способ профилактики и коррекции изменений кожи

Формула изобретения

Способ профилактики и коррекции изменений кожи, и/или ее придатков, и/или подкожной клетчатки путем введения в кожу и/или подкожную клетчатку липосом, содержащих ферменты, обладающие ДНКазной активностью, отличающийся тем, что используют многослойные MLV-липосомы размером от 500 до 2000 нм с температурой фазового перехода мембраны липосом от 30 до 65°С, при этом осуществляют доставку и депонирование фермента в межклеточное пространство, а в качестве ферментов с ДНКазной активностью используют эндо- и/или экзонуклеазы, разрушающие однонитевую и/или двунитевую ДНК.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а также к косметологии, кроме того, оно может быть использовано и в ветеринарии.

Как известно, наиболее частыми нежелательными процессами, развивающимися в коже и подкожно-жировой клетчатке, являются инфекционные заболевания кожи и ее придатков. К таким процессам относятся, например, пиодермия, акне, грибковые поражения кожи, волос, ногтей и др., дистрофические состояния кожи (истончение, потеря эластичности, тургора и образование морщин с возрастом) и подкожной клетчатки (так называемый "целлюлит"). При всех этих патологиях, а также и в связи со старением основные звенья нежелательного процесса протекают не в самих клетках кожи и подкожно-жировой клетчатке, а в основном в межклеточном пространстве (межклеточном матриксе).

Известен способ коррекции изменений кожи путем накожной аппликации от 0,01 до 1 мл водного раствора дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) на 1 см² кожи, когда раствор ДНКазы имеет концентрацию от 1 до 70 ед. Кунца на 1 мл (US 6524578).

Недостатки данного способа:

- способ требует полного высыхания раствора ДНКазы на коже в течение длительного времени (более получаса), что приводит к образованию слоя сухой ДНКазы на поверхности кожи, или требует нанесения сухого порошка ДНКазы, который образует концентрированный раствор с обычно имеющимися на поверхности кожи микроколичествами воды, или требует большого расхода водных растворов ДНКазы (от 250 до 500 мл) в приведенных примерах; указанные обстоятельства обусловливают нерационально большой расход ДНКазы;

- требуется последующее удаление ДНКазы с поверхности кожи, что создает определенные неудобства;

- основная часть фермента остается на поверхности кожи и оказывает негативное повреждающее воздействие, разрыхляя кератиновые пластины, что приводит к низкой резистентности кожи к любым внешним воздействиям;

- в зону живых клеток проникает лишь небольшая часть ДНКазы, что приводит к малой эффективности способа;

- способ предполагает использование ДНКаз в водных растворах, где ДНКазы нестабильны, что требует, как правило, специальных условий хранения таких растворов или приготовления растворов непосредственно перед нанесением на кожу.

Также известен способ профилактики и коррекции изменений кожи путем введения в кожу ферментов, участвующих в репарации ДНК и включенных в рН-чувствительные липосомы (US 5296231). Способ предполагает коррекцию повреждений (двунитевых разрывов) ДНК соматических клеток, вызванных ультрафиолетовым излучением, что увеличивает выживаемость клеток после такого воздействия; способ включает нанесение ферментов, участвующих в репарации ДНК, на кожу с целью внедрения фермента в живые клетки кожи. Среди ферментов, которые предлагаются для этой цели (репарации повреждений ДНК, вызванных УФ-излучением и другими воздействиями, приводящими к изменению нуклеотидов или разрыву нуклеотидной цепи), указываются ферменты, способные участвовать в репарации поврежденных нуклеиновых кислот, в частности, ДНК. К этим ферментам относятся О⁶-метилгуанин-ДНК метилтрансферазы, фотолиазы, урацил - и гипоксантин - ДНК гликозилазы, апиримидиновые/апуриновые эндонуклеазы, ДНК-экзонуклеазы, damaged-bases гликозилазы коррендонуклеазы и их комплексы, а также другие ферменты и ферментные комплексы, активность которых в настоящее время только частично изучена, такие, как продукты ERCC-генов человека, и RAD-генов дрожжей.

Способ включает доставку внутрь клетки кожи одного из таких ферментов (эндонуклеазы V бактериофага Т4). Для реализации известного способа специально сконструированы рН-чувствительные липосомы путем подбора специальной смеси липидов. То есть при кислых значениях рН липиды мембраны липосом протонируются, и мембрана липидов дестабилизируется, что приводит к высвобождению содержимого. Такие кислые условия среды возникают, когда эндоцитированная в клетку липосома взаимодействует с лизосомами цитоплазмы клетки, где липосома высвобождает свое содержимое. Эти липосомы используются для доставки целевого фермента (энзима, восстанавливающего ДНК) внутрь клетки. Как отмечается в описании патента: "главным ограничением является то, что липосомы не должны быть токсичны для живых клеток, и то, что они должны доставлять свое содержимое во внутреннее пространство клеток, подвергающихся лечебному воздействию" (12 колонка, 50 и 55 строчки). Для достижения этого используются рН-чувствительные малые однослойные липосомы (SUV) размером менее 250 нм в диаметре.

Данный способ принят за прототип настоящего изобретения.

К недостаткам данного способа относятся:

- узкая область применения: способ позволяет предотвращать повреждения или восстанавливать поврежденную внутриклеточную ДНК; на ДНК в межклеточном пространстве воздействия не оказывается, так как липосомы, на использовании которых базируется способ-прототип, захватываются эндоцитозом живыми клетками или сливаются с ними;

- согласно способу-прототипу ферменты доставляют внутрь живой клетки, что может привести к повреждению внутриклеточной ДНК клеток кожи и подкожной клетчатки;

- в основу способа-прототипа положено использование липосом, которые недостаточно ригидны при высоких температурах, что приводит к разрушению липосом и/или вытеканию из липосом фермента.

В основу настоящего изобретения положено решение следующих задач:

- обеспечение предупреждения и коррекции изменений кожи и подкожной жировой клетчатки, связанных с высоким уровнем внеклеточной ДНК в межклеточном пространстве;

- предотвращение повреждения внутриклеточной ДНК живых клеток кожи.

Согласно изобретению в способе профилактики и коррекции изменений кожи, и/или ее придатков, и/или подкожной клетчатки, включающем введение в кожу и/или подкожную клетчатку липосом, содержащих ферменты, обладающие ДНКазной активностью, используют многослойные MLV-липосомы размером от 500 до 2000 нм с температурой фазового перехода мембраны липосом от 30 до 65°С, при этом осуществляют доставку и депонирование фермента в межклеточном пространстве.

Заявителем было установлено, что введение и депонирование в межклеточном пространстве ферментов, разрушающих ДНК, приводит как к предотвращению нежелательных, в том числе и инфекционных, процессов, так и к их обратному развитию. В процессе работы над изобретением выяснилось, что такое введение указанных ферментов неожиданно приводило к предотвращению и/или частичной редукции изменений кожи, закономерно наступающих в процессе старения кожи, ее придатков и подкожной жировой клетчатки. Изучение возможных механизмов данного эффекта показало, что мишенью для нуклеаз, целенаправленно вводимых в межклеточное пространство с созданием депо, является межклеточная ДНК, включая ДНК мертвых кератиноцитов, ДНК, продуцируемая инфекционным агентом, а также ДНК самих патогенов - бактерий и грибов. При этом не происходит повреждения ДНК живых клеток кожи и подкожной жировой клетчатки.

В предложенном заявителем способе липосомы не проникают в живые клетки путем эндоцитоза или пиноцитоза, устойчивы к слиянию с живыми клетками и их содержимое не проникникает в живую клетку и не повреждает ДНК этой клетки; используемые липосомы длительное время обеспечивают ферментативную активность в межклеточном матриксе в широком диапазоне температуры и рН, поскольку при развитии нежелательных (в частности, инфекционных процессов) в коже и подкожной клетчатке наблюдается значительное колебание этих параметров.

MLV-липосомы, размером от 500 до 2000 нм с температурой фазового перехода мембраны липосом от 30 до 65°С, обеспечивают высокую эффективность включения нуклеаз, поскольку соотношение объема водная фаза/липиды достаточно высоко, нуклеазы, как правило, липофобны, а многослойная структура таких липосом не позволяет нуклеазам быстро вытекать из липосомы.

При использовании для конструкции липосом смеси липидов с результирующей температурой фазового перехода их мембран меньше чем 30°С часть липосом сливается с клеткой, ее содержимое переходит в живые соматические клетки. Это приводит к повреждению ядерной и неядерной ДНК клеток нуклеазами.

Использование липосом с температурой фазового перехода липидной мембраны выше 65°С приводит к значительному снижению ферментативной активности включенных в липосомы ферментов, а также частичной потере ферментативной активности, вызванной тепловой денатурацией ферментов при приготовлении таких липосом.

В качестве фермента (ферментов) с ДНКазной активностью предпочтительно использовать неспецифические нуклеазы, разрушающие любую (однонитевую и/или двунитевую) ДНК вне зависимости от ее происхождения (типа клетки) или специфических свойств самой ДНК. Наиболее подходящими являются неспецифические эндо- и/или экзонуклеазы. Использование специфических нуклеаз приводит к недостаточной эффективности способа или ограничению спектра коррегируемых нежелательных процессов кожи и подкожной клетчатки. В качестве таких эндо- и/или экзонуклеаз, неспецифически расщепляющих ДНК, могут быть использованы, например, бычья панкреатическая ДНКаза (как полученная из животного сырья, так и рекомбинантная), человеческая ДНКаза I (как полученная из жидкостей человеческого организма, так и рекомбинантная), мутантные ДНКазы, обладающие повышенной ферментативной активностью, а также ДНКазы микробного происхождения.

Реализация настоящего изобретения осуществляется следующим образом.

Многослойные липосомы являются микрошариками (multilamellar vesicals (MLV)), стенка которых состоит из многих повторяющихся рядов бислоев липидов, в отличие от моноламеллярных (однослойных) липосом, где стенка микровезикулов представлена одним слоем.

Моноламеллярные (однослойные) липосомы обычно имеют сферическую форму и минимальное соотношение «площадь поверхности/объем», в то время как многослойные липосомы представляют собой вытянутые цилиндры и/или сфероиды.

MLV-липосомы изготовляются методом гидратации сухой пленки липидов. При этом образуются липосомы, широко варьирующиеся по размеру, диаметром приблизительно 0,1-0,5 мкм. Для получения фракций липосом с более однородным размером липосомы разделяют различными методами, например центрифугированием в градиенте фиколла или гель-фильтрацией. Подбирая условия фракционирования, можно выделить ту или иную фракцию многослойных (мультиламеллярных) липосом с более однородными размерами. Например, были выделены так называемые «большие» мультиламеллярные липосомы (с диаметром приблизительно 1,0-0,3 мкм) и «малые» мультиламеллярные липосомы (с диаметром приблизительно 0,3-0,2 мкм).

Свойства липосом как переносчиков биологически активных веществ зависят от многих параметов, основными из которых являются свойства липидов, образующих липосомы, размер липосомы и структура ее стенки (моноламеллярные или мультиламеллярные). К важнейшим свойствам липидов, образующих липосомы, относятся температура фазового перехода и заряд липидов.

Температура фазового перехода определяет текучесть липидов, образующих липосому, жесткость липосомы, ее способность взаимодействовать с биологическими мембранами как in vitro, так и in vivo, стабильность липосомы в определенном интервале температур, эффективность включения биологически активных веществ в липосомы.

Липидная составляющая биологических мембран, в том числе и искусственных (липосом, в том числе), при определенных температурах может испытывать так называемый фазовый переход первого рода. При понижении температуры происходит переход липидов из жидкокристаллического состояния в состояние геля, называемое еще иногда твердокристаллическим. Это происходит при понижении температуры ниже критической (Ткрит - температуры фазового перехода «гель - жидкий кристалл»). Эта температура индивидуальна для каждой мембраны и зависит от химического состава липидов, образующих мембрану. Температура фазового перехода может колебаться от -20°С (для мембран из ненасыщенных липидов) до +60°С (для мембран из насыщенных липидов). Например, в бислойных мембранах чистого фосфатидилхолина температура фазового перехода составляет 23 °С. Степень упорядоченности молекул липидов в гель-состоянии резко возрастает. Гидрофобные «хвосты» липидов в гель-фазе параллельны друг другу (находятся в трансконформации). Толщина бислоя в гель-фазе значительно выше, чем в жидкокристаллической фазе. Осуществление всех функций мембран живых клеток возможно только в жидкокристаллической фазе. Липосомы, липиды которых переходят в гель-фазу, становятся совершенно ригидны, мембрана теряет текучесть и становится совершенно не похожа на живую мембрану.

Ферменты являются одними из многих белковых молекул, включаемых в липосомы с целью доставки их внутрь клетки для компенсации ферментной недостаточности или с другими целями. При таком включении преследуются следующие цели: направление фермента (при инфузии в кровяное русло) именно в те ткани, где накапливается субстрат, предотвращение преждевременного взаимодействия фермента с субстратами и другими белками, преодоление гематоэнцефалического барьера, снижение потенциальной антигенности фермента.

Для ферментов, связанных с мембранами, ригидность (текучесть) мембран является критическим моментом в осуществлении ими своих функций.

Для приготовления необходимых для осуществления данного способа MLV-липосом размером от 200 до 500 нм и температурой фазного перехода мембран от 30 до 65°С использовали холестерин, а также фосфолипиды с различной степенью насыщенности гидрофобных хвостов, в том числе с высокой температурой фазового перехода, в частности, такие как дипальмитоилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилсерин, дипальмитоилсфингомиелин, дипальмитоилфосфатидиламин, дистерароилфосфатидилхолин. Холестерин и фосфолипиды смешивали в различных молярных соотношениях. Изменяя молярные соотношения смеси холестерина с липидами с высокой и низкой температурой фазового перехода, получали липосомы с различной степенью фазового перехода липидных мембран. Холестерин и фосфолипиды смешивали в различных молярных соотношениях. Полученную смесь растворяли в хлороформе (10 мл хлороформа на 100 мг фосфолипида). Хлороформ отгоняли на роторном испарителе в круглодонной колбе для получения на стенках липидной пленки при температурах до 65°С. Препараты ДНКаз растворяли в фосфатном буфере. Для ДНКаз, зависимых от присутствия ионов двувалентных металлов, в буфер предварительно вводили от 0,5 до 5 mM на литр двувалентных катионов магния (в виде сульфата). Мультиламеллярные липосомы формировали в фосфатном буфере с растворенным в нем ферментом (около 2 мг фосфолипида на 10 мл буфера) перемешиванием в течение 20 минут. Для того чтобы отмыть препарат липосом от свободного фермента, трижды (в течение 2,5 часов каждый) был проведен диализ против 50-кратного избытка фосфатного буфера. Липосомы разделяли по размеру на фракции методом гель-фильтрации или центрифугированием в градиенте фиккола.

ДНКазную активность фермента, включенного в липосомы, оценивали в пробах препарата полученных липосом после разрушения липосом детергентом (Тритон X100) и удаления липидов. Активность ДНКазы определяли методом Кунца (1950 год) при рН, оптимальной для конкретного фермента.

Примеры реализации изобретения

Пример 1. Бычью панкреатическую ДНКазу (производства МР Biomedicals с удельной активностью не менее 2500 ед. Кунца на 1 мг фермента) вводили в MLV-липосомы размером 500 нм и температурой фазового перехода 30°С.

Эксперименты проводились на крысах линии "Вистар" средним весом 200-250 г. Гнойное воспаление кожи моделировали путем внутрикожного введения взвеси бактерий на площади 1,5 см² на спине в межлопаточной области, где предварительно сбривали шерсть. Вводили взвесь суточной агаровой культуры Staphylococcus aureus штамм 394 в общем количестве 100 КОЕ на 1 животное. Введение осуществляли путем 10 микроинъекций, распределенных равномерно на указанной площади кожи. Через 5 дней формировалось гнойное воспаление кожи. Животных разделяли на 5 групп. Лечение начинали в первый день формирования гнойного воспаления кожи и проводили в течение 10 дней. Оценивали площадь гнойного поражения и микробную обсемененность.

Группе 1 проводили микроинъецирование взвеси MLV-липосом, нагруженных ферментом из расчета 0,2, 2 и 20 ед. Кунца на 1 см² пораженной пиодермией поверхности кожи (3 подгруппы - a, b, c, соответственно).

Группе 2 проводили микроинъецирование взвеси липосом, нагруженных тем же ферментом, полученных, как это указано для прототипа, в таких же количествах ферментативной активности на единицу площади поверхности кожи, как и в 1 группе с такими же подгруппами: 0,2, 2 и 20 ед. Кунца на 1 см² пораженной пиодермией поверхности кожи (3 подгруппы - a, b, c, соответственно).

Группа 3 получала лечение, аналогичное лечению, получаемому первой группой, с той разницей, что ДНКаза не вводилась в раствор при приготовлении липосом, то есть животные получали «пустые» MLV-липосомы, в том же количестве (по липиду) и объему введения взвеси липосом, как и в 1 группе.

Группе 4 животных апплицировали 10% тетрациклиновую мазь в объеме 0,2 мл на 1 см² поверхности пораженного участка (группа позитивного контроля).

Группа 5 животных служила для обеспечения негативного контроля.

Все воздействия проводили 1 раз в день.

Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Таблица 1
Группа	1			2			3			4	5
Подгруппа	А	В	С	А	В	С	А	В	С	-	-
Количество животных	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
	Доза ДНКазы (ед. Кунца на 1 см 2 поверхности пораженной кожи)
	0,2	2	20	0,2	2	20	-	-	-	-	-
Параметр	Микробная обсемененность (КОЕ/г), среднее
1 сутки	7,5	7,8	7,7,	7,4	7,6	7.4	7,4	7,6	7,3	7,8	7,8
4 сутки	6,4	5,0	3,2	7,1	7,5	7,0	7,2	7,4	7,1	6,3	6,9
8 сутки	5,0	3,2	1,5	6,7	6,6	6,5	6,7	6,8	6,9	4,8	6,5
16 сутки	4,1	2,1	0	4,8	5,2	5,0	4,7	5,1	4,9	3,0	5,0
	Площадь гнойного поражения, % от исходного, среднее
1 сутки	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
4 сутки	77	61	55	94	96	93	94	96	93	79	97
8 сутки	58	55	46	83	86	83	83	86	83	50	80
16 сутки	19	10	8	24	25	23	24	25	22	15	27

Из данных, представленных в таблице 1, следует, что ни «пустые» MLV-липосомы, ни способ-прототип не оказывают заметного действия на развитие инфекции, заявленный же способ сравним по эффективности с применением одного из известных антибактериальных средств.

Аналогичные данные получены при сравнении заявленного способа и способа-прототипа на данной модели в профилактических целях. Введение в профилактическом режиме проводили за 2 часа до инокуляции инфекционного агента в кожу. Прототип не оказывал профилактического действия. Реализация изобретения при использовании MLV-липосом, размером 500 нм с температурой фазового перехода 30°С, нагруженных рекомбинантной бычьей ДНКазой (производства Sigma), превосходило по профилактическому эффекту нанесение 10% мази тетрациклина (мазь «Тетрациклиновая» 10%, производства ОАО «Нижфарм»).

Пример 2. В MLV-липосомы размером 1000 нм и температурой фазового перехода мембраны 50°С вводили эндонуклеазу Serratia marcescens, получив ее из культуры бактерий.

Заявленный способ применяли для лечения экспериментальной грибковой инфекции, вызванной Microporum canis, с помощью аппликаций на поверхность пораженной кожи и ее придатков.

Лечение согласно заявляемому способу сравнивали с воздействием в соответствии со способом-прототипом. В качестве позитивного контроля использовали 1% крем тербинафина (препарат «Ламизил», производства фирмы «Новартис»).

Использовали морских свинок обоих полов весом 600-700 г и штамм Microporum canis VT 999, выделенный от больного. Колонии Microporum canis культивировали на среде Micosel (Difco) и на картофельном агаре 2-3 недели при температуре 25°С. Колонии перемещали с поверхности агара в пробирку с физиологическим раствором и растирали в пластиковом гомогенизаторе около 1 мин до получения однородной суспензии. Жизнеспособность клеток оценивали по способности включать флюоресцирующий краситель. Споры подсчитывали в камере Горяева. Нижнюю часть спины морской свинки выбривали и на поверхность скарифицированной кожи наносили 0,4 мл суспензии, содержащей 1 миллион спор Microporum canis на 1 мл. Место инокуляции прикрывали полиэтиленовой пленкой (4 см × 4 см) и фиксировали ее эластическим бинтом на 24 часа. Отек, эритема и шелушение на месте инокуляции гриба развивались у животных на 5-6 сутки. Успешное инфицирование подтверждали микробиологическим методом. В эксперимент включали животных с развившейся инфекцией, подтвержденной микробиологическим методом. Высевы материала с места инокуляции проводили каждые 3 дня после инокуляции.

Животных разделили на 5 групп. Препараты начинали применять на 7 сутки после инокуляции. Животным групп 1, 2, 3 препараты, содержащие ферменты, наносили из расчета 0,1; 1,0 и 10,0 ед. Кунца на 1 см² пораженной поверхности, соответственно.

Группа 1 получала нуклеазу Serratia marcescens согласно заявляемому способу.

Группа 2 получала ДНКазу Serratia marcescens согласно способу-прототипу.

Группа 3 получала аппликации раствора нуклеазы Serratia marcescens в фосфатном буфере.

Группа 4 получала аппликации стерильного фосфатного буферного раствора и служила для контроля.

Группа 5 получала MLV-липосомы такого же состава и размеров, что и для группы 1, но не нагруженные ферментом («пустые» MLV-липосомы).

Группа 6 получала аппликации крема 1% тербинафина (препарат «Ламизил», производства фирмы «Новартис») (0,05 г на см² поверхности) и служила группой позитивного контроля.

Возможное преждевременное высыхание и стекание наносимых на кожу препаратов предотвращалось наложением полиэтиленовой пленки с липкими концами и фиксирующей повязкой. Все препараты применяли 1 раз в сутки. Оценивали срок начала роста волос, срок полного разрешения очагов и срок микробиологического очищения места инокуляции (по высевам материала с места инокуляции). Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2
№ группы (количество животных в группе)		Доза фермента, ед. Кунца на 1 см2	Срок начала роста волос, дни (среднее)	Срок разрешения очага, дни (среднее)	Срок микробиологического очищения очага, дни (среднее)
1(10)	Заявляемый способ	0,1	23	34	42
		1	19	30	39
		10	16	27	35
2(10)	Прототип	0,1	33	42	52
		1	31	43	53
		10	32	42	50
3(10)	Аппликация раствора нуклеазы в фосфатном буфере	0,1	31	43	50
		1	29	40	49
		10	29	41	53
4(10)	Аппликация стерильного фосфатного буферный раствор (негативный контроль)	-	31	42	52
5(10)	Аппликация взвеси «пустых» MLV-липосом (контроль MLV-липосом)	-	32	44	52
6(10)	1% крем тербинафина (позитивный контроль)	-	22	36	42

При анализе результатов видно, что заявляемый способ гораздо более эффективен, чем прототип, и сравним по результатам или превосходит воздействие известного антимикотического препарата.

Аналогичные данные получены при сравнении заявленного способа и прототипа на данной модели в профилактическом режиме введения. Введение в профилактическом режиме проводили за 2 часа до инокуляции инфекционнного агента в кожу. Способ-прототип не оказывал профилактического действия, заявленный способ превосходил по профилактическому эффекту нанесение 1% крема тербинафина.

Пример 3. При реализации способа человеческую рекомбинантную ДНКазу I (производства фирмы «Genentech», препарат «Пульмозим») вводили в MLV-липосомы размером 2000 нм и температурой фазового перехода 65°С.

В исследование включили 30 женщин в возрасте от 41 до 55 лет. Перед началом исследования женщины были распределены по группам следующим образом. В группе 1 взвесь MLV-липосом в 4-6 мл буферного раствора наносили на кожу лица в объеме 4-6 мл из расчета 0,01 ед. Кунца на 1 см² поверхности кожи в соответствии с заявляемым способом. В группе 2 ту же ДНКазу апплицировали в липосомах, описанных в прототипе. В группе 3 апплицировали взвесь MLV-липосом, полученных также, как и для группы 1, но не нагруженных ферментом («пустые» липосомы) и в таком же объеме буферного раствора.

Все аппликации производились 2 раза в день.

Перед началом исследования и после его окончания измерялись и оценивались: средняя глубина морщин (с помощью метода силиконовых реплик), эластический индекс (с помощью аппарата Dermaflex А фирмы «Cortex Ltd, Denmark»), толщина эпидермиса и дермы (с помощью аппарата Dermascan С фирмы «Cortex Ltd, фирмы Denmark»). Эффекты воздействия оценивали на 0 (перед началом воздействия), 60 и 120 день исследования.

Результаты исследования приведены в таблице 3.

& Р<0,01 по сравнению с группой 2.

Из анализа результатов следует, что заявляемый способ эффективнее, чем способ-прототип, устраняет ассоциированные со старением изменения всех показателей косметического здоровья кожи.

Применение заявленного способа в профилактическом режиме (курсами по 15 дней каждые 2 месяца в течение 2 лет) показало, что развитие изменений кожи, ассоциированных со старением, задерживается на срок 5-6 месяцев. То есть соответствующие изменения возникают у женщин, получающих воздействие в соответствии с заявленным способом, на 5-6 месяцев позже, чем у женщин, не применяющих заявленный способ.

Пример 4. Использование заявленного способа локально в режиме мезотерапии - в средние слои дермы - для уменьшения проявлений «целлюлита» (дистрофического изменения подкожной клетчатки).

Бычью панкреатическую ДНКазу (препарат «Дезоксирибонуклеаза» производства ООО «Самсон-мед», Санкт-Петербург) вводили в MLV-липосомы размером 1500 нм и температурой фазового перехода мембран 45°С.

Исследование провели на 42 женщинах в возрасте от 45 до 65 лет. Женщин случайным образом распределяли в три группы по 9-12 человек.

В каждой группе проводили воздействие на одинаковые участки кожи проблемных зон.

Первой группе женщин взвесь MLV-липосом в соответствии с заявляемым способом вводили подкожно с помощью мезоинжектора PISTOR-4 на глубину 1-1,5 мм, инъекции производились на расстоянии 2-3 мм друг от друга. Введение проводили сеансами 1 раз в день в течение 15 дней с перерывами между курсами 10 дней. Воздействие проводили в течение 3 месяцев.

Второй группе те же липосомы вводились с помощью безигольной системы Medi-Jector VISION в том же режиме и объемах, что и в первой группе.

Третья группа получала ферменты согласно способу-прототипу. Липосомы вводились в том же объеме буферного раствора, что и в первой группе.

Во всех трех описанных группах приходилось одно и то же количество ферментативной активности ДНКазы в расчете на 1 см² кожи.

Четвертой группе (плацебо-группа) вводили взвесь «пустых» MLV-липосом, не нагруженных ферментом, в тех же объемах буфера и таким же образом, как и в группе 1.

Все препараты готовили в асептических условиях.

Курс воздействия состоял из 15 сеансов, проводимых через день. Оценивался процент уменьшения на всю группу в целом площади дистрофических изменений подкожной клетчатки (по наличию характерного симптома «лимонной корочки»)

Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4
Группа	Количество наблюдений	Процент уменьшения площади на группу
1	10	55
2	9	64
3	12	0
4	11	5

Из данных, представленных в таблице 4, следует, что заявляемый способ позволяет ослабить нежелательные дистрофические процессы в подкожной клетчатке («целлюлит»), при этом способ-прототип, практически, не оказывает влияния на этот процесс.

Дополнительные исследования показали, что у женщин 35-40-летнего возраста, которым MLV-липосомы, полученные, как это описано в примере 4, вводились в профилактическом режиме вышеописанным мезотерапевтическим методом (10 ежедневных курсов с интервалом в 30 дней) в зоны ягодичной и бедренной области, явлений «целлюлита» в зонах введения не возникало. Применение же способа-прототипа (введение в аналогичном режиме) не оказывало подобного профилактического эффекта.