способ ингибирования роста опухолей головного мозга с помощью отобранных антагонистов интегринов

Формула изобретения

Способ индуцирования апоптоза клеток опухоли головного мозга, растущих в головном мозге хозяина, включающий введение хозяину терапевтически эффективного количества антагониста интегрина _v, представляющего собой цикло(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val).

Описание изобретения к патенту

Предпосылки изобретения

Область техники

Настоящее изобретение, в целом, относится к ингибированию роста опухолей, конкретно к ингибированию роста опухолей головного мозга.

Уровень техники

В описании настоящей заявки различные ссылки приводятся в круглых скобках. Описания этих публикаций целиком включены в настоящую заявку в качестве ссылок для более полного описания состояния области техники, к которой относится настоящее изобретение. Полные библиографические сведения по этим ссылкам можно найти в конце настоящей заявки, перед формулой изобретения.

Опухоли головного мозга, как и прочие солидные опухоли, требуют постоянного увеличения кровоснабжения для поддержания непрерывного роста свыше 1-2 мм³ (1,2). Это осуществляется с помощью ангиогенеза, процесса, который наблюдается в ответ на эндотелиальные факторы роста, высвобождаемые опухолевыми клетками. Ангиогенез включает индукцию пролиферации эндотелиальных клеток из микрососудистого русла, находящегося в состоянии покоя, миграцию неоэндотелия по направлению к опухолевому ложу и, наконец, созревание в новую капиллярную сеть (3). Опухоли головного мозга являются наиболее ангиогенными из всех новообразований у человека. Главными ангиогенными факторами, которые демонстрируются как гибридизацией in situ, так и специфичными антителами в срезах тканей пациентов с глиобластомой и медуллобластомой, наиболее распространенными злокачественными опухолями головного мозга, являются сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF) (4-7). Фактически, экспрессия VEGF и плотность микрососудов в глиальных опухолях прямо коррелирует со степенью злокачественных характеристик и общим результатом (8-9).

Недавно полученные данные наводят на мысль о том, что ангиогенез регулируется путем активации интегринов эндотелиальных клеток, семейства трансмембранных рецепторов, которые управляют адгезией клеток к белкам внеклеточного матрикса (ЕСМ), посредством связывания с аминокислотной последовательностью Arg-Gly-Asp (RGD) (10). В ответ на bFGF и VEGF эндотелиальные клетки увеличивают экспрессию интегринов _{V 3} и _{V 5}, соответственно (11-13). Глиобластомы и эндотелий связанных с ними сосудов, как было установлено, экспрессируют интегрины _{V 3} и _{V 5} (14, 15). Опосредованная интегринами адгезия приводит к распространению внутриклеточных сигналов, которые способствуют выживанию, пролиферации и подвижности клеток, а также прорастанию капилляров (16, 17). Неспособность этих интегринов связаться с лигандом ведет к апоптозу эндотелиальных клеток (18, 19). Гликопротеин матрикса, витронектин, служит лигандом для _{V 3} и _{V 5} и вырабатывается в ведущем инвазивном крае злокачественных глиом (15, 20). Вместе эти открытия предполагают комплексное паракринное взаимодействие между опухолевыми клетками, ЕСМ головного мозга и интегринами эндотелиальных клеток для непрерывного ангиогенеза и роста злокачественных опухолей головного мозга.

Исследования с использованием анти- _{V 3} антитела, LM-609, или RGD циклического пептидного антагониста _{V 3} и _{V 5}, который препятствует интегрин-ЕСМ взаимодействиям, показали реакцию, препятствующую ангиогенезу, в хориоаллантоисной мембране (САМ) цыплят и на мышиной химерной модели (21-23). Другие агенты, которые действуют на альтернативных участках процесса ангиогенеза, такие как антитела против VEGF или участка связывания с его рецептором тирозинкиназы, также были эффективны в отношении ингибирования ангиогенеза (24, 25).

Ранее проводившиеся исследования показали, что связывание клеток карциномы молочной железы, меланомы и аденокарциномы толстого кишечника HT29-D4 с витронектином зависит от _V, _{V 3} и _{V 5}, соответственно (51-53). Витронектин, который вырабатывается опухолевыми и эндотелиальными клетками, распознается _{V 3} и _{V 5} и представляет собой белок ЕСМ, обнаруживаемый в участках инвазии и неоваскуляризации опухоли (54-55). Таким образом, помимо поддержки выживания эндотелиальных клеток посредством связывания с _V, и, следовательно, ангиогенеза, экспрессия витронектина может еще более усиливать адгезию опухолевых и эндотелиальных клеток, которые экспрессируют интегрины _{V 3} и _{V 5}, что способствует их инвазии. В одном исследовании с использованием SCID мышиной/человеческой химерной модели рака молочной железы инвазия опухоли была значительно снижена после введения анти- _{V 3} антитела LM-609, что предполагает прямое воздействие на биологию опухолевых клеток посредством блокады _{V 3} (56).

Опухоли головного мозга, в силу их высокоинвазивной природы и высокой степени ангиогенеза, представляют собой отличную модель для дальнейшего изучения роли интегринов в прогрессировании опухолей. Многочисленные исследования показали, что плотность микрососудов коррелирует с исходами и степенью злокачественности астроцитом (57-59). Ингибиторы ангиогенеза, такие как TNP-470, тромбоспондин-1 и тромбоцитарный фактор 4, внедряли в экспериментальные опухоли головного мозга и показали ингибирование опухолевого роста (60-62). Однако до настоящего времени ни в одном исследовании не изучалось воздействие антагонизма в отношении интегринов на инвазию и ангиогенез опухолей головного мозга. Следовательно, существует необходимость изучения этого эффекта и, таким образом, создания нового способа лечения опухолей головного мозга.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии того факта, что направленный антагонизм в отношении интегринов, в частности, _{V 3} и _{V 5}, может существенно ингибировать онкогенез головного мозга in vivo. Оно основано также на открытии того факта, что микроокружение опухоли головного мозга имеет ключевое значение для поведения опухоли и для определения ее чувствительности к таким биологически направленным лекарственным средствам. Настоящее изобретение основано также на открытии того факта, что антагонизм в отношении интегринов может оказывать антионкогенный эффект, независимо от анти-ангиогенеза, который может действовать синергически для задержки опухолевого роста. Например, именно настоящее изобретение открыло тот факт, что антагонизм в отношении интегринов может индуцировать непосредственную гибель клеток опухолей головного мозга.

Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения представляется способ ингибирования роста опухоли в головном мозге хозяина. Указанный способ включает введение хозяину, который нуждается в указанном ингибировании, терапевтически эффективного количества антагониста интегрина.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения интегрин представляет собой _{V 3} или _{V 5}. Антагонист представляет собой полипептидный антагонист _V, антитело против _{V 3}, антитело против _{V 5} или комбинацию антител, соответственно, против _{V 3} и _{V 5}.

Другим аспектом настоящего изобретения является представление способа ингибирования ангиогенеза в опухолевой ткани, расположенной в головном мозге хозяина. Указанный способ включает введение хозяину композиции, содержащей ингибирующее ангиогенез количество антагониста интегрина _V.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения интегрин представляет собой _{V 3} или _{V 5}. Антагонист представляет собой полипептидный антагонист _V, антитело против _{V 3}, антитело против _{V 5} или комбинацию антител, соответственно, против _{V 3} и _{V 5}.

Другим аспектом настоящего изобретения является представление способа ингибирования ЕСМ-зависимой клеточной адгезии клеток опухоли головного мозга, растущих в головном мозге хозяина. Указанный способ включает введение хозяину терапевтически эффективного количества антагониста интегрина _V, т.е. интегринов _{V 3} или _{V 5}. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антагонист представляет собой полипептидный антагонист _V или комбинацию антител, соответственно, против _{V 3} и _{V 5}.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является представление способа ингибирования витронектин-зависимой клеточной миграции в клетках опухоли головного мозга, растущих в головном мозге хозяина. Указанный способ включает введение хозяину терапевтически эффективного количества антагониста _V.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антагонист представляет собой полипептидный антагонист _V или антитело против _{V 3}.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является представление способа индуцирования апоптоза опухолевых клеток, растущих в головном мозге хозяина. Указанный способ включает введение хозяину терапевтически эффективного количества антагониста интегрина.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения интегрин может представлять собой _{V 3} или _{V 5}. Антагонист может представлять собой полипептидный антагонист _V.

Способы по настоящему изобретению хорошо подходят для применения при лечении опухолей головного мозга in vivo. Настоящее изобретение создает новый терапевтический подход к лечению опухолей головного мозга.

Описание фигур

Упомянутые выше и другие признаки настоящего изобретения, а также способ их достижения будут более ясными и доступными для понимания при использовании следующего описания в сочетании с прилагаемыми чертежами. Эти чертежи изображают только типичный вариант осуществления настоящего изобретения и не ограничивают, таким образом, его объем. Они служат целям достижения большей конкретности и детальности. На этих чертежах:

фиг.1а и 1b показывают ингибирование ангиогенеза (а) и роста опухоли на САМ (b) с помощью антагониста _V;

Фиг.2 показывает размер опухоли (А) и выживание мышей (В) после интрацеребральной инъекции клеток DAOY и U87MG;

фиг.3а и 3b показывают гистопатологию ортотопически инъецированных клеток опухоли головного мозга DAOY (а) и U87MG (b), у животных, ежедневно получавших неактивный (А) или активный пептид (B-D). Большие интрацеребральные опухоли (показаны стрелками) видны у контрольных животных (А), в то время как у животных, получавших _V-антагонист, опухоли не были выявлены (В) или были выявлены только микроскопические остаточные опухоли (С и D) (показаны стрелками);

фиг.4 показывает выживание мышей после ортотопической имплантации опухоли головного мозга, получавших активный или неактивный пептид;

фиг.5 показывает воздействие антагониста _V на ортотопически (в головной мозг) и гетеротопически (подкожно) имплантированные клетки DAOY;

фиг.6a-6d показывают профиль интегринов (а) и воздействие антагониста _V на адгезию (b), миграцию на витронектин (с) и жизнеспособность клеток на витронектине (d) для клеток опухоли головного мозга и клеток эндотелия капилляров головного мозга;

фиг.7 показывает воздействие циклического пентапептида на адгезию опухолевых клеток к белкам ЕСМ;

фиг.8 показывает эффект ингибирования адгезии, приводящий к гибели клеток (апоптозу), для клеток опухоли головного мозга и клеток капилляров головного мозга. Этот эффект ограничивается витронектином и тенасцином ЕСМ;

фиг.9 показывает иммуногистохимию опухолей головного мозга U87, ксенотрансплантированных в передний мозг бестимусных мышей, которых лечили активным (анти- _V) или контрольным пептидом.

Подробное описание изобретения

Одним аспектом настоящего изобретения является представление способа ингибирования опухолевого роста в головном мозге хозяина, включающего введение хозяину, который нуждается в указанном ингибировании, терапевтически эффективного количества антагониста интегрина.

Способ по настоящему изобретению можно использовать для лечения любых опухолей, которые растут в головном мозге, до тех пор, пока рост опухолей в головном мозге требует взаимодействия интегрина с его лигандом. Примеры такой опухоли включают, но не ограничивают, глиобластому, медуллобластому (астроцитому, другие примитивные злокачественные опухоли, происходящие из нейроэктодермы и стволовых клеток глии головного мозга). Для цели настоящего изобретения, предпочтительно, рост опухоли наблюдается интрацеребрально в головном мозге хозяина. Хозяином может быть любое млекопитающее, включая, без ограничения, крысу и человека. Рост опухоли ингибируется, если рост замедляется лечением.

Для цели настоящего изобретения интегрин представляет собой любой член специфического семейства гомологичных гетеродимерных трансмембранных рецепторов. Указанные рецепторы управляют адгезией клеток, посредством связывания с аминокислотной последовательностью Arg-Gly-Asp (RGD). Указанные рецепторы могут экспрессироваться как опухолевыми, так и нормальными клетками. Свойства интегринов хорошо известны и хорошо охарактеризованы и подробно описаны в цитируемых ссылках (1, 2), содержание которых, имеющее отношение к рассматриваемому вопросу, включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Примеры интегринов включают, но не ограничивают, семейство _V, такие, как _{V 3}, _{V 5}, _{V 1}, _{V 6 V 8} и т.п.

Антагонист интегрина представляет собой молекулу, которая блокирует или ингибирует физиологическую или фармакологическую активность интегрина путем ингибирования связывающей активности интегрина, рецептора, с его лигандом, различными белками матрикса, включая, без ограничения, витронектин, тенасцин, фибронектин и коллаген I. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антагонист интегрина может представлять собой антагонист интегрина _{V 3} или интегрина _{V 5}. Предпочтительные антагонисты интегрина могут представлять собой моноклональное антитело, фрагмент моноклонального антитела или пептид.

Например, антагонистом _{V 3} может быть любой фактор, который ингибирует связывание _{V 3} с одним из его многочисленных лигандов, а именно витронектином или тенасцином. Примеры антагонистов _{V 3} описаны в РСТ публикациях WO 96/37492 и WO 97/45137, содержание которых, имеющее отношение к рассматриваемому вопросу, включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Подобно этому, антагонистом _{V 5} может быть любой фактор, который ингибирует связывание _{V 5} с его лигандом, а именно витронектином. Примеры антагонистов _{V 5} описаны в РСТ публикации WO 97/06791, содержание которой, имеющее отношение к рассматриваемому вопросу, включено в настоящий документ в качестве ссылки.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антагонист представляет собой полипептидный антагонист _V, а именно, полипептидный антагонист _{V 3} и _{V 5}. Предпочтительно, полипептид представляет собой полипептид, содержащий Arg-Gly-Asp (RGD). В одном варианте осуществления полипептидный антагонист представляет собой RGD циклический пентапептидный антагонист _V.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, антагонист может представлять собой моноклональное антитело, иммуноспецифичное в отношении _{V 3} или _{V 5}. Альтернативно, он может представлять собой комбинацию антител, соответственно, против _{V 3} и _{V 5}. В одном варианте осуществления моноклональное антитело, иммуноспецифичное в отношении _{V 3}, имеет иммунореактивные характеристики моноклонального антитела, обозначаемого как LM-609. В другом варианте осуществления моноклональное антитело, иммуноспецифичное в отношении _{V 5}, имеет иммунореактивные характеристики моноклонального антитела, обозначаемого как Р1-F6. Как антитело LM-609, так и антитело P1-F6, хорошо известны в промышленности и являются коммерчески доступными от компании Chemicon, Temecula, California.

Для цели настоящего изобретения антагонисты можно использовать в отдельности или в комбинации друг с другом в способе по настоящему изобретению для ингибирования роста опухолей головного мозга.

Терапевтически эффективное количество представляет собой количество антагониста, достаточное для обеспечения поддающегося измерению ингибирования роста опухоли в головном мозге хозяина, подвергаемого лечению. Ингибирование роста опухоли можно определять микроскопически после окрашивания, как описано в настоящем документе, MRI-сканированием головного мозга мыши или инкорпорацией 3Н-тимидина; все эти методики хорошо известны специалистам.

Поскольку антагонист интегрина может принимать форму RGD-содержащего пептида, анти- _{V 3} моноклонального антитела или его фрагмента, анти- _{V 5} моноклонального антитела или его фрагмента, или комбинации моноклональных антител _{V 3} и _{V 5}, следует оценить тот факт, что эффективность, и, следовательно, понятие “терапевтически эффективное количество” может варьироваться. Однако, как показано с помощью настоящих методик исследования, специалист может легко оценить эффективность антагониста-кандидата по настоящему изобретению.

Эффективность антагониста можно измерить с помощью ряда способов, включая, без ограничения, ингибирование ангиогенеза в анализе САМ, изучении опухоли in vitro и путем измерения ингибирования связывания натуральных лигандов с интегринами, такими как _{V 3} или _{V 5}, как описано в настоящем документе, и с помощью других подобных исследований.

Пределы доз для введения антагониста зависят от формы антагониста и его эффективности в отношении конкретного интегрина. Специалист может подобрать подходящую дозу для конкретного антагониста с учетом описания настоящего изобретения без излишнего экспериментирования. Доза должна быть достаточно велика, чтобы оказывать желаемое действие, благодаря которому рост опухоли головного мозга ингибируется. Доза не должна быть настолько большой, чтобы вызывать появление побочных эффектов, таких как отек мозга или быстрое высвобождение цитокинов из опухолей мозга, индуцирующее кахексию, например, когда антагонист интегрина по настоящему изобретению вводится в форме полипептида. Доза на кг массы тела может варьировать от 1 до 20 мг, при введении один или более раз в день, в течение одного или нескольких дней, или в течение неопределенного периода времени. Когда антагонист интегрина по настоящему изобретению вводят в форме моноклонального антитела, доза может варьироваться от 1 до 20 мг/кг, при введении один-два раза в неделю в течение неопределенного периода времени.

Полипептид или моноклональные антитела по настоящему изобретению можно вводить парентерально путем инъекции или постепенной инфузии в течение некоторого периода времени. Несмотря на то, что ткань, подлежащую лечению, наиболее часто лечат интраперитонеальным или подкожным (антитело) введением, антагонисты по настоящему изобретению можно вводить также интраокулярно, внутривенно, внутримышечно, внутриполостным введением, чрескожно, и использовать при этом перистальтические технические средства.

Композиции вводят таким способом, который является совместимым с данной лекарственной формой и в терапевтически эффективном количестве. Количество для введения, а также время введения зависят от субъекта, подвергаемого лечению, способности организма субъекта утилизировать активный ингредиент и степени желательного терапевтического эффекта. Точные количества активного ингредиента, которые требуются для введения, зависят от оценки практикующего врача и являются индивидуальными для каждого субъекта. Однако подходящие пределы доз для системного введения описываются в настоящем документе и зависят от пути введения. Подходящие схемы введения также разнообразны, однако типизируются первоначальным введением, с последующими повторными дозами с интервалами один или более часов инъекцией или другим способом введения.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, пригодной для осуществления на практике терапевтических способов, описанных в настоящем документе. Композиции содержат антагонист по настоящему изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Используемые в настоящем документе термины “фармацевтически приемлемый” “физиологически переносимый” и их грамматические варианты, которые относятся к композициям, носителям, разбавителям и реагентам, используются взаимозаменяемым образом и означают, что указанные материалы можно вводить млекопитающему без нежелательных физиологических эффектов.

Препараты для парентерального введения пептида или антитела по настоящему изобретению включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и пригодные для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевые и буферные среды. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом или жирные масла. Внутривенные носители включают жидкостные и питательные восполнители, электролитные восполнители (такие как восполнители на основе декстрозы Рингера) и т.п. Консерванты и другие добавки также могут иметь место, такие как, например, антимикробные, антиоксидантные, хелатирующие агенты, а также инертные газы и т.п.

Другой особенностью настоящего изобретения является способ ингибирования ангиогенеза в опухолевой ткани, расположенной в головном мозге хозяина. Указанный способ включает введение хозяину композиции, включающей ингибирующее ангиогенез количество антагониста интегрина.

Как обсуждалось в разделе “Предпосылки к созданию изобретения” ангиогенез представляет собой образование неоваскулярной сети из уже существующих сосудов хозяина и требуется для роста опухоли свыше 1-2 мм³ . Для цели настоящего изобретения ангиогенез подавлен, если ангиогенез и симптомы заболевания, опосредованного ангиогенезом, уменьшаются.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения опухолевая ткань находится интрацеребрально, в головном мозге хозяина. Хозяином может быть любое млекопитающее. Примеры хозяина включают, без ограничения, мышь, крысу и человека.

Диапазоны доз для введения антагониста зависят от формы антагониста и его эффективности в отношении конкретного интегрина. Специалист может подобрать подходящую дозу для конкретного антагониста с учетом описания настоящего изобретения без излишнего экспериментирования. Доза должна быть достаточно велика, чтобы оказывать желаемое действие, благодаря которому ангиогенез и симптомы заболевания, опосредованного ангиогенезом, уменьшаются. Доза не должна быть настолько большой, чтобы вызывать появление побочных эффектов, таких как отек мозга из-за быстрого лизиса опухоли с высвобождением цитокинов или кровотечением.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антагонист интегрина может представлять собой антагонист интегрина _{V 3} или интегрина _{V 5}. Предпочтительными антагонистами интегрина могут быть моноклональное антитело или пептид. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антагонист представляет собой полипептидный антагонист _V, а именно, полипептидный антагонист _{V 3} и _{V 5}. Предпочтительно, полипептид представляет собой полипептид, содержащий Arg-Gly-Asp (RGD). В одном варианте осуществления полипептидный антагонист представляет собой RGD циклический пентапептидный антагонист _V.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, антагонистом может быть антитело против _{V 3} и комбинация антител, соответственно, против _{V 3} и _{V 5}.

Терапевтически эффективное количество представляет собой количество антагониста, достаточное для обеспечения поддающегося измерению ингибирования ангиогенеза в ткани, подвергаемой лечению, т.е. количество, ингибирующее ангиогенез. Ингибирование ангиогенеза можно измерить in situ методами иммуногистохимии, как описано в настоящем документе, или с помощью других методик, известных специалистам.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, пригодной для осуществления на практике терапевтических способов, описанных в настоящем документе. Композиции содержат антагонист по настоящему изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Еще одной особенностью настоящего изобретения является способ ингибирования ЕСМ-зависимой клеточной адгезии клеток опухоли головного мозга, которые растут в головном мозге хозяина, который включает введение хозяину терапевтически эффективного количества антагониста интегринов _{V 3} или _{V 5}.

Для цели настоящего изобретения ЕСМ-зависимая клеточная адгезия включает любую клеточную адгезию, которая зависит от ЕСМ и которая опосредована _V-интегринами. Примеры указанной адгезии включают, без ограничения, витронектин-зависимую клеточную адгезию и тенасцин-зависимую клеточную адгезию. Именно настоящее изобретение открыло то, что опухоли головного мозга человека могут вырабатывать витронектин и тенасцин, а ЕСМ играет важную роль в адгезии опухолевых клеток и миграции посредством взаимодействия с интегринами. Для цели настоящего изобретения ингибирование достигается, если адгезия опухолевых клеток к ЕСМ уменьшается.

Фраза “терапевтически эффективное количество”, используемая в настоящем документе, означает количество антагониста, которое достаточно для уменьшения ЕСМ-опосредованной адгезии опухолевых клеток. Клеточную адгезию можно измерить с помощью способов, описанных в настоящем документе, а также способов, хорошо известных специалистам.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения антагонист может представлять собой полипептидный антагонист _V или комбинацию антител, соответственно против _{V 3} и _{V 5}. Например, антагонист может представлять собой RGD циклический пентапептидный антагонист _V или комбинацию моноклональных антител, обозначаемых как LM-609 и P1-F6.

Другой особенностью настоящего изобретения является способ ингибирования витронектин-зависимой клеточной миграции клеток опухоли головного мозга, растущей в головном мозге хозяина, который включает введение хозяину терапевтически эффективного количества антагониста _{V 3}.

Для цели настоящего изобретения ингибирование достигается, если миграция опухолевых клеток уменьшается.

Фраза “терапевтически эффективное количество”, используемая в настоящем документе, означает количество антагониста, которое достаточно для уменьшения витронектин-зависимой миграции опухолевых клеток. Миграцию клеток можно измерить с помощью способов, описанных в настоящем документе, а также способов, хорошо известных специалистам.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения антагонист может представлять собой полипептидный антагонист _V или моноклональное антитело, иммунореактивное в отношении _{V 3}. Например, антагонист может представлять собой RGD циклический пентапептидный антагонист _V или моноклональное антитело, обозначаемое как LM-609.

Настоящее изобретение относится также к способу индуцирования апоптоза клеток опухоли головного мозга, растущей в головном мозге хозяина. Указанный способ включает введение хозяину терапевтически эффективного количества антагониста интегрина.

Для цели настоящего изобретения апоптоз клеток опухоли головного мозга индуцируется, если после введения антагониста наблюдается увеличение количества апоптоза опухолевых клеток головного мозга. Терапевтически эффективное количество представляет собой количество антагониста, достаточное для получения поддающегося измерению апоптоза опухолевых клеток в головном мозге хозяина, подвергаемого лечению. Апоптоз опухолевых клеток в головном мозге можно измерить с помощью способов, описанных в настоящем документе, а также способов, хорошо известных специалистам.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, интегрин может представлять собой _V, _{V 3} или _{V 5}. Антагонист может представлять собой полипептидный антагонист _V.

ПРИМЕРЫ

Материалы и методы

Материалы: Активный циклический RGD пентапептид EMD 121974, цикло(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val) и неактивный контрольный пептид cRAD (EMD 135981) были предоставлены А. Jonczyk, Ph.D., Merck KgaA, Darmstadt, Germany. Моноклональные антитела LM-609 и P1-F6 описаны (13). Клеточные линии опухоли головного мозга DAOY и U87MG были приобретены в АТСС, Rockville, MD. Первичные культуры эндотелиальных клеток капилляров головного мозга человека были предоставлены M.Stins, Ph.D., Children’s Hospital, Los Angeles (49). Человеческий витронектин был приобретен у компании Promega, Madison, WI.

Анализ FACS: использовался цитометр FACS (Becton-Dickinson, San Jose). Условия описаны ранее (43). Первичные антитела представляли собой LM-609 и P1-F6 при 1:100, а вторичные Аb представляли собой меченные FITC антимышиные IgG козы при 1:250. Определение апоптоза производилось согласно инструкциям производителя (Clontech, Palo Alto, CA, набор для определения апоптоза Аро Alert Annexin V-FITC).

Адгезия: Условия анализа были описаны ранее (15). Лунки, обработанные нетканевой культурой, инкубировали в течение ночи при 4° С с витронектином (1-10 мкг/мл PBS), промывали и блокировали в течение 30 мин денатурированным нагреванием 1% BSA в PBS, после чего промывали PBS. Контрольные и тест-клетки, предварительно инкубированные при 37° С с испытуемым веществом (20 мкг/мл) в адгезионном буфере в течение 30 мин, засевали в лунки (5× 10⁴ клеток на лунку) и инкубировали в течение 1 ч при 37° С. После осторожного промывания лунок адгезионным буфером прикрепившиеся клетки фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым, краской, растворенной в метаноле и определяли оптическую плотность (ОП) при 600° А.

Миграция: Межлуночные поликарбонатные фильтры (размер пор 8 мкм) инкубировали в течение 30 мин при 37° С с витронектином в PBS (1 мкг/мл на верхней стороне и 10 мкг на стороне дна), блокировали в течение 30 мин денатурированным нагреванием 1% BSA в PBS и промывали PBS. Тест-клетки (5× 10⁴ клеток на лунку) добавляли в адгезионный буфер, содержавший указанные испытуемые вещества (20 мкг/мл), и инкубировали в течение 4 ч при 37° С; при этом нижняя камера содержала адгезионный буфер. Клетки из верхней камеры удаляли марлевой салфеткой, а клетки из донной части фильтра фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым, а количество мигрировавших клеток определяли путем подсчета.

Апоптоз: Условия адгезии описаны выше, за исключением того, что 12-ячеечные чашки покрывали витронектином, а 5× 10⁵ клеток на лунку засевали в адгезионный буфер. После 30 мин инкубации при 37° С адгезионный буфер заменяли буфером, содержавшим 20 мкг/мл активного cRGD или неактивного cRAD пептида, и инкубировали в течение еще 4 ч. Прикрепившиеся клетки трипсинизировали и объединяли с открепившимися клетками в надосадочной жидкости, а затем исследовали на предмет апоптоза клеток с использованием набора для определения апоптоза Аро Alert Annexin V-FITC (Clontech).

Анализ САМ: Получение и подготовка яиц к эксперименту описаны ранее (23). Опухолевые клетки засевали в 50 мкл PBS в количестве 4× 10⁶ клеток на яйцо для DAOY и в количестве 3,5× 10⁶ клеток на яйцо для U87MG. Клетки выращивали до опухолей в течение 7 дней, затем собирали в стерильных условиях, обрезали до одинаковых размеров и повторяли процедуру на САМ 10-дневных эмбрионов. На следующий день в вену САМ инъецировали активный или неактивный пептид (100 мкг на яйцо). Опухоли фотографировали in situ через 7 дней роста, затем собирали, взвешивали и фиксировали в 4% формалине с буфером и заливали парафином. После получения серийных срезов, препараты окрашивали гематоксилином и эозином.

Модель опухоли головного мозга: Детально модель описана заявителями (31). Опухолевые клетки (10⁶/10 мкл PBS) инъецировали интрацеребрально в указанных участках. Интраперитонеальное лечение активным cRGD или неактивным cRAD пептидом (100 мкг/ 50 мкл/мышь) начинали на 3 день после имплантации для клеток U87MG и на 10 день для клеток DAOY и повторяли ежедневно до тех пор, пока не появлялось состояние кахескии и/или агонии. Животных затем умерщвляли с использованием анестезии СO₂, головной мозг удаляли и быстро замораживали или фиксировали в формалине с буфером, заливали в парафин и полученные срезы окрашивали гематоксилин-эозином.

Подкожный рост опухоли: Для подкожного роста опухоли клетки (10⁶ на мышь) инъецировали п/к под правую переднюю лапу немедленно после интрацеребральной инъекции.

Исследования на животных: Исследования на животных проводили согласно руководству NIH и с разрешения местного комитета защиты животных.

Эксперименты

Ангиогенез на САМ

Для оценки влияния антагонизма в отношении _V на ангиогенез, связанный с опухолью головного мозга, клетки опухоли головного мозга человека DAOY и U87MG выращивали на хориоаллантоисной мембране (САМ) цыплят. Опухолям позволяли расти в течение 7 дней, после чего их удаляли и реимплантировали на свежие САМ. Через 24 часа после переноса 100 мкг активного пептида cRGD или контрольного пептида (cRAD) инъецировали в вену САМ. Опухоли выращивали еще 6 дней, а затем взвешивали и анализировали на предмет васкуляризации. При изучении под стереоскопическим микроскопом опухоли, получавшие контрольный пептид, демонстрировали распространенный ангиогенез, в то время как опухоли, получавшие антагонист _V, демонстрировали достоверное подавление ангиогенеза (фиг.1a).

Рост опухолей также ингибировался антагонистом _V. В противоположность контрольным опухолям, вес которых увеличился на 80%, вес опухолей, леченных антагонистом _V, уменьшался на 30% (фиг.1b). Эти данные предполагают, что ингибирование опухолевого роста антагонизмом в отношении _V приводят к нарушению ангиогенеза, связанного с опухолью.

Фиг.1а и 1b показывают ингибирование ангиогенеза (а) и опухолевого роста на САМ (b) антагонистом _V. Опухоли головного мозга, выращенные на САМ, собирали и нарезали на кусочки одинаковых размеров и помещали на свежие САМ яиц с 10-дневными эмбрионами. На следующий день в вены цыплят инъецировали 100 мкг активного ингибитора _V или контрольного пептида и выращивали еще в течение 6 дней. В яйцах, которые получали контрольный пептид, наблюдался достоверный ангиогенез (а) (DAOY=A и U87MG=C), в то время как в яйцах, получавших активный пептид, наблюдалось достоверное подавление неоваскуляризации (DAOY=B и U87MG=D). Опухоли, помещенные на САМ, взвешивали в начале и в конце эксперимента (b). Вес опухолей, обработанных контрольным пептидом, увеличивался на 80% для обоих типов опухоли (слева, n=8), в то время как он уменьшался приблизительно на 30% в случае введения активного пептида (справа, n=8).

Ортотопическая модель опухоли

Клетки DAOY и U87MG (106 клеток на мышь) стереотаксически инъецировали в правую часть коры лобной доли бестимусных мышей с целью создания системы, которая повторяет микроокружение головного мозга. Этот способ позволял получить модель онкогенеза в головном мозге человека с хорошей воспроизводимостью и делал возможным измерение роста опухоли и выживания мышей в течение времени, предшествовавшего интродукции антагонизма в отношении _V (фиг.2а и 2b). Фиг.2 показывает размер опухолей (А) и выживание мышей (В) после интрацеребральной инъекции клеток DAOY и U87MG. Клетки U87MG показали быстрый рост и достигали плато приблизительно 6 мм через 6 недель, в то время как клетки DAOY росли медленнее и достигали диаметра 5,5 мм через 9 недель (А). Все животные погибли на 9 неделе (В). Для каждой временной точки n=5 или 6.

С целью изучения эффекта пептида cRGD на этой модели опухоли сначала выращивали в течение 7 дней (DAOY) или 3 дней (U87MG), затем производили ежедневное и/п введение антагониста _V (100 мкг на мышь) или его неактивного контроля в течение дополнительных 3 недель. К моменту умерщвления (общее время роста опухоли составляло 4 недели) у контрольных мышей наблюдались большие видимые невооруженным глазом опухоли головного мозга среднего размера 3 мм (DAOY) и 5,5 мм (U87MG). У леченных мышей опухолей не было или наблюдались лишь скудное остаточное количество опухолевых клеток в микроскопических агрегатах вдоль поверхностей желудочков и твердой мозговой оболочки (фиг.3а и 3b). Фиг.3а и 3b показывают гистопатологию ортотопически инъецированных клеток опухоли головного мозга DAOY (а) и U87MG (b), ежедневно леченных неактивным (А) или активным пептидом (B-D). Большие интрацеребральные опухоли (показаны стрелками) видны невооруженным глазом у контрольных животных (А), в то время как у животных, леченных антагонистом _V, опухолей не наблюдается (В) или выявляются только микроскопические остаточные опухоли (показаны стрелками) (С и D).

У леченных мышей сохранялся прежний вес 21 г; однако у контрольных мышей с DAYO и U87MG вес снизился до 16 г и 15 г, соответственно, что составило потерю веса по сравнению с исходным в 5-6 г (см. таблицу 1). Среднее время появления неврологических симптомов в контрольной группе составляло 2,5 недели для мышей с U87MG и 4,5 недели для мышей с DAYO, в то время как у леченных животных неврологических симптомов не было в течение всего времени наблюдения.

Таблица 1
Клеточная линия	Размер опухоли (мм)		Вес мыши (г)
	Головной мозг	Под кожей
DAYO Контрольный пептид Активный пептид	3,0±0,71 NM	18±1,41 17±0,84	16±1,3 21±0,89
U87MG Контрольный пептид Активный пептид	5,5±0,55 NM	20±1,0 19±0,77	15±0,45 20±0,71
NM = не поддается измерению

Дополнительное количество животных изучали на выживание. Выживание определяли на момент времени, в который животное необходимо было умертвить в связи с агональным состоянием. Всех контрольных животных умерщвляли до 6-недельного периода роста опухоли, и большинство животных (>50%) в обеих контрольных группах умерщвляли на 3-4 неделе (фиг.4). Фиг.4 показывает выживание мышей после ортотопической имплантации опухоли головного мозга, которые получали активный или неактивный пептид; и/п лечение (100 мкг на мышь в день) было начато на 3 день в случае клеток U87MG и на 7 день в случае клеток DAYO. Контрольные группы для DAYO и U87MG составляли по 16 животных, 32 мышей для леченых DAYO и 24 - для леченых U87MG. Фиг.4 показывает, что ни для одного из леченых животных не потребовалось умерщвление, и в настоящее время леченые мыши с DAYO выживают до 24 недель, а мыши с U87MG - 15 недель с момента инъекции опухолевых клеток. Ни у одного из леченых животных не появились неврологические симптомы, и все они продолжают нормально расти.

Гетеротопическая модель опухоли

Для определения влияния микроокружения на рост опухоли, подвергаемой антагонизму в отношении _V, заявители инъецировали те же самые клетки опухоли головного мозга подкожно (10⁶ клеток на бестимусную мышь), перед началом лечения активным или контрольным пептидом (100 мкг на мышь в день и/п) на 3 (U87MG) и 7 (DAYO) день после инъекции опухолевых клеток. В этих условиях не наблюдалось ингибирования роста опухоли активным пептидом, и через 6 недель опухоли в леченых и нелеченных группах оказались идентичными как на макроскопическом, так и на микроскопическом уровне, при наличии распространенного ангиогенеза (данные не показаны). Это показывает, что свойства, изначально присущие клеткам опухоли головного мозга, недостаточны для сообщения им чувствительности к действию антагониста cRGD пептида, но требуют условий, присущих только микроокружению головного мозга.

Для дальнейшего изучения этого феномена заявители инъецировали клетки DAYO и U87MG интракраниально и подкожно, перед началом лечения пептидами, как описано для случая ортотопической модели. Фиг.5 показывает влияние антагониста _V на ортотопически (в головной мозг) и гетеротопически (под кожу) имплантированные клетки DAYO. Опухолевые клетки (10 ⁶) инъецировали в головной мозг и под кожу, и начинали лечение неактивным (а) или активным (b) пептидом на 7 день. Фотографии делали через 4 недели. У животных, получавших неактивный (а) или активный (b) пептид, наблюдались подкожные опухоли (А) и васкуляризация (В) сходных размеров. И в тех, и в других условиях п/к опухоли прорастали в мышечный слой (показано стрелками) (С). Напротив, у контрольных животных развивались большие опухоли головного мозга (показано стрелками), в то время как у мышей, получавших активный пептид, опухолей не было или наблюдалось микроскопическое остаточное заболевание (D). Таким образом, фиг.5 показывает, что подкожные опухоли в контрольной и экспериментальной группах вырастали до среднего размера 18 мм³ с признаками распространенной васкуляризации (фиг.5). У контрольных мышей также развивались большие опухоли головного мозга, сходные по размеру с теми, которые ранее наблюдались на модели ортотопической опухоли, а также клинические признаки неврологической симптоматики (таблица 1). Напротив, мыши, получавшие активный пептид, выживали без признаков неврологической симптоматики, а вскрытие выявило отсутствие интрацеребральной опухоли или только остаточные микроскопические скопления опухолевых клеток (фиг.5). Однако в этой группе наблюдался прогрессирующий рост подкожных опухолей, который потребовал умерщвления животных через 10 недель. Это подтверждает тот факт, что опухоли, растущие интрацеребрально, чувствительны к лечению циклическим RGD пептидом, в то время как опухоли, растущие подкожно - нет.

Экспрессия интегринов

Витронектин представляет собой белок матрикса, который может влиять на различные биологические реакции, имеющие место в головном мозге и подкожных структурах. Он в изобилии содержится в экстраневральных областях, но в норме вырабатывается глиальной и нейрональной тканью (15, 20). Однако клетки злокачественной глиомы синтезируют витронектин, который, в свою очередь, может играть ключевую роль в их прикреплении и распространении (15). Альтернативно, витронектин может способствовать адгезии эндотелиальных клеток и их миграции по направлению к ложу опухоли, и, таким образом, способствовать ангиогенезу. Поскольку прикрепление клеток к витронектину опосредуется интегринами _{V 3} и _{V 5}, заявители осуществили анализ FACS, чтобы определить, экспрессируются ли интегрины _{V 3} и _{V 5} клетками медуллобластомы человека DAYO, глиобластомы человека U87MG и клетками первичных культур эндотелиальных клеток головного мозга человека (НВЕС) (фиг.6а).

Фиг.6a-6d показывают профиль интегринов (а), воздействие антагониста _V на адгезию (b), миграцию на витронектин (с) и жизнеспособность клеток на витронектине (d) для клеток опухоли головного мозга и клеток эндотелия капилляров головного мозга. Как опухолевые клетки DAYO, так и U87MG, а также клетки капилляров головного мозга экспрессируют _{V 3} и _{V 5} (a). Адгезия к витронектину достоверно подавлялась активным пептидом, а также комбинацией антител к _{V 3} и _{V 5} в то время как ни контрольный пептид, ни специфичные анти- _{V 3} и анти- _{V 5} антитела по отдельности не показывали достоверного эффекта. Миграция клеток по градиенту витронектина устранялась антителами против _{V 3} и антагонистом _V, в то время как ни контрольный пептид, ни анти- _{V 5} антитела не оказывали ингибирующего действия. Жизнеспособность клеток изучали, позволяя клеткам прикрепляться к витронектину в течение 1 часа, а затем, подвергая их в течение 4 часов действию контрольного пептида или антагониста _V (20 мкг/мл) (d). Прикрепившиеся и свободные клетки объединяли и исследовали с помощью FACS на предмет апоптоза, с использованием меченного FITC анти-аннексина V и пропидия иодида. В то время как в культурах, подвергавшихся воздействию контрольного пептида, наблюдался незначительный апоптоз (d, слева), как в эндотелиальных клетках капилляров головного мозга, так и в клетках DAOY выявили значительные количества апоптотических клеток (d, справа).

Фиг.6a-6d показывают, что клетки U87MG экспрессируют высокие уровни _{V 3} по сравнению с клетками DAYO, но последние экспрессируют большие количества _{V 5}. Клетки НВЕС, выращенные на среде, содержащей VEGF, экспрессируют большие количества _{V 5}, в то время как 50% клеток экспрессируют интегрин _{V 3} в короткоживущей культуре. Клетки также изучали с помощью анализа FACS через 2 дня роста в культуре на планшетах, покрытых витронектином. Экспрессия _{V 3} и _{V 5} в этих условиях не изменялась (данные не показаны).

Адгезия к витронектину

Для того, чтобы определить, регулируют ли _{V 3} и _{V 5} адгезию DAOY, U87MG И НВЕС к витронектину, клетки засевали на лунки, покрытые витронектином, и позволяли им прикрепляться в присутствии или отсутствии блокирующих антител против _{V 3} (LM-609) или против _{V 5} (P1-F6) или пептида cRGD. P1-F6 минимально ингибировали прикрепление клеток DAOY, в то время как LM-609 не оказывали влияния на прикрепление ни одного из этих типов клеток. Достоверное ингибирование адгезии всех клеток наблюдалось при инкубировании с P1-F6 и LM-609 вместе или только cRGD (фиг.6b). Эти данные показывают, что блокирования только интегрина недостаточно, и что для достоверного блокирования витронектин-зависимой адгезии испытуемых клеток требуется двойная блокада _{V 3} и _{V 5}.

Миграция на витронектин

Для того, чтобы установить, модулируют ли _{V 3} и _{V 5} миграцию на витронектин, заявители испытывали те же клетки на покрытых витронектином мембранах в камерах Бойдена в присутствии блокирующих антител или cRGD. P1-F6 не влияли на миграцию, однако, LM-609 и cRGD достоверно ингибировали миграцию всех трех типов клеток (фиг.6с). Поскольку LM-609 в отсутствии P1-F6 были неспособны блокировать адгезию, этот антимиграционный эффект должен быть опосредован через четкий путь, который является независимым от сил, ответственных за адгезию. Более того, LM-609 блокировал миграцию так же хорошо, как cRGD, что наводит на мысль о том, что выработка сигналов клетками, опосредованная _{V 3}, является ключевым компонентом при определении миграции изучавшихся клеток опухоли головного мозга и эндотелиальных клеток головного мозга.

Апоптоз

Астроцитомы продвинутых стадий вырабатывают витронектин на ведущем инвазивном крае, что наводит на мысль о том, что этот белок играет важную роль в прикреплении клеток опухоли головного мозга, их миграции и, возможно, выживании (15). Заявители ранее показали, что предварительная инкубация опухолевых или капиллярных клеток головного мозга с пептидом cRGD или с комбинацией анти- _{V 3} и анти- _{V 5} антител предотвращает адгезию клеток к витронектину. Был показан апоптоз эндотелиальных клеток и клеток меланомы после такого же ингибирования интегрин-зависимого прикрепления к белкам матрикса (26-28). Таким образом, представляло интерес, могут ли антагонисты _V индуцировать апоптоз этих клеток после их отсоединения от витронектина. Клетки DAOY и первичные НВЕС засевали в адгезионный буфер на лунки, покрытые витронектином (1 мкг/мл), и позволяли им прикрепляться в течение 30 мин при 37° С. Затем буфер заменяли буфером, содержавшим пептид cRGD или cRAD (контроль) в количестве 20 мкг/мл, и инкубировали в течение еще 4 часов. Прикрепившиеся клетки объединяли после трипсинизации со свободными клетками, и определяли количество апоптотических клеток путем FACS с использованием анти-аннексин V-FITC антитела и пропидия иодида (набор для определения апоптоза Clontech Apo Alert Annexin V-FITC). Клетки, на которые воздействовали контрольным пептидом cRAD, показали незначительный апоптоз, в то время как клетки DAOY и НВЕС, обработанные cRGD, показали значительный апоптоз (фиг.6d). Эти данные показывают, что пептид cRGD не только открепляет эти клетки от витронектина, но также индуцирует их последующий апоптоз.

Влияние пентапептида на адгезию клеток опухоли головного мозга к различным субстратам ЕСМ

Фиг.7 показывает воздействие циклического пентапептида на адгезию опухолевых клеток к белкам ЕСМ. Нетканевые культуральные планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37°С с витронектином, тенасцином, фибронектином или коллагеном I (10 мкг/мл), затем промывали PBS. После промывания засевали 5× 10⁵ клеток на лунку и инкубировали в течение 16 часов при 37°С. Культуры затем промывали и добавляли адгезионный буфер, содержавший 20 мкг/мл пентапептида или контрольного пептида, и инкубировали еще 2-24 часа. Культуры затем дважды промывали адгезионным буфером и окрашивали кристаллическим фиолетовым и определяли ОП 600. Данные представляют количество прикрепившихся клеток после 8 часов инкубации. U87 = глиобластома и DAOY = медуллобластома.

Как показано на фиг.7, опухолевые клетки откреплялись от витронектина и тенасцина, прикрепление к которым было опосредовано интегринами _V, но не от коллагена и фибронектина, которые взаимодействуют с интегринами, не являющимися интегринами _V. Сходные данные были получены для клеток капилляров головного мозга.

Влияние прикрепления клеток на выживание клеток

Фиг.8 показывает апоптоз клеток опухоли головного мозга и клеток капилляров головного мозга, выросших на ЕСМ и испытавших воздействие пентапептида. Условия эксперимента были такими же, как на фиг.7, за исключением того, что открепившиеся клетки и прикрепившиеся клетки объединяли после трипсинизации. Клетки затем промывали, суспендировали в 50 мкл PBS и центрифугировали на предметных стеклах (цитоспин). После фиксации 4% параформальдегидом клетки окрашивали для определения апоптоза с использованием набора Boehringer Apoptosis Kit. Результаты выражали как процент апоптотических клеток от общего количества клеток. Эксперимент проводили через 24 часа инкубации с пептидами.

Влияние прикрепления клеток на выживание клеток показано на фиг.8. Как можно видеть, клетки, на которые в течение 24 часов воздействовал активный пептид и которые выросли на витронектине или тенасцине, показали возросшее количество мертвых клеток по сравнению с контрольными клетками. Напротив, пентапептид не изменял выживание клеток, выросших на коллагене I или фибронектине. Понижение выживания клеток наблюдалось для обоих типов опухолевых клеток, а также для клеток капилляров головного мозга. Сходные данные были получены, когда клетки окрашивали на ранний маркер гибели клетки, экспрессируемый на поверхности клетки (Armexin-V, данные не показаны). Таким образом, активный пентапептид индуцирует открепление и гибель клеток, как в случае клеток опухоли, так и в случае клеток капилляров головного мозга, которые прикрепляются к витронектину и тенасцину.

Выработка белков ЕСМ в опухоли головного мозга человека

Как указывалось выше, опухоли головного мозга человека вырабатывают витронектин и тенасцин, и полагают, что эти субстраты улучшают выживание опухолевых клеток и усиливают их инвазию. Заявители изучили выработку этих белков на своей модели опухоли головного мозга.

Фиг.9 показывает иммуногистохимию опухолей головного мозга U87, ксенотрансплантированных в передний мозг бестимусных мышей, которых лечили активным (анти- _V) или контрольным пептидом. Мышам инъецировали опухолевые клетки (10⁶ клеток на мышь) и начинали лечение активным или неактивным пептидом (100 мкг на мышь в день) на 7 день после инъекции. Опухоли удаляли через 2 недели лечения, фиксировали в формалине с буфером, заливали в парафин и получали срезы толщиной 5 мкм. Срезы исследовали на экспрессию CD31 (маркера клеток капилляров) с использованием моноклонального антимышиного антитела крысы (Pharmingen), моноклонального мышиного антитела против витронектина человека (Sigma), мышиного антитела против тенасцина человека (Neo-Marker) и набора Boehringer Apoptosis Kit для определения мертвых клеток. CD31 = маркер капилляров, VN = витронектин, TN = тенасцин и АРО = апоптоз.

Как показано на фиг.9, опухоли головного мозга действительно вырабатывали витронектин и тенасцин, и их происхождение из опухолевых клеток было доказано с помощью антител, специфичных в отношении белков человека. Введение активного пентапептида не влияло на синтез этих белков. Помимо этого, заявителям удалось также показать, что клетки опухоли головного мозга вырабатывают эти белки в культуре ткани (данные не показаны). Таким образом, мышиная модель, которую использовали заявители, имитирует ситуацию при опухолях головного мозга человека.

Антиангиогенный эффект пентапептида показан на верхней части фиг.9, где заявители окрашивали срезы ткани для выявления маркера, специфичного для клеток капилляров, а именно, CD 31. В то время как опухоли, леченные контрольным пептидом, имели многочисленные сосуды, которые окрашивались по маркеру положительно, в опухолях, леченных активным пентапептидом, было очень мало таких сосудов (р<0,005), что указывает на подавление роста капилляров. Нижняя часть фиг.9 показывает окрашивание на апоптотические (мертвые) клетки. Этот способ аналогичен способу, описанному для фиг.8. Опухоли, леченные активным пентапептидом, имели достоверно больше мертвых клеток, чем опухоли, леченные контрольным пептидом (р<0,02). Фотографии были сделаны для глиобластомы U87, однако сходные данные были получены и для медуллобластомы DAOY (не показаны).

Отношение гибели клеток и апоптоза опухолевых клеток

Для того чтобы показать, что это увеличение гибели клеток происходит благодаря непосредственному апоптозу опухолевых клеток и не является следствием подавления роста капилляров, заявители имплантировали в головной мозг мышей клетки меланомы, которые экспрессировали (М21 L _V пол.) или не экспрессировали (М21 L _V отр.) интегрины _V. Если мыши, которым трансплантировали _V-положительные клетки и которых лечили активным пентапептидом, выживали дольше, чем мыши, леченные контрольным пептидом, то за это должен отвечать непосредственный апоптоз опухолевых клеток.

Таблица 2 показывает выживание мышей с _{V 3}–отрицательными и _{V 3}-положительными опухолями, леченных RGDfV. Опухолевые клетки (10⁶) инъецировали в передний мозг 6-недельных бестимусных мышей и начинали лечение активным или контрольным пептидом (100 мкг на мышь в день) на 3 день. Мышей умерщвляли до наступления кахексии и верифицировали наличие опухоли при вскрытии.

Таблица 2
Клеточная линия	Выживание (дни)
	RGDfV (активный)	RADfV (контрольный)
M21L V отр.	15,7±3,8	15,3±3,3
M21L4 V пол.	36,5±2,9	17,3±1,9

Как показано в таблице 2, мыши, которым трансплантировали _V-отрицательные клетки меланомы, выживали в течение 15 дней, независимо от проводившегося лечения. Напротив, продолжительность жизни мышей с _V-положительными опухолями возрастала до 36 дней при лечении активным пентапептидом, по сравнению с 17 днями при лечении контрольным пептидом. Это показывает, что непосредственный апоптоз опухолевых клеток должен отвечать за гибель опухолевых клеток.

В заключение, обсужденные выше данные поддерживают гипотезу о том, что циклический пентапептид индуцирует непосредственную гибель опухолевых клеток.

Обсуждение

Опухоли головного мозга являются высоко ангиогенными, и их непрерывный рост зависит от неоваскуляризации. Антиангиогенез, таким образом, является потенциально важной терапевтической стратегией, направленной против этих злокачественных новообразований. Интегрины _{V 3} и _{V 5} являются кандидатами в антиангиогенные мишени, поскольку их экспрессия на эндотелии активируется во время ангиогенеза (12, 13). Их роль в неоваскуляризации была ранее подтверждена исследованиями, которые показали, что индукция ангиогенеза bFGF и TNF-альфа в САМ может быть прервана присутствием антитела LM-609, блокирующего ( _{V 3} или RGD циклического пептидного антагониста _{V 3} и _{V 5} (21, 23). В каждом случае антиангиогенный эффект, как полагают, наблюдается через индукцию апоптоза эндотелиальных клеток в результате предотвращения взаимодействий связывания неотъемлемого белка матрикса _V (28-30). В этом исследовании заявители использовали сходным образом специфичный RGD циклический пептидный антагонист _{V 3} и _{V 5} (EMD 121974) и показали его способность ингибировать САМ ангиогенез, индуцированный двумя клеточными линиями опухолей головного мозга человека, DAOY и U87MG. Лечение cRGD не только подавляло САМ ангиогенез, но впоследствии приводило к некрозу опухоли и инволюции опухоли.

С целью установить, можно ли получить сходные реакции на модели, которая повторяет микроокружение головного мозга, клетки опухоли головного мозга стереотаксически инъецировали в передний мозг бестимусных мышей. Клетки глиомы U87MG и медуллобластомы DAOY были выбраны для этого исследования потому, что их чувствительность к пептиду в исследовании САМ и их распространенная инвазивность и ангиогенез были ранее показаны in vivo (31, 32). На этой ортотопической модели cRGD вновь достоверно ингибировал рост опухолей головного мозга U87MG и DAOY. Контрольные мыши погибли из-за прогрессирования опухолей, и у них были обнаружены высокоинвазивные опухоли среднего размера более 3 мм³ . Мыши, леченные cRGD, выживали без признаков заболеваемости, и жизнеспособные опухоли не были выявлены, кроме скудного остаточного количества клеток в месте имплантации или в малых агрегатах вдоль поверхностей желудочков и твердой мозговой оболочки. Все остаточные опухолевые очаги в группе, получавшей лечение, были менее 1 мм ³ и, следовательно, не требовали реакции ангиогенеза со стороны хозяина. Альтернативные ингибиторы ангиогенеза, такие как тромбоспондин-1, TNP-470 и тробоцитарный фактор 4, также, как было показано, ингибируют рост экспериментальных опухолей головного мозга, хотя большинство этих результатов было ограничено подкожными ксенотрансплантатами или требовали прямой доставки лекарственного средства в ложе опухоли путем стереотаксической инъекции (32-34). Пептидный антагонист _{V 3} на модели подкожной опухоли мышей SCID/клеток Лейдига, как было показано, ингибирует рост опухолей на 80% после его интраперитонеального введения (35). Ангиостатин, антиангиогенный агент с до сих пор неясным механизмом действия, также показал значительное ингибирование роста интракраниальных ксенотрансплантатов крысиной глиомы С6 и 9L (36). В противоположность исследованию заявителей, лечение ангиостатином (1 мг на мышь в день) или пептидомиметическим антагонистом (2 мг на мышь в день) начинали немедленно после имплантации опухолевых клеток. Исследование же заявителей выявило почти полное устранение прижившихся опухолевых ксенотрансплантатов и впервые показало ингибирование интракраниального роста опухолей головного мозга и ангиогенеза через антагонизм в отношении интегринов.

Представляет интерес тот факт, что опухоли DAOY и U87MG, выросшие одновременно под кожей, не показали или показали незначительный эффект лечения cRGD в исследовании заявителей. Это подчеркивает важность внеклеточного окружения в регуляции ответов опухолевая клетка хозяина-интегрин. Ангиостатин, как было установлено, равным образом ингибирует рост п/к и и/к инъецированных клеток опухоли головного мозга, что указывает, что это соединение подавляет ангиогенез посредством механизма, отличающегося от механизма действия RGD пептида (36). Одно возможное объяснение различия в ингибировании роста cRGD заключается в том, что эндотелиальные клетки подкожных структур могут по своей природе отличаться от эндотелиальных клеток микрососудистого русла ЦНС, что делает ангиогенез менее чувствительным к антагонизму в отношении интегринов. Это подтверждается недавним открытием, что у мышей, у которых отсутствует _V, клетки капилляров только головного мозга и кишечника имеют отклонения от нормы, в то время как остальная система кровообращения является интактной (37). Альтернативно, белки матрикса, которые служат лигандами для интегринов эндотелиальных клеток, могут предпочтительно экспрессироваться опухолевыми клетками, в зависимости от ортотопической или гетеротопической локализации. Например, клетки человеческой глиобластомы, имплантированные подкожно, как было установлено, не вырабатывают витронектин, однако их помещение в церебральное микроокружение индуцировало экспрессию ими гена витронектина (15). Нормальная ткань головного мозга может также изменять свою экспрессию белков ЕСМ в ответ на инвазию клеток глиомы (38). В противоположность экстраневральным областям, витронектин в норме отсутствует в головном мозге, и, таким образом, незначительные изменения в концентрации этого белка в пределах ЦНС могут значительно модифицировать клеточные ответы. Исследования показывают, что миграция эндотелиальных клеток зависит от концентрации витронектина и расстояния между точками контактов клеток и матрикса, которые позволяют клеткам распространяться (39, 40).

Антионкогенные эффекты пептида в исследовании заявителей, обычно более выражены по сравнению с теми, которые наблюдаются при использовании других антиангиогенных агентов. Поскольку многие опухоли также экспрессируют интегрины _{V 3} и _{V 5} (включая U87MG и DAOY), эффект антагонистов интегринов может не ограничиваться эндотелием хозяина, хотя важность специфических интегринов для ответов опухолевых клеток менее ясна (41). Ранее проводившиеся исследования показали, что прикрепление клеток глиомы, карциномы молочной железы, меланомы и аденокарциномы толстого кишечника HT29-D4 к витронектину зависит от интегринов _V (42-45). Витронектин вырабатывается опухолевыми и стромальными клетками и в избытке обнаруживается в участках инвазии и неоваскуляризации опухоли, включая злокачественные опухоли головного мозга (46, 47). Таким образом, витронектин, помимо поддержки выживания эндотелиальных клеток, может также играть ключевую роль в усилении адгезии и инвазии опухолевых клеток, которые экспрессируют _{V 3} и _{V 5}. На SCID мышиной/человеческой химерной модели рака молочной железы инвазия опухоли была значительно снижена после введения анти- _{V 3} антитела LM-609, что предполагает прямое воздействие блокады _{V 3} на опухоль, независимо от ангиогенеза (48).

С целью прояснения этого вопроса заявители изучили адгезию и миграцию клеток к витронектину в присутствии антагонистов _V, с использованием клеток DAYO, U87MG и выделенных первичных эндотелиальных клеток головного мозга человека (НВЕС) (49). Анти- _{V 3} антитело LM-609 ингибировало миграцию U87MG, DAYO и НВЕС к витронектину, и в комбинации с анти- _{V 5} антителом P1-F6 ингибировало адгезию этих клеток к витронектину. cRGD в отдельности достоверно ингибировал адгезию и миграцию к витронектину всех трех типов клеток. В подобном исследовании инвазия меланомных клеток усиливалась витронектином и блокировалась RGD пептидами (50). И наконец, лечение cRGD приводило к увеличению апоптоза не только в клетках НВЕС, но также и в опухолевых клетках DAYO и U87MG. Эти результаты предполагают, что cRGD может непосредственно ингибировать инвазию и пролиферацию опухоли, помимо его антиангиогенного эффекта.

Данные заявителей показывают также, что циклический пентапептид может ингибировать адгезию клеток опухоли головного мозга к различным субстратам ЕСМ, таким как витронектин или тенасцин. Эффект такого ингибирования адгезии приводил к гибели клеток (апоптозу) как клеток опухоли головного мозга, так и клеток капилляров головного мозга. Этот эффект ограничивается витронектином и тенасцином ЕСМ. Заявители показали также, что увеличение гибели клеток происходит вследствие непосредственного апоптоза опухолевых клеток и не является следствием подавления роста капилляров. Иными словами, открытием настоящего изобретения является тот факт, что циклический пентапептид индуцирует непосредственную гибель опухолевых клеток.

В целом, настоящее исследование предоставило данные о том, что направленный антагонизм в отношении интегринов, конкретно, _{V 3} и _{V 5}, может значительно ингибировать онкогенез в головном мозге in vivo и может, таким образом, представлять собой важный новый терапевтический подход к лечению опухолей головного мозга. Результаты, полученные заявителями, также предполагают, что микроокружение играет ключевую роль в поведении опухолей и в определении их чувствительности к таким биологически направленным лекарственным средствам. И наконец, заявители показали, что антагонизм в отношении интегринов может оказывать антионкогенное действие независимо от антиангиогенеза, который может действовать синергически для задержки опухолевого роста.

Описанные ранее сведения предназначены для иллюстрации без ограничения объема настоящего изобретения. Разумеется, специалист может легко увидеть и разработать дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения на основе идей, представленных в настоящем документе, без излишнего экспериментирования.

ЛИТЕРАТУРА

1. Folkman, J., The role of angiogenesis in tumor growth, Sem. Cancer Biol., 3:65-71,1992.

2. Plate, К.Н., Risau, W., Angiogenesis in malignant gliomas, Glia., 15:339-347, 1995.

3. Folkman, J., Watson, К., Ingber, D., Hanahan, D., Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia neoplasia, Nature, 339:58-61,1989.

4. Chan, A.S., Leunng, S.Y., Wong, M.P., Yuen, S.T., Cheung, N., Fan, Y.W., Chung, L.P., Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in the anaplastic progression of astrocytoma, oligodendroglioma, and ependymoma, Am. J. Surg. Pathol., 22:816-826,1998.

5. Takano, S., Yoshii, Y., Kondo, S., Suzuki, H., Maruno, Т., Shirai, S., Nose, Т., Concentration of vascular endothelial growth factor in the serum and tumor tissue of brain tumor patients. Cower Res., 56:2185-2190,1996.

6. Brem, S., Tsanaclis, A.M., Gately, S., Gross, J.L., Herblin, W.F., Immunolocalization of basic fibroblast growth factor to the microvasculature of human brain tumors. Cancer, 70:2673-2680,1992.

7. Li,V.W., Folkerth, R.D., Watanabe, H., Yu, C., Rupnick, M., Barnes, P., Scott, R.M., Black, P.M., Sallan, S., Folkman, J., Microvessel count and cerebrospinal fluid basic fibroblast growth factor in children with brain tumors, Lacet, 344:82-86,1994.

8. Abulrauf, S.L, Edvardsen, К., Но K.L., Yang, X.Y., Rock, J.P., Rosenblum. M.L., Vascular endothelial growth factor expression and vascular density as prognostic markers of survival in patients with low-grade astrocytoma, J. Neurosvrg., 88:513-520, 1998.

9. Leon, S.P., Folkerth, R.D., Black, P.M., Microvessel density is a prognostic indicator for patients with astroglial brain tumors. Cancer, 77:362-372, 1996.

10. Hynes, R.O., Integrins: a family of cell surface receptor. Cell, 48:455-459, 1987.

11. Rusnati, M., Tanghetti, E., Dell’Era, P., Gualandris, A., Presta, M., Alphavbeta3 integrin mediates the cell-adhesive capacity and biological activity of basic fibroblast growth factor (FGF-2) in cultured endothelial cells, Mol. Biol. Cell, 8:2449-2461, 1997.

12. Varner, J.A., The role of vascular cell integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 in angiogennesis, EXS, 79:361-390, 1997.

13. Friedlander, M., Brooks, P.C., Shaffer, R.W., Kincaid, C.M., Varner, J.A., Cheresh, D.A., Definition of two angiogenic pathways by distinct alphav integrins. Science, 270:1500-1502, 1995.

14. Gladson, G.L., Expression of integrin alpha v beta 3 in small blood vessels of glioblastoma tumors, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55:1143-1149, 1996.

15. Gladson, C.L., Wilcox, J.N., Sanders, L., Gillespie, G.Y., Cheresh, D.A., Cerebral microenvironment influences expression of the vitronectin gene in astrocytic tumors, J. Cell Sci., 108:947-956,1995.

16. Longhurst, C.M., Jennings, L.K., lntegrin-mediated signal transduction. Cell Mol. Life Sci., 54:514-526, 1998.

17. Howe, A., Aplin, A.E., Alahari, S.K.. Juliano, R.L., Integrin signaling and cell growth control, Curr. Opin. Cell Biol., 10:220-231, 1998.

18. Malik, R.K., Regulation of apoptosis by integrin receptors, J. Pediatr. Hematol. Oncol 19:541-545, 1997.

19. Scatena, M.. Almeida, M., Chisson, M.L., Fausto, N., Nicosia, R.F., Giachelli, C.M., NF-kappaB mediates alphavbeta3 integrin-induced endothelial cell survival, J. Cell Biol., 141-1083-1093, 1998.

20. Gladson, C.L., Cheresh, D.A., Glioblastoma expression of vitronectin and the avb3 integrin. Adhesion mechanism for transformed glial cells, J. Clin. Invest., 88:1924-1932, 1991.

21. Brooks, P.C., Clark, R.A., Cheresh, D.A., Requirement of vascular integrin alpha v beta 3 for angiogenesis. Science, 264:569-571, 1994.

22. Christofidou-Solomidou, M., Bridges, M., Murphy, G.F., Abelda, S.M, DeLisser, HM., Expression and function of endothelial cell av integrin receptors in wound-induced human angiogenesis in human skin/SCID mice chimeras. Am. J.Pathol., 151:975-983, 1997.

23. Brooks, P.C., Montgomery, A.M., Rosenfeld, M., Reisfeld, R.A., Нu, Т.. Klier, G., Cheresh, D.A., Integrin avb3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels, Cell, 79:1157-1164, 1994.

24. Molema, G., Griffioen, A.W., Rocking the foundations of solid tumor growth by attacking the tumor's blood supply, Immunol. Today, 19:392-394, 1998.

25. Kim, K.J., Li, В., Winer, J., Armanini, M., Gillett, N., Phillips, H.S., Ferrara, N., Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo, Nature, 362-841-844, 1993.

26. Re, F., Zanetti, A., Sironi, M., Polentarutti, N., Lanfrancone, L., Dejana, E., Colotta, F., Inhibition of anchorage-dependent cell spreading triggers apoptosis in cultured human endothelial cells, J. Cell Biol., 127:537-546, 1994.

27. Montgomery, А.М., Reisfffeld, R.A., Cheresh, D.A., Integrin avb3 rescues melanoma cells. from apoptosis in three-dimensional dermal collagen, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:8856-8860, 1994.

28. Isik, F.F., Gibran, N.S., Jang. Y., Sandell, L., Schwartz, S.M., Vitronectin decreases microvascular endothelial cell apoptosis, J. Cell Physiol., 173:149-155, 1998.

29. Germer, M., Kanse, S.M., Kirkegaard, Т., Kioler, L., Feldinng-Habermann, В., Goodman, S., Preissner, Т., Kinetic analysis of integrin-dependent cell adhesion on vitronectin. The inhibitory potential of plasminogen activator inhibitor-1 and RGD peptides, Eur. J. Biochem., 253:669-674, 1998.

30. Ruoslahti, E., Reed, J.C., Anchorage dependence, integrins, and apoptosis. Cell, 77:477-478, 1994.

31. MacDonald, T.J., Tabrizi, P., Shimada, H., Zlokovic, B.V., Laug, W.E., Detection of brain tumor invasion and micrometastasis in vivo by expression of enhanced green fluorescent protein, Neurosurgery, 43:1437-1443, 1998.

32. Hsu, S.C., Volpert, O.V., Steck, P.A., Mikkelsen, Т., Polverini, P.J., Rao, S., Chou Bouck, N.P., Inhibition of angiogenesis in human glioblastomas by chromosome 10 induction of throbospondin-1, Cancer Res., 56:5684-5691, 1996.

33. Таki, Т., Ohnishi, Т., Arita, N., Hiraga, S., Saitoh, Y., Izumoto, S., Mori, K., Hayakawa, Т., Anti-proliferative effects of TNnP-470 on human malignant glioma in vivo: potent inhibition of tumor angiogenesis, J. Neurooncoi, 19:251-258, 1994.

34. Tanaka, Т., Manome, Y., Wen, P., Kufe, D.W., Fine, H.A., Viral vector-mediated transduction of a modified platelet factor 4 cDNA inhibits angiogenesis and tumor growth, Nat. Med., 3:437-442, 1997.

35. Carron, C.P., Meyer, D.M., Pegg, J.A., Engleman, V.W., Nickols, M.A., Settlel, S.L., Westlin, W.F., Ruminski, P.G., Nickols, G.A., A peptidomimetic antagonist of the integrin avb3 inhibits Leydig cell tumor growth and the development of hypercalcemia of malignancy. Cancer Res., 58:1930-1935, 1998.

36. Kirsch, M., Strasser, J., Allende, R., Bello, L., Zhang, J., Black, P.M., Angiostatin suppresses malignant glioma growth in vivo, Cancer Res., 58:4654-4659, 1998.

37. Bader, B.L., Rayburn, H., Crowley, D., Hynes, R.O., Extensive vasculogenesis, angiogenesis, and organogenesis precede lethality in mice lacking all av integrins. Cell, 95:507-519, 1998.

38. Knott, J.C., Mahesparan, R., Garcia-Cabrera, I., Bolge, T.B., Edvardsen, K., Ness, G.O., Mark, S., Lund-Johansen, M., Bjerkvig, R., Stimulation of extracellular matric components in the normal brain by invading glioma cells, Int. J. Cancer, 75:864-872, 1998.

39. Seger, D., Gechtman, Z., Shaltiel, S., Phosphorylation of vitronectin by casein kinase II. Identification of the sites and their promotion of cell adhesion and spreading, J. Biol. Chem., 273:24805-24813, 1998.

40. Woodard, A., Garcia-Cardera, G., Leong, M., Madri, J., Sessa, W., Languino, L., The synergistic activity of alphavb3 integrin and PDGF receptor increases cell migration, J. Cell Sci., 111:469-478, 1998.

41. Sanders, R.J., Mainiero, F., Giancotti, F.G., The role of integrins in tumorigenesis and metastasis. Cancer Invest., 16:329-344, 1998.

42. Treasurywala, S., Berens, M.E., Migration arrest in glioma cells is dependent on the alpha-v integrin subunit, Glia., 24:236-243, 1998.

43. Won, N.C., Mueller, B.M., Barbas, C.F., Ruminski, P., Quaranta, V., Lin, B.C., Smith, J.W., Alpha-v integrins mediate adhesion and migration of breast carcinoma cell lines, Clin. Exp. Metastasis, 16:50-61, 1998.

44. Van Leeuwen, R.L., Yoshinaga, I.G., Akasaka, Т., Dekker, S.K., Vermeer, BJ., Byers, Н.R., Attachment, spreading and migration of melanoma cells on vitronectin. The role of alpha v beta 3 and alpha v beta 5 integrins, Exp. Dermatol., 5:308-315, 1996.

45. Lehmann, M., El Battari, A., Abadie, В., Martin, J.M., Marvallldi, J., Role of alpha v beta 5 and alpha v beta 6 integrin glycosylation in the adhesion of a colonic adenocarcinoma cell line (HT29-D4), J. Cell Biochem., 61:266-277, 1996.

46. Kost, С., Benner, К., Stockmann, A., Under, D., Preissner, K.T., Limited plasmin proteolysis of vitronectin. Characterization of the adhesion protein as morpho-regulatory and angiostarin binding factor. Еur. J. Biochem., 236:682-688, 1996.

47. Maenpaa, A., Kovanen, P.E., Paetau, A., Jaaskelainen, J., Timonen, Т., Lymphocyte adhesion molecule ligands and extracellular matrix proteins in gliomas and normal brain: expression of VCAM-1 in gliomas, Acta. Neuropathol., 94:216-225, 1997.

48. Brooks, P.C., Stromblad, S., Klemke, R., Visscher, D., Sarkar, F.H., Cheresh, D.A., Anti-integrin alpha v beta 3 blocks human breast cancer growth and angiogenesis in human skin, J. Clin. Invest., 96:1815-1822, 1995.

49. Stins, M.F., Gillesl, F., Kim, K.S., Selective expression of adhesion molecules on human brain microvascular endothelial cells, J. Neuroimmunol., 76:81-90, 1997.

50. Bafetti, L.M., Young, T.N., Itoh, Y., Stack, M.S., Intact vitronectin induces matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 expression and enhanced cellular invasion by melanoma cells, J. Biol. Chem., 273:143-149, 1998.

51. Wong, N.C., Mueller, B.M., Barbas, C.F., Ruminski, P., Quaranta, V., Lin, E.C., Smith, J.W., Alphav integrins mediate adhesion and migration of breast carcinoma cell lines, Clin. Exp. Metastasis, 16:50-61, 1998.

52. Van Leeuwen, R.L., Yoshinaga, I.G., Akasaka, Т., Dekker, S.K., Vermeer, B.J., Byers, H.R., Attachment, spreading and migration of melanoma cells on vitronectin. The role of alpha v beta 3 and alpha v beta 5 integrins, Exp. Dermatol., 5:308-315, 1996.

53. Lehmann, M., El Battari, A., Abadie, В., Martin, J.M., Marvaldi, J., Role of alpha v beta 5 and alpha v beta 6 integrin glycosylation in the adhesion of a colonic adenocarcinoma cell line (HT29-D4), J. Cell Biochem., 61:266-277, 1996.

54. Gladson, C.L., Cheresh, D-A., Glioblastoma expression of vitronectin and the integrin, J. Clin. Invest., 88:1924-1932, 1991.

55. Jaskiewicz, К., Chasen, M.R., Robson, S.C., Differential expression of extracellular matrix proteins and integrins in hepatocellular carcinoma and chronic liver disease, Anticancer Res., 13:2229-2237, 1993.

56. Brooks, P.C., Stromblad, S., Klemke, R., Visseher, D., Sarkar, F.H., Cheresh, D.A., Anti-integrin alpha v beta 3 blocks human breast cancer growth and angiogenesis in human skin, J. Clin. Invest., 96:1815-1822, 1995.

57. Leon, S.P., Folkerth, RD., Black, P.M., Microvessel density is a prognostic indicator for patients with astroglial brain tumors, Cancer, 77:362-372, 1996.

58. Wesseling, P., Van Der Laak, J.A., Link, M., Teepen, H.L., Ruiter, D.J., Quantitative analysis ofmicrovascular changes in diffuse astrocytic neoplasms with increasing grade of malignancy. Hum. Pathol; 29:352-358, 1998.

59. Li, V.W., Folkerth, R.D., Watanabe, H., Yu, C., Rupnick, M., Bames, P., Scott, M., Black, P.M., Sallan, S., Folkman, J., Microvessel count and cerebrospinal fluid basic fibroblast growth factor in children with brain tumors. Lancet, 344:82-86, 1994.

60. Taki, Т., Ohnishi, Т., Arita, N.. Hiraga, S., Saitoh, Y., Izumoto, S., Mori, K., Hayakawa, Т., Anti-proliferative effects of TNP-470 on human malignant glioma in vivo: potent inhibition of tumor angiogenesis, J. Neurooncol, 19:251-258, 1994.

61. Hsu, S.C., Volpert, O.V., Steck, P.A., Mikkelsen, Т., Polverini, P.J., Rao, S., Chou Bouck, N.P., Inhibition of angiogenesis in human glioblastomas by chromosome 10 induction of thrombospondin-1. Cancer Res., 56:5684-5691, 1996.

62. Tanaka, Т., Manome, Y., Wen, P., Kufe, D.W., Fine, H.A., Viral vector-mediated transduction of a modified platelet factor 4 CDNA inhibits angiogenesis and tumor growth, Nat. Med., 3:437-442, 1997.