитано для C₃₄H₄₀N₃S₂O₇ F·2HCl·2H₂O:

С 51,4; Н 5,8; N 5,3; С 8,0; Cl 8,9;

найдено: С 51,2; Н 5,39; N 5,2; S 7,84; Cl 9,2.

Исходное вещество, соединение (xxviii), синтезируют из соединения (xxv) на схеме 2 способом, аналогичным способу, описанному в примере 1 для получения соединения (xv) на схеме 1, используя соответствующие промежуточные соединения. Соединение (xxv) получают, используя способ, описанный в примере 12 заявки PCT/GB99/00369 и представленный в общем виде на схеме 2.

Соединение (xxvi) на схеме 2

Данные ¹H-ЯМР (CDCl ₃) : 1,2-1,35 (6Н, м), 1,35 (9Н, с), 1,8-2,05 (1Н, м), 2,15-2,4 (1Н, м), 2,45-3,3 (10Н, м), 2,85 (3Н, с), 3,7-4,3 (4Н, м), 4,7-4,85 (1Н, м), 5,0-5,2 (1H, м), 6,5 (1Н, д), 6,8-7,0 (4Н, м), 7,0-7,15 (3Н, м), 7,15-7,4 (9Н, м), 7,4-7,6 (6Н, м).

МС (ЕС+) (с электрораспылением) m/z 945,1 (M+Na)⁺.

Соединение (xxvii) на схеме 2

Данные ¹H-ЯМР (CDCl₃ ) : 1,2-1,35 (6Н, м), 1,45 (9Н, м), 1,75 (1Н, д), 1,9-2,1 (1Н, м), 2,2-2,4 (1Н, м), 2,45-2,7 (2Н, м), 2,8-3,4 (8Н, м), 2,85 (3Н, с), 3,8-4,4 (4Н, м), 4,7-4,85 (1Н, м), 5,0-5,2 (1Н, м), 6,55 (1Н, д), 6,8-7,2 (7Н, м).

МС(ЕС+) (с электрораспылением) m/z 681,2 (М+Н)⁺.

МС(ЕС-) (с электрораспылением) m/z 679,2 (М-Н)^-.

Соединение (xxviii) на схеме 2

Данные ¹H-ЯМР (CDCl₃) : 1,2-1,35 (6Н, м), 1,45 (9Н, с), 2,1-2,4 (2Н, м), 2,45-2,65 (1Н, м), 2,65-2,8 (1Н, м), 2,8-3,45 (8Н, м), 2,85 (3Н, с), 4,0-4,4 (4Н, м), 4,7-4,85 (1Н, м), 5,0-5,2 (1Н, м), 6,55 (1H, д), 6,8-7,2 (7Н, м), 7,42 (1H, дд), 8,18 (1Н, д), 8,8 (1H, д), 9,15 (1Н, с).

MC (EC+) (с электрораспылением) m/z 786,7 (М+Н) ⁺.

МС (ЕС-) (с электрораспылением) m/z 784,6 (М-Н) ^-.

Пример 4

Получение соединения 9 таблицы 1

Соединение 9 таблицы 1 синтезируют из соединения (xxxxi), используя способ, аналогичный способу, описанному в примере 1 для превращения соединения (xv) на схеме 1 в соединение 6 в таблице 1.

Соединение 9 таблицы 1

Данные ¹H-ЯМР (ДМСО d₆) : 1,13-1,22 (6Н, м), 1,92-2,06 (6Н, м), 2,39-2,46 (1Н, м), 2,54-2,62 (2Н, м), 2,66-2,83 (3Н, м), 2,92-3,00 (2Н, м), 3,31 (1Н, м), 3,81 (1Н, м), 4,30 4,39 (1Н, м), 4,47-4,57 (1H, м), 4,90 (1Н, м), 6,37 (1H, дд), 6,81 (1Н, д), 7,04 (2Н, т), 7,15-7,25 (3Н, м), 7,39-7,46 (2Н, м), 7,61 (1H, дд), 8,27 (1H, м), 8,79 (1H, д), 8,87 (1H, дд), 9,05 (1H, д).

МС (ЕС+) (с электрораспылением) m/z 650,1 (М+Н)⁺.

Исходное вещество (соединение xxxx) на схеме 3) синтезируют из соединения (xxxv), как показано на схеме 3, используя нижеследующую процедуру. Само соединение xxxv получают, как описано в примере 21 заявки PCT/GB98/00230, и суммировано на схеме 3.

Соединение (xxxv) на схеме 3 (20 г) растворяют в триэтилфосфите (100 мл) и нагревают при 160°С в атмосфере азота в течение 18 часов. Раствор выпаривают досуха и остаток растворяют в дихлорметане и наносят непосредственно на флэш-колонку с диоксидом кремния и элюируют смесью этилацетат/изогексан (50:50, 100:0), получая соединение (xxxvi) в виде бесцветного кристаллического твердого вещества (19,4 г).

Соединение (xxxvi) на схеме 3

Данные ¹H-ЯМР (ДМСО d ₆) : 1,15 (6Н, т), 2,79 (2Н, т), 3,10 (2Н, т), 3,24 (2Н, д), 3,81 (3Н, с), 3,88-3,98 (4Н, м), 7,02-7,10 (2Н, м), 7,16-7,27 (3Н, м), 7,35-7,40 (1Н, м), 7,72 (1Н, с).

МС (ЕС+) (с электрораспылением) m/z 409,3 (М+Н)⁺.

Соединение (xxxvi) на схеме 3 (17,5 г) растворяют в тетрагидрофуране (500 мл) и охлаждают до -50°С в атмосфере азота. Медленно при -40°С добавляют н-бутиллитий (1,6 М) (26,9 мл), а затем соединение (х) (18,5 г) в виде раствора в тетрагидрофуране (100 мл). Затем смеси дают возможность нагреться до 0°С. Затем добавляют водный насыщенный раствор хлорида аммония (300 мл) и органический слой отделяют и сушат над сульфатом магния. Раствор выпаривают досуха и остаток растворяют в дихлорметане и очищают флэш-хроматографией на колонке, элюируя смесью этилацетат/изогексан (20:80, 30:70), получая соединение (xxxvii) на схеме 3 в виде бесцветной твердой пены. (10,4 г).

Соединение (xxxvii) на схеме 3

Данные ¹ H-ЯМР (ДМСО d₆) : 1,16-1,30 (10Н, м), 1,52-1,65 (1Н, м), 2,68-2,80 (5Н, м), 3,04-3,14 (2Н, м), 3,80 (3Н, с), 4,04 (1Н, м), 6,12 (1Н, дд), 6,34 (1Н, д), 7,06 (2Н, т), 7,15-7,40 (18Н, м), 7,48 (1Н, дд), 7,74 (1H, д).

МС (ЕС+) (с электрораспылением) m/z 728,8 (М+Н) ⁺.

Соединение (xxxvii) на схеме 3 превращают в соединение (xxxxi) на схеме 3, используя способ, аналогичный способу, описанному в примере 1 для получения соединения (xv) на схеме 1, используя соответствующие промежуточные соединения.

Соединение (xxxviii) на схеме 3

Данные ¹H-ЯМР (ДМСО d₆ ) : 1,14-1,35 (10Н, м), 1,53-1,66 (1H, м), 2,68-2,81 (5Н, м), 3,10 (2Н, т), 4,04 (1H, м), 6,10 (1H, дд), 6,34 (1H, д), 7,05 (2Н, т), 7,14-7,39 (18Н, м), 7,43 (1Н, д), 7,76 (1H, с), 12,90 (1H, уш. с).

МС (ЕС-) (с электрораспылением) m/z 712,6 (М-Н) ^-.

Соединение (хххх) на схеме 3

МС (ЕС+) (с электрораспылением) m/z 645,6 (M+H)⁺.

Соединение (xxxxi)

МС (ЕС+) (с электрораспылением) m/z 750,6 (М+Н) ⁺.

Пример 5

Фармацевтические композиции

Ниже приводятся типичные фармацевтические дозированные формы изобретения, определенные здесь (при этом активный компонент обозначен термином «соединение X»), для терапевтического или профилактического применения для людей:

a) Таблетка I	мг/таблетка
Соединение Х	100
Лактоза Ph.Eur	182,75
Натрийкроскармелоза	12,0
Паста рисового крахмала
(5 мас.%/об. пасты)	2,25
Стеарат магния	3,0
b) Таблетка II	мг/таблетка
Соединение Х	50
Лактоза Ph.Eur	223,75
Натрийкроскармелоза	6,0
Рисовый крахмал	15,0
Поливинилпирролидон
(5 мас.%/об. пасты)	2,25
Стеарат магния	3,0
c) Таблетка III	мг/таблетка
Соединение Х	1,0
Лактоза Ph.Eur	93,25
Натрийкроскармелоза	4,0
Паста рисового крахмала
(5 мас.%/об. пасты)	0,75
Стеарат магния	1,0
d) Капсула	мг/капсула
Соединение Х	10
Лактоза Ph.Eur	488,5
Магний	1,5
e) Инъекция I	50 мг/мл
Соединение Х	5,0 мас.%/об.
1М раствор гидроксида натрия	15,0 об%/об.
0,1 М хлористоводородная
кислота (для доведения рН
до 7, 6)
Полиэтиленгликоль 400	4,5 мас.%/об.
Вода для инъекции до 100%
f) Инекция II	10 мг/мл
Соединение X	1,0 мас.%/об.
Фосфат натрия ВР	3,6 мас.%/об.
0,1 М раствора гидроксида
натрия	15,0 об%/об.
Вода для инъекции до 100%
g) Инекция III	1 мг/мл, забуференный
	до рН 6
Соединение Х	0,1 мас.%/об.
Фосфат натрия ВР	2,26 мас.%/об.
Лимонная кислота	0,38 мас.%/об.
Полиэтиленгликоль	400 3,5 мас.%/об.
Вода для инъекции до 100%
h) Аэрозоль I	мг/мл
Соединение Х	10,0
Триолеат сорбита	13,5
Трихлорфторметан	910,0
Дихлордифторметан	490,0
i) Аэрозоль II	мг/мл
Соединение Х	0,2
Триолеат сорбита	0,27
Трихлорфторметан	70,0
Дихлордифторметан	280,0
Дихлортетрафторэтан	1094,0
j) Аэрозоль III	мг/мл
Соединение X	2,5
Триолеат сорбита	3,38
Трихлорфторметан	67,5
Дихлордифторметан	1086,0
Дихлортетрафторэтан	191,6
k) Аэрозоль IV	мг/мл
Соединение Х	2,5
Лецитин сои	2,7
Трихлорфторметан	67,5
Дихлордифторметан	1086,0
Дихлортетрафторэтан	191,6
l) Мазь	мл
Соединение Х	40 мг
Этанол	300 мкл
Вода	300 мкл
1-Додецилазациклогептан-2-он	50 мкл
Пропиленгликоль	до 1 мл

Примечание

Вышеупомянутые композиции можно получить обычными способами, известными в фармацевтической области. Таблетки (а)-(с) могут быть покрыты энтеросолюбильной оболочкой обычными способами, например, с получением покрытия из ацетатфталатцеллюлозы. Аэрозольные композиции (h)-(k) можно использовать в сочетании со стандартными дозирующими аэрозольными диспергаторами, а суспендирующие средства, триолеат сорбита и соевый лецитин, могут быть заменены альтернативным суспендирующим средством, таким как моноолеат сорбита, сесквиолеат сорбита, полисорбат 89, полиглицеринолеат или олеиновая кислота.

Пример 6

Получение соединения №1 таблицы 1

(2S)-2-({2-(4-Фторфенэтил)-5-[({(2S,4S)-4-(меркапто)тетрагидро-1Н-пиррол-2-ил}метил)амино]бензоил}амино)-4-(метилсульфанил)бутановая кислота

(1) Получение промежуточного соединения 1

Гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (8,0 г) добавляют к перемешиваемой смеси 4-(диметиламино)пиридина(17,04 г), гидрохлорида трет-бутилового эфира L-метионина (6,87 г) и промежуточного соединения (xii) (20 г) [известное соединение и его получают, как описано в заявке PCT/GB99/00369] в дихлорметане (230 мл). Реакционную смесь затем перемешивают в течение 24 часов при температуре окружающей среды в атмосфере азота. Реакционную смесь выпаривают в вакууме до примерно 100 мл и разбавляют изогексаном (100 мл). Этот раствор затем наносят на флэш-колонку с диоксидом кремния, элюируют смесью этилацетат/изогексан 20:80, 30:70. Фракции продукта объединяют и выпаривают в вакууме, получая промежуточное соединение 1 в виде бесцветной хрустящей пены (20 г).

Данные ¹H-ЯМР (ДМСО d₆) : 1,31 (9Н, с), 1,40 (9Н, с), 1,64-1,8 (1Н, м), 1,9-2,02 (2Н, м), 2,02 (ЗН, с), 2,3-2,6 (5Н, м), 2,6-2,87 (5Н, м), 2,9-3,04 (1Н, м), 3,22-3,4 (1Н, м), 3,63-3,8 (1Н, м), 4,32-4,46 (1H, м), 5,65-5,8 (1Н, м), 6,5-6,62 (2Н, м), 6,84-6,95 (1H, д), 6,98-7,09 (2Н, т), 7,15-7,4 (17Н, м), 8,4-8,52 (1H, шир.д).

(2) Получение соединения №1

Промежуточное соединение 1 (1 г) растворяют в дихлорметане (5 мл) и раствор по каплям добавляют к раствору триэтилсилана (3,5 мл) и 1,3-диметоксибензола (2,9 мл) в ТФУ (100 мл). Реакционную смесь затем перемешивают при температуре окружающей среды в течение 4 часов в атмосфере азота. Растворитель удаляют в вакууме и полученное бесцветное масло растворяют в этилацетате (20 мл), добавляют 1,0 М раствор HCl в простом эфире (20 мл) с образованием осадка. Твердое вещество выделяют центрифугированием, затем промывают эфиром и повторно центрифугируют (всего 4 раза). После декантации эфира продукт сушат с получением 0,45 г гидрохлорида М343921 в виде белого твердого вещества, которое дополнительно очищают препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке 10 Kromasil C8 с обращенной фазой (50 мм × 250 мм, элюирование смесью 40% СН₃CN/Н₂O/1,0% ТФУ). Продукт выделяют лиофилизацией с получением соединения, указанного в названии, в виде трифторацетатной соли.

Данные ¹ H-ЯМР (ДМСО d₆) : 1,54-1,7 (1Н, м), 1,93-2,1 (2Н, м), 2,0 (3Н, с), 2,49-2,6 (3Н, м), 2,65-2,86 (4Н, м), 2,9-3,1 (1Н, 2д), 3,18-3,6 (4Н, м), 3,63-3,8 (1Н, м), 4,42-4,54 (1Н, м), 6,6 (1Н, д), 6,62 (1Н, с), 6,92-7,08 (3Н, м), 7,13-7,25 (2Н, м), 8,48 (1Н, д), 8,88 (1Н, шир.с), 9,25 (1Н, шир.с).

МС (ES+) (с электрораспылением) m/z 506,3 (M+H)⁺.

Получение соединения №2 таблицы 1

Изопропил-(2S)-2-({2-(4-фторфенэтил)-5-[({(2S,4S)-4-(меркапто) тетрагидро-1Н-пиррол-2-ил}метил)амино]бензоил}амино)-4-(метилсульфанил)бутаноат

Промежуточное соединение (xiii) (5г) [полученное, как описано в примере 1, с. 41) растворяют в дихлорметане (20 мл) и раствор по каплям добавляют к раствору триэтилсилана (17,95 мл) в ТФУ (500 мл). Реакционную смесь затем перемешивают при температуре окружающей среды в течение 4 часов в атмосфере азота. Растворитель удаляют в вакууме и полученное бесцветное масло растворяют в этилацетате (50 мл) и добавляют 1,0 М раствор HCl в простом эфире (50 мл) для осаждения продукта в виде HCl соли. Твердое вещество выделяют центрифугированием, затем промывают простым эфиром и повторно центрифугируют (всего 4 раза). После декантации эфира продукт сушат в вакууме с получением 3,04 г белого твердого вещества.

Данные ¹H-ЯМР (ДМСО d₆ + CD₃COOD) : 1,12-1,2 (6Н, 2д), 1,55-1,7 (1Н, м), 1,94-2,03 (2Н, м), 2,01 (3Н, с), 2,5-2,6 (3Н, м), 2,68-2,87 (4Н, м), 3,0-3,09 (1Н, м), 3,21-3,6 (4Н, м), 3,63-3,8 (1Н, м), 4,48 (1Н, т), 4,84-4,95 (1Н, м), 6,57-6,63 (2Н, м), 6,94-7,05 (3Н, м), 7,11-7,22 (2Н, м).

МС (ES+) (с электрораспылением) m/z 548,2 (М+Н)⁺ .

Протокол анализа клеток Hras5

В следующем протоколе использовали следующие сокращения:

DMEM = модифицированная Дульбекко среда Игла

FCS = фетальная телячья сыворотка

HBSS = буферный солевой раствор Hepes

Этап 1. Высевание клеток с требуемой плотностью в 12-луночные планшеты

Среды, используемые для высевания: DMEM + 5% лишенная примесей FCS и глутамин 2 мМ.

Удаляют среды из колбы (162 см² ) с почти слившимися клетками Hras5. Добавляют 2 мл IX трипсина/HBSS и инкубируют колбу при 37°С в течение 5 мин до тех пор, пока вытряхивание колбы не вызывает высвобождение клеток. Нейтрализуют трипсин добавлением 3 мл DMEM + 10% FSC + глутамина. Переносят все 5 мл в стерильный универсальный шприц и слегка 2 или 3 раза набирают и выталкивают из шприца, используя иглу 18G для разрушения агрегатов клеток.

Удаляют 0,2 мл суспензии в сосуд Coulter, содержащий 15 мл изотонического раствора, и производят подсчет образца объемом 0,5 мл на счетчике Coulter (счетчик, настроенный для выявления частиц 8 мкМ и более).

Расчет:

Добавляют рассчитанный объем маточной клеточной суспензии до требуемого объема DMEM + 5% лишенной примеси сыворотки + глутамина. Осторожно смешивают разбавленную суспензию и высевают 1 мл - аликвоты в 12-луночные планшеты (Costar).

Инкубируют планшеты при 37°С/10% CO₂ в течение ночи.

Величины плотности засева для клеток Hras5 = 20000 клеток/лунку.

Этап 2. Вводимые соединения.

Получают суспензии в 30 мМ маточной суспензии в DMSO.

Готовят раствор GSH (восстановленного глутатиона): 0,307 г в 10 мл деионизированной воды = 100 мМ. Проводят стерилизацию фильтрацией через шприцевый фильтр маленького объема 0,2 мкМ.

В 96-луночной планшете проводят разведения каждого соединения:

1:10=10 мкл соединения + 90 мкл GSH

1:3=20 мкл соединения +40 мкл GSH

Получают следующие разведения (30 мМ маточного раствора):

1:10=3 мМ

1:3=1 мМ = 10 мкМ конечного

1:10=300 мкМ 3 мкМ

1:10=100 мкМ 1 мкМ

1:10=30 мкМ 0,3 мкМ

1:10=10 мкМ 0,1 мкМ

1:10=3 мкМ 0,03 мкМ

План планшеты

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 соединение 1 2 3 4 и т.д.

2 разведения с уменьшающейся концентрацией вниз по планшете

3

4

5

6

7

8

Добавляют 10 мкл соответствующего разбавителя до объема 1 мл в 12-луночную планшету = разведение 1:100 и смешивают осторожным перемешиванием для обеспечения дисперсии DMSO.

Лунки контроля: дозы с 10 мкл раствора GSH.

План 12-луночной планшеты:

Заменяют планшеты в инкубаторе на 6-й день.

Степень реверсии трансформированного фенотипа анализируют на 6-й день.

Этап 3. Анализ клеток

Оценивают эффекты сниженного роста с использованием микроскопа.

По каплям удаляют среды из планшета и добавляют 1 мл нестерильного концентрированного раствора трипсина /HBSS (20 мл 10 × трипсин + 80 мл HBSS. Конечная концентрация трипсина = 2х) в каждую лунку и оставляют на 20 мин для обеспечения возможности клеткам отсоединиться и разделиться на отдельные клетки.

Несколько раз набирают и выталкивают содержимое лунки из пипетки емкостью 5 мл, а затем переносят весь 1 мл каждого образца в сосуд Coulter, содержащий 15 мл изотонического раствора. Производят подсчет образца объемом 0,5 мл на счетчике Coulter (счетчик, настроенный для выявления частиц 8 мкМ и более).

Весь 1 мл в 15 мл изотонического раствора = разведение 1:15 (приблизительно).

Производят подсчет 0,5 мл разведении ×2 ×15.

Например, подсчитано 12000 в 0,5 мл разведения × 30 = общее количество клеток в 1 мл образце лунки = 360000 клеток.

Рассчитывают ингибирование роста при каждой концентрации в виде процентной доли от контролей (контроли = 100%) и, при необходимости, строят кривые зависимости реакции от дозы.

IC₅₀ пролиферации определяется как концентрация соединения, дающая 50% общего контрольного числа клеток (мкМ).

Результаты испытаний представлены в таблицах А и В.

Сравнение соединений настоящего изобретения и соединений WO 97/06138 (D1)

Таблица А
Ссылка	Пример/ соединение №	Структура	Клеточная IC50 (мкМ) (клетки Hras5)
Настоящая заявка	Соединение 1, табл. 1		0,3
D1	33f (схема 38, с.155)		10
D1	34h (схема 39, с.157)		30
Таблица B
Ссылка	Пример/ соединение №	Структура	Клеточная IC50 (мкМ) (клетки Hras5)
Настоящая заявка	Соединение 2, табл. 1		0,01-0,03
Ссылка	Пример/ соединение №	Структура	Клеточная IC 50 (мкМ) (клетки Hras5)
Настоящая заявка	Соединение 3, табл. 1		0,03-0,1
Настоящая заявка	Соединение 4, табл. 1		0,03-0,1
Настоящая заявка	Соединение 5, табл. 1		0,03-0,1
Настоящая заявка	Соединение 6, табл. 1		0,03
Настоящая заявка	Соединение 7, табл. 1		0,01-0,03
Настоящая заявка	Соединение 8, табл. 1		0,03-0,1

Ссылка	Пример/ соединение №	Структура	Клеточная IC50 (мкМ) (клетки HrasS)
(Соединение, входящее в объем уточненного пункта 1 настоящей заявки)			0,01-0,03
(Соединение, входящее в объем уточненного пункта 1 настоящей заявки)			0,03
(Соединение, входящее в объем уточненного пункта 1 настоящей заявки)			0,03-0,1
D1	33 (схема 38, с. 155)		10
D1	34 (схема 39, с. 157)		0,3
D1	36(схема 41, с. 161)		1