3-метиленстероидные производные, фармацевтическая композиция, способ лечения

Формула изобретения

1. 3-Метиленстероидное производное, имеющее общую формулу 1

Формула 1

в которой

R¹ представляет Н или вместе с R³ образует -эпоксид, либо R¹ отсутствует при наличии 5-10 двойной связи;

R² представляет (С₁-С₅ )алкил;

R³ представляет H, CН ₃ или вместе с R¹ образует -эпоксид, либо R³ отсутствует при наличии 5-10 двойной связи;

R⁴ представляет Н, низший алкил;

Y представляет [Н, Н] [ОН, Н], [ОН, (С₂-С₅) алкенил], [ОН, (С₂-С₅)алкинил] или (C₁ -C₆) алкилиден; либо =NOR⁵, в котором R ⁵ представляет Н, низший алкил;

пунктирные линии представляют необязательную двойную связь;

при условии, что 3-метиленстероидное производное не является ни одним из следующих соединений: (7, 17)-7-метил-3-метилен-4-эстрен-17-ол, (7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-4-ен-17-ол, (7, 17)-7-метил-3-метилен-19,21 -динорпрегн-4-ен-17-ол, (7)-17-кето-7-метил-3-метилен-4-эстрен, (7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-4-ен-20-ин-17-ол, 17-гидрокси-7-метил-3-метилен-17-(2-пропенил)-4-эстрен и 17-гидрокси-7-метил-3-метилен-17-(2 метил-2пропенил)-4-эстрен.

2. 3-Метиленстероидное производное по п.1, отличающееся тем, что указанное 3-метиленстероидное производное имеет 5-10 двойную связь, a R¹ и R³ отсутствуют.

3. 3-Метиленстероидное производное, выбранное из группы, состоящей из:

(7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-5(10)-ен-20-ин-17-ола;

(7,17)-7-метил-3-метиленэср-5(10)-ен-17-ола

(5, 7, 17)-5,10-эпокси-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-20-ин-17-ола

(5, 7, 17)-5,10-эпокси-7-метил-3-метиленэстран-17-ола

(5, 7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-20-ен-17-ола

(5, 7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-20-ин-17-ола

(5, 7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегнан-17-ола

(7)-7-метил-3,17-диметиленэстр-5(10)-ена

(7, 16, 17)-7,16-диметил-3-метилен-17-(1-пропинил)эстр-5-(10)-ен-17-ола

(7, 16, 17)-16-этил-7-метил-3-метилен-17-(1-пропинил)эстр-5(10)-ен-17-ола

(7, 17)-7-метил-3-метилен-17-(1-пропинил)эстр-5(10)-ен-17-ола

(7, 16, 17)-16-этил-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-5(10)-ен-20-ин-17-ола

(7)-3-метилен-7-метилэстр-5(10)-ена

(7)-3-метилен-7-метилэстр-5(10)-ен-17-он O-метилоксима

(7)-3-метилен-7-метилэстр-5(10)-ен-17-он оксима

4. 3-Метиленстероидное производное (7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-5(10)-ен-20-ин-17-ол.

5. 3-Метиленстероидное производное по любому из пп.1-4 в качестве лекарственного препарата.

6. 3-Метиленстероидное производное по любому из пп.1-4, для получения лекарственного препарата, предназначенного для лечения и/или профилактики артритов и/или аутоимунных заболеваний.

7. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики артритов и/или аутоимунных заболеваний, включающая 3-метиленстероидное производное по пп.1-3 или его фармацевтически приемлемую соль, или сольват в смеси с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.

8. Способ лечения и/или предупреждения артритов и/или аутоиммунных заболеваний путем введения 3-метиленстероидного производного по п.6 пациенту, нуждающемуся в таком лечении или предупреждении.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к новым 3-метиленстероидным производным, оказывающим терапевтическое действие, а также к получению фармацевтических препаратов, включающих 3-алкилиденовый стероид.

Стероиды с метиленовыми заместителями в положении 3 стероидного скелета и 1-2 или 4-5 двойными связями известны и заявлены как полезные для терапевтического применения (BE 696235 и BE 654772, соответственно). Предлагаемое медицинское назначение включает анаболическое, эстрогенное и гестагенное действие. Ни одно из указанных соединений не было использовано ни по такому назначению, ни в качестве лекарственных препаратов в других областях, несмотря на то, что лечение многих заболеваний доступными в настоящее время лекарственными средствами все еще остается неудовлетворительным. Следует отметить, что заболевания иммунной системы, такие как ревматоидный артрит и аутоиммунные заболевания, нуждаются в лучших лекарственных препаратах. Иногда для лечения указанных заболеваний применяют кортикостероидные средства, однако необходимы улучшения как относительно эффективности, так и относительно количества или тяжести побочных эффектов.

Данное изобретение предусматривает 3-метиленстероидные производные и их пролекарства, при этом указанные стероидные производные имеют общую формулу 1

в которой R¹ представляет Н или вместе с R ³ образует -эпоксид, либо R¹ отсутствует при наличии 5-10 или 4-5 двойной связи;

R² представляет (C₁-C ₅) алкил или СF₃;

R³ представляет Н, СН ₃ или вместе с R¹ образует -эпоксид, либо R³ отсутствует при наличии 5-10 двойной связи;

R⁴ представляет Н, низший алкил;

Y представляет [Н, Н] [ОН, Н], =O, [ОН, низший алкил], [ОН, (C₂-C ₅) алкенил], [ОН, (C₂-C₅) алкинил] или (C₁-С₆) алкилиден, при этом указанный алкил, алкенил, алкинил и алкилиден необязательно галогенирован; либо =NOR⁵, в котором R⁵ представляет Н, низший алкил.

Пунктирные линии представляют необязательную двойную связь.

Предпочтительными соединениями в соответствии с настоящим изобретением являются такие соединения, в которых R⁴ представляет Н, а Y представляет [ОН, Н], =O, [ОН, низший алкил], [ОН, (С₂-С₅) алкенил], [ОН, (С₂-С₅) алкинил] или (C₁-C ₆) алкилиден, при этом указанный алкил, алкенил, алкинил и алкилиден могут быть необязательно галогенированы.

В данном описании термины имеют следующее значение.

Низший алкил означает разветвленную или неразветвленную алкильную группу, имеющую предпочтительно 1-6 атомов углерода, такую как гексил, изобутил, третичный бутил, пропил, изопропил, этил и метил. Наиболее предпочтительными являются алкильные группы, имеющие 1-3 атома углерода.

(C₁-C₅)алкил означает разветвленную или неразветвленную алкильную группу, имеющую 1-5 атомов углерода, например, метил, этил, изопропил, бутил, втор-бутил, трет-бутил и т.д. Предпочтительными являются алкильные группы, имеющие 1-3 атома углерода.

(C₂-C₅)алкенил означает разветвленную или неразветвленную алкенильную группу, имеющую от 2 до 5 атомов углерода, такую как этенил, 2-бутенил и т.д. Предпочтительными являются алкенильные группы, имеющие 2-3 атома углерода.

(С₂-С₅) алкинил означает разветвленную или неразветвленную группу, имеющую 2-5 атомов углерода, такую как этинил, пропинил и т.д. Предпочтительными являются алкинильные группы, имеющие 2-3 атома углерода.

(C₁-C₅)алкилиден означает разветвленную или неразветвленную акилиденовую группу, имеющую 1-5 атомов углерода, такую как метенил, бутилиден и т.д. Предпочтительными являются алкилиденовые группы, имеющие 2-3 атома углерода.

Галоген означает фтор, хлор, бром и йод.

Пролекарства представляют собой соединения, предназначенные для образования соединения в соответствии с данным изобретением в организме реципиента с целью лечения. В целом, такие пролекарства могут представлять сложные или простые эфиры 17-гидроксильной функциональной группы.

Предпочтительный вариант осуществления данного изобретения относится к вышеописанному соединению, имеющему 5-10 двойную связь. Наиболее предпочтительным является соединение (7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-5(10)-ен-20-ин-17-ол. Из данного изобретения исключены следующие соединения: (7, 17)-7-метил-3-метилен-4-эстрен-17-ол, (7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-4-ен-17-ол, (7,17)-7-метил-3-метилен-19,21-динорпрегн-4-ен-17-ол, (7)-17-кето-7-метил-3-метилен-4-эстрен, (7, 17)-метил-3-метилен-19-норпрегн-4-ен-20-ин-17-ол, 17-гидрокси-7-метил-3-метилен-17-пропен-2-ил-4-эстрен и 17-гидрокси-7-метил-3-метилен-17-бутен-2-ил-4-эстрен. Вышеприведенные исключения связаны с описаниями, представленными в BE 696235.

Эпоксидные соединения (R₁ и R ₃ вместе образуют -O-) в соответствии с данным изобретением могут быть получены окислением соединения, имеющего формулу 2, в которой символы имеют вышеуказанные значения, с метахлорпероксибензойной кислотой

3-Метиленовая группа в соединении в соответствии с настоящим изобретением может быть получена в результате осуществления реакции Виттига (Wittig) с применением бромида метилтрифенилфосфония и трет-бутоксида калия с соответствующими 3-кето-стероидными предшественниками, характеризуемыми формулой 3, в которой Y ² имеет такие же значения, как и приведенный выше Y, за исключением =O, а остальные символы имеют вышеуказанные значения.

17-Алкилиденовые соединения в соответствии с данным изобретением могут быть получены в результате осуществления реакции Виттига производного 3-кеталя 17-кетопроизводного согласно формуле 4, в которой символы имеют вышеуказанные значения, с бромидом алкилтрифенилфосфония с последующим гидролизом функции 3-кеталя. Соединения, в которых Y=Н, а Н находится в положении 17 (формула 2), в соответствии с данным изобретением могут быть получены восстановлением Вольфа-Кишнера (Wolff-Kishner) 17-кето остатка соединения 3-кеталя формулы 4, в которой символы имеют вышеприведенные значения. Производные 17-оксима в соответствии с данным изобретением могут быть получены конденсацией 17-кето функции (формула 4) с производными гидроксиламина. 16-Алкильное соединение в соответствии с данным изобретением может быть получено алкилированием положения 16 17-кетосоединения (Y=O, формула 4).

Вышеуказанные реагенты для преобразования исходных соединений и способы их взаимодействия с соединениями известны в данной области, однако до сих пор их не применяли к группе соединений, образуемых для получения соединений в соответствии с данным изобретением. Исходные материалы могут быть получены способами, описанными в литературе. Особенно близкой публикацией является Van Vliet et al. Reel. Trav. Chim. Pays-Bas; EN; 105; 4; 1986; 111-115, включенная в данное описание в качестве ссылки. Следует отметить, что в ней описано возможное получение 17-алкил-З-кетопроизводных в соответствии с формулой 3, в которой Y² представляет [ОН, низший алкил], а другие символы имеют вышеуказанные значения, каталитической гидрогенизацией, например, с применением PtO ₂/H₂, соединения в соответствии с формулой 3, в которой Y² представляет [ОН, алкенил] или [ОН, алкинил], а другие символы имеют вышеуказанные значения.

Производные в соответствии с формулой 5 могут быть получены путем очистки из смеси соединений, образующихся после восстановления Бирча (Birch) производного 4-ен-3-она в соответствии с формулой 6, при этом как в формуле 5, так и в формуле 6 символы имеют вышеуказанные значения.

Производное 4-ен-3-она в соответствии с формулой 6, в которой R³ представляет Н, а другие символы имеют вышеуказанные значения, может быть получено из соединения в соответствии с формулой 7 путем изомеризацией двойных связей (в соответствии со способом, описанным van Vliet et al., 1986).

Производное 4-ен-3-она в соответствии с формулой 6, в которой R³ представляет метил, а другие символы имеют вышеуказанные значения, может быть получено в соответствии со способами, описанными в публикации Grunwell et al.; Steroids, Vol.27, pages 759-771, 1976, приводимой здесь в качестве ссылки.

Дальнейшие способы получения соединений в соответствии с формулой 7 в качестве исходного материала описаны van Vliet et al., 1986.

Применение соединений, определяемых формулой 1, предназначено для иммуномодуляции у млекопитающих. Соединение в соответствии с данным изобретением может быть, в частности, использовано для лечения артритов, таких как ревматоидный артрит (RA), и аутоиммунных заболеваний (AIDs), таких как синдром Шегрена и системная красная волчанка (SLE). Оно также может быть использовано для профилактики заболеваний. Более того, соединение в соответствии с данным изобретением может быть использовано для получения лекарственных препаратов, включающих соединение в соответствии с данным изобретением в качестве активного ингредиента.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей стероидное соединение в соответствии с данным изобретением, смешанное с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, например, описанными в стандартной ссылке Gennaro et al., Remmington's Pharmaceutical Sciences (18^th ed., Mack publishing Company, 1990, см. в частности Part 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture). Смесь одного или нескольких стероидных соединений в соответствии с данным изобретением и одного или нескольких фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ может быть спрессована в твердые лекарственные формы, такие как пилюли, таблетки, либо обработана для получения капсул или суппозиториев. При использовании фармацевтически подходящих жидкостей данные соединения также могут применяться как препарат для инъекций в виде раствора, суспензии, эмульсии или аэрозоля, например, назального аэрозоля. Для получения лекарственных форм, например, таблеток, применяют известные добавки, такие как наполнители, красители, полимерные связующие и т.п. В целом, может быть использована любая фармацевтически приемлемая добавка, не влияющая на функцию активного соединения. Стероидные соединения в соответствии с данным изобретением также могут быть включены в имплантат, накладку, гель и любые другие препараты с пролонгированным высвобождением.

Подходящие носители, с которыми могут быть введены композиции, включают лактозу, крахмал, производные целлюлозы и т.п., либо их смеси, применяемые в подходящем количестве.

Другой аспект изобретения относится к применению стероидного соединения в соответствии с данным изобретением для получения лекарственного препарата, предназначенного для модуляции иммунной системы млекопитающего. Более конкретно, изобретение относится к применению стероидного соединения в соответствии с данным изобретением для получения лекарственного препарата, предназначенного для лечения артритов, таких как ревматоидный артрит (RA), и аутоиммунных заболеваний (AIDs), таких как синдром Шегрена и системная красная волчанка (SLE). Данные лекарственные препараты могут также быть использованы для профилактики указанных заболеваний. Лекарственному средству предпочтительно придают подходящую форму, в частности, для лечения людей, удовлетворяющую требованиям медицинских властей в различных странах. Применение 3-метиленстероидных производных, таких как (7, 17)-7-метил-3-метилен-4-эстрен-17-ол, (7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-4-ен-17-ол, (7-17)-7-метил-3-метилен-19,21-динорпрегн-4-ен-17-ол, (7)-17-кето-7-метил-3-метилен-4-эстрен, (7,17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-4-ен-20-ин-17-ол, 17-гидрокси-7-метил-3-метилен-17-пропен-2-ил-4-эстрен и 17-гидрокси-7-метил-3-метилен-17, -бутен-2-ил-4-эстрен, входит в объем настоящего изобретения.

Далее данное изобретение относится к лечению артритов, таких как ревматоидный артрит (RA), и аутоиммунных заболеваний (AIDs), таких как синдром Шергена и системная красная волчанка (SLE), включающему введение пациенту вышеописанного соединения (в виде подходящей фармацевтической лекарственной формы).

Доза данных стероидов находится в пределах от 0,001 до 100 мг на одно введение пациенту, нуждающемуся в лечении. Следовательно, лекарственные единицы для практического применения соединения в соответствии с настоящим изобретением могут содержать количество активного ингредиента в интервале, составляющем от 0,001 до 100 мг.

Иммуномодулирующие свойства соединения в соответствии с данным изобретением могут быть продемонстрированы и использованы в следующих методиках.

При осуществлении аллергической реакции замедленного типа (DTH) действие соединения на развитие иммунной реакции может быть прослежено на примере мышей (подробности приведены в примере 16). Вкратце, соединение вводят ежедневно, а затем животных иммунизируют антигеном в адъюванте. Через 7 дней животных стимулируют локально местной инъекцией антигена (в основном, в ступню), измеряя образующуюся впоследствии местную опухоль в ответ на введение антигена. Степень данного опухания связана с развитием иммунного ответа против провоцирующего антигена. Ингибирующее действие соединения в соответствии с настоящим изобретением на развитие данной опухоли может быть установлено путем сравнения групп, получавших соединение и плацебо. В качестве сравнения может быть использовано введение глюкокортикоидов.

Действие соединения в соответствии с данным изобретением также исследуют на мышах с артритом.

Согласно такому методу мышей иммунизируют коллагеном типа II, в основном из бычьего хряща, в адъюванте. Через три недели вводят вспомогательное средство для набухания (бустер) с таким же антигеном. Приблизительно через 7-10 дней после бустерной реакции можно наблюдать отек суставов (особенно на задней и передней стопах). Такая опухоль быстро увеличивается, вызывая покраснение, воспаление и патологическое изменение нормальной функции. Рентгеновское исследование выявляет искажение нормальной формы суставов. Гистологическое исследование данных суставов выявляет тяжелое воспаление, приводящее к искажению нормальной формы суставов. Степень наблюдаемых изменений может быть классифицирована; более того, степень гистологических изменений может быть также классифицирована.

Далее, действие соединения в соответствии с данным изобретением может быть исследовано на примере не тучных мышей с диабетом (NOD).

Согласно такому методу у мышей спонтанно и постепенно развивают аутоиммунные заболевания с симптомами, напоминающими симптомы инсулинзависимого сахарного диабета (IDDM) человека и синдрома Шегрена. Синдром Шегрена характеризуется развитием инфильтратов в слюнной и слезной железах. У не тучных мышей постепенным развитием инфильтратов характеризуется особенно слюнная железа. Соединение в соответствии с данным изобретением в зависимости от дозы ингибирует развитие таких инфильтратов в поднижнечелюстной железе.

Инсулинзависимый сахарный диабет характеризуется развитием инфильтратов в поджелудочной железе, приводящих к разрушению островков Лангерганса, вырабатывающих инсулин. После постепенного разрушения всех таких островков инсулин больше не вырабатывается, что приводит к развитию IDDM.

Следующие примеры иллюстрируют данное изобретение.

Пример 1

Получение (7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-5(10)-ен-20-ин-17-ола

Бромид метилтрифенилфосфония (26,4 г, 73,9 ммол.) добавляют к перемешиваемому раствору трет-бутоксида калия (7,9 г, 70,4 ммол.) в 130 мл сухого ТГФ в атмосфере азота. Желтую суспензию перемешивают в течение 45 минут при комнатной температуре. К суспензии быстро (приблизительно в течение 30 сек) добавляют раствор 20 г, 64 ммол. тиболона в 200 мл сухого ТГФ, что приводит к небольшой экзотермической реакции (от 20 до 33°С). Желтую реакционную смесь перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре, выливают в ледяную воду (700 мл) и экстрагируют этилацетатом (700 мл). Органический слой промывают водой (300 мл), сушат (Na₂SO₄) и упаривают досуха, получая 41,8 г желтого масла. В результате колоночной хроматографии с применением толуола/этилацетата 95/5 (об./об.%) в качестве элюента получают бесцветное масло, содержащее приблизительно 90% (7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-5(10)-ен-20-ин-17-ола и 10% изомерного ⁴ производного. В результате перекристаллизации (3 раза) с применением гептана/петролейного эфира в качестве растворителя получают указанное в заголовке соединение (6,44 г, выход 32%) в виде белого твердого вещества, т.пл. 91,6°С.

Пример 2

Получение (7, 17)-7-метил-3-метиленэстр-5(10)-ен-17-ола

Бромид метилтрифенилфосфония (4,21 г, 11,8 ммол.) добавляют к перемешиваемому раствору трет-бутоксида калия (1,26 г, 11,2 ммол.) в 20 мл сухого ТГФ в атмосфере азота. Желтую суспензию перемешивают в течение 45 минут при комнатной температуре. К суспензии быстро добавляют раствор (7, 17)-7-метил-3-кето-эстр-5(10)-ен-17-ола (3,4 г, 11,8 ммол.) в 25 мл сухого ТГФ. Желтую реакционную смесь перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре, выливают в ледяную воду и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают водой, сушат (Na₂SO₄) и упаривают досуха, получая 5,3 г указанного в заголовке соединения в виде желтого масла. В результаты колоночной хроматографии с применением толуола/этилацетата (об./об.%) в качестве элюента получают 2,3 г бесцветного масла. В результате кристаллизации с применением гептана/петролейного эфира получают (7, 17)-7-метил-3-метиленэстр-5(10)-ен-17-ол (1,47 г, 44%) в виде белого твердого вещества, т.пл. 111,8°С.

Пример 3

Получение (5, 7, 17)-5,10-эпокси-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-20-ин-17-ола

Соединение (7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-5(10)-ен-20-ин-17-ол (390 мг, 1,26 ммол.), полученное в соответствии с примером 1, перемешивают в 15 мл сухого дихлорметана в атмосфере азота. Раствор охлаждают до 0°С и добавляют мета-хлорпероксибензойную кислоту (1,26 ммол., 310 мг 70% mcpba). Реакционную смесь перемешивают в течение 2 часов при 0°С, промывают насыщенным раствором тиосульфата натрия, насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида натрия, сушат (Na₂SO ₄) и упаривают досуха, получая 450 мг сырого (5, 7, 17)-5,10-эпокси-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-20-ин-17-ола. В результате колоночной хроматографии с применением гептана/этилацетата 95/5 (об./об.%) в качестве элюента получают указанное в заголовке соединение (150 мг, 37%) в виде пены.

Пример 4

Получение (5, 7, 17)-5,10-эпокси-7-метил-3-метиленэстран-17-ола

Соединение (7, 17)-7-метил-3-метиленэстр-5-(10)-ен-17-ол (350 мг, 1,22 ммол.), полученное в соответствии с примером 2, перемешивают в 15 мл сухого дихлорметана в атмосфере азота. Раствор охлаждают до 0°С, а затем добавляют мета-хлорпероксибензойную кислоту (mcpba) (1,22 ммол., 301 мг 70% mcpba). Реакционную смесь перемешивают в течение 75 минут при 0°С, промывают насыщенным раствором тиосульфата натрия, насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида натрия, сушат (Na₂ SO₄) и упаривают досуха, получая 370 мг сырого (5, 7, 17)-5,10-эпокси-7-метил-3-метиленэстран-17-ола. В результате колоночной хроматографии с применением гептана/этилацетата 95/5 (об./об.%) в качестве элюента получают более чистое указанное в заголовке соединение (230 мг, 63%). В результате кристаллизации с применением гептана/этилацетата 95/5 (об./об.%) получают очищенное, указанное в заголовке соединение (120 мг, 33%) в виде белого твердого вещества, т.пл. 125°С.

Пример 5

Получение (5, 7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-20-ен-17-ола

Бромид метилтрифенилфосфония (688 мг, 1,93 ммол.) добавляют к перемешиваемому раствору трет-бутоксида калия (196 мг, 1,75 ммол.) в 2 мл сухого ТГФ в атмосфере азота. Желтую суспензию перемешивают в течение 45 минут при комнатной температуре. К суспензии быстро добавляют раствор (5, 7, 17)-7-метил-3-кето-19-норпрегн-20-ен-17-ола (220 мг, 0,7 ммол.) в 3 мл сухого ТГФ. Желтую реакционную смесь перемешивают в течение 2,5 часов при комнатной температуре, выливают в ледяную воду и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают водой, сушат (Na₂SO₄) и выпаривают досуха, получая 500 мг масла. В результате колоночной хроматографии с применением толуола/этилацетата 95/5 (об./об.%) в качестве элюента получают 200 мг сырого (5,7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-20-ен-17-ола. В результате кристаллизации из гептана получают очищенное, указанное в заголовке соединение (120 мг, 55%), в виде белого твердого вещества, т.пл. 105°С.

Пример 6

Получение (5, 7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-20-ин-17-ола

Бромид метилтрифенилфосфония (1,85 г, 5,18 ммол.) добавляют к перемешиваемому раствору трет-бутоксида калия (527 мг, 4,7 ммол.) в 4 мл сухого ТГФ в атмосфере азота. Желтую суспензию перемешивают в течение 45 минут при комнатной температуре. К суспензии добавляют раствор (5, 7, 17)-7-метил-3-кето-19-норпрегн-20-ин-17-ола (590 мг, 1,88 ммол.) в 8 мл сухого ТГФ. Желтую реакционную смесь перемешивают в течение 2,5 часов при комнатной температуре, выливают в ледяную воду и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают водой, сушат (Na₂SO₄) и упаривают досуха, получая 1,8 г масла. В результате колоночной хроматографии с применением толуола/этилацетата 95/5 (об./об.%) в качестве элюента получают 590 мг сырого (5, 7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-20-ин-17-ола. В результате кристаллизации из гептана получают очищенное, указанное в заголовке соединение (290 мг, 50%), в виде белого твердого вещества, т.пл. 97°С.

Пример 7

Получение (5, 7,17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегнан-17-ола

Бромид метилтрифенилфосфония (5,4 г, 15,1 ммол.) добавляют к перемешиваемому раствору трет-бутоксида калия (1,62 г, 14,4 ммол.) в 27 мл сухого ТГФ в атмосфере азота. Желтую суспензию перемешивают в течение 40 минут при комнатной температуре. К суспензии быстро добавляют раствор (5, 7, 17)-7-метил-3-кето-19-норпрегнан-17-ола (4,56 г, 14,4 ммол.) в 50 мл сухого ТГФ. Желтую реакционную смесь перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре, выливают в ледяную воду и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают водой и рассолом, сушат (Na₂SO₄ ) и упаривают досуха, получая 8,2 г масла. В результате колоночной хроматографии с применением толуола/этилацетата 95/5 (об./об.%) в качестве элюента получают (5, 7, 17)-7-метил-3-метилен-19-норпрегнан-17-ол (3,65 г, 81%), затвердевающий при хранении, т.пл. 104°С.

Пример 8

Получение (7)-7-метил-3,17-диметиленэстр-5(10)-ена

Бромид метилтрифенилфосфония (2,2 г, 6 ммол.) добавляют к перемешиваемому раствору трет-бутоксида калия (680 мг, 6 ммол.) в 25 мл сухого ТГФ в атмосфере азота. Желтую суспензию перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре. К суспензии быстро (прибл. 30 сек) добавляют раствор (7)-7-метил-3-кето-17-метиленэстр-5(10)-ена (850 мг, 3 ммол.) в 25 мл сухого ТГФ, что приводит к небольшой изотермической реакции. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре, выливают в ледяную воду (100 мл) и экстрагируют этилацетатом (100 мл). Органический слой промывают водой (50 мл), сушат (Na₂SO₄) и упаривают досуха, получая (7)-7-метил-3,17-диметиленэстр-5(10)-ен (680 мл, 80%) в виде бесцветного масла, [а]_D+115° (с 0,185 в этаноле).

Пример 9

Получение (7, 16, 17)-7,16-диметил-3-метилен-17-(1-пропинил)эстр-5-(10)-ен-17-ола

Раствор (7)-3,3-диметокси-7-метилэстр-5(10)-ен-17-она (1,5 г, 4,5 ммол.) и 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1Н)-пиримидинона (DMPU, 1,2 мл, 9,9 ммол.) в 30 мл диет. ТГФ добавляют в течение прибл. 8 минут к перемешиваемому раствору литийбис(триметилсилил)амида (LiHMDS, 4,96 мл, 1 М в ТГФ) в 15 мл дистиллированного ТГФ при -40°С в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивают в течение 45 минут при -40°С. Добавляют раствор иодометана (730 мкл, 11,7 ммол.) в 1 мл дист.ТГФ, перемешивают в течение 1 часа, и температуре дают возможность подняться до 0°С. Добавляют воду и насыщенный раствор хлорида аммония и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают рассолом, сушат (Na ₂SO₄) и упаривают досуха. В результате колоночной хроматографии с применением гептана/этилацетата 95/5 (об./об.%) в качестве элюента получают (7,16)-3,3-диметокси-7,16-диметилэстр-5(10)-ен-17-он (990 мл, выход 65%).

Пропин (прибл. 4 г, 100 ммол.) барботируют через раствор n-BuLi (9 мл, 1,6 М в гексане) в 19 мл сухого ТГФ при -70°С, получая экзотермическую реакцию (от -70 до -30°С). Раствор (7,16)-3,3-диметокси-7,16-диметилэстр-5(10)-ен-17-она (990 мг, 2,86 ммол.) в 10 мл сухого ТГФ добавляют в течение приблизительно 5 минут в белой суспензии в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивают в течение 45 минут и температуре дают возможность медленно подняться до комнатной температуры. Добавляют воду и насыщенный раствор хлорида аммония и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают рассолом, сушат (Na₂SO ₄) и упаривают досуха, получая (7,16,17)-3,3-диметокси-7,16-диметил-17-(1-пропинил)эстр-5(10)-ен-17-ол. Раствор щавелевой кислоты (72 мг, 0,57 ммол.) в 6 мл воды добавляют к раствору (7,16,17)-3,3-диметокси-7,16-диметил-17-(1-пропинил)эстр-5(10)-ен-17-ола (2,86 ммол.) в 25 мл этанола и реакционную смесь перемешивают в течение 45 минут при комнатной температуре. Добавляют раствор насыщенного двууглекислого натрия и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают рассолом, сушат (Na₂SO ₄) и упаривают досуха. В результате колоночной хроматографии с применением гептана/этилацетата 9/1 (об./об.%) в качестве элюента получают (7, 16, 17)-7,16-диметил-17-гидрокси-17-(1-пропинил)эстр-5(10)-ен-3-он (940 мг, выход 97%).

Бромид метилтрифенилфосфония (1,7 г, 4,7 ммол.) добавляют к суспензии трет-бутоксида калия (470 мг, 4,2 ммол,) в 31 мл сухого толуола в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивают в течение 45 минут при температуре образования флегмы. Реакционную смесь охлаждают до 4°С и добавляют раствор (7,16,17)-7,16-диметил-17-гидрокси-17-(1-пропинил)эстр-5(10)-ен-3-она (940 мг, 2,76 ммол.) в 39 мл сухого толуола в течение прибл. 10 минут. Реакционную смесь перемешивают в течение 20 минут при 4°С, добавляют разбавленный хлорид натрия и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают рассолом, сушат (Na ₂SO₄) и упаривают досуха. В результате колоночной хроматографии с применением гептана/этилацетата 95/5 (об./об.%) в качестве элюента получают (7,16,17)-7,16-диметил-3-метилен-17-(1-пропинил)эстр-5(10)-ен-17-ол (630 мг, выход 67%) в виде масла. Продукт лиофилизуют из диоксана. [] _D+83° (с 0,15 в этаноле).

Пример 10

Синтез (7, 16, 17)-16-этил-7-метил-3-метилен-17-(1-пропинил)эстр-5(10)-ен-17-ола

Данное соединение получают в соответствии с вышеописанными способами, применяя в качестве исходных материалов (7)-3,3-диметокси-7-метилэстр-5(10)-ен-17-он и этилиодид. [] _D+54° (с 0,13 в этаноле).

Пример 11

Синтез (7,17)-7-метил-3-метилен-17-(1-пропинил)эстр-5(10)-ен-17-ола

Данное соединение получают в соответствии с вышеописанными способами, применяя в качестве исходного материала (7)-3,3-диметокси-7-метилэстр-5(10)-ен-17-он. [] _D +80° (с 0,14 в этаноле).

Пример 12

Синтез (7, 16, 17)-16-этил-7-метил-3-метилен-19-норпрегн-5(10)-ен-20-ин-17-ола

Данное соединение получают в соответствии с вышеописанным синтезом, применяя в качестве исходного материала (7)-3,3-диметокси-7-метилэстр-5(10)-ен-17-он. [) _D +94° (с 0,10 в этаноле).

Пример 13

Получение (7)-3-метилен-7-метилэстр-5(10)-ена

Гидроксид калия (1,5 г, 27 ммол.) и моногидрат гидразина (3 мл, 62 ммол) добавляют к суспензии (7)-3,3-диметокси-7-метилэстр-5(10)-ен-17-она (1 г, 3 ммол.) в 17 мл диэтиленгликоля при комнатной температуре в атмосфере азота. Реакционную смесь нагревают в течение 1 часа при 130°С, а затем в течение 1 час 15 мин при 230°С. Для отделения воды и избытка гидразина применяют ловушку Дина-Старка. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, добавляют воду и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают рассолом, сушат (Na₂SO₄) и упаривают досуха, получая сухой продукт (7)-3,3-диметокси-7-метилэстр-5(10)-ен, который превращают в (7,16, 17)-7,16-диметил-3-метилен-17-(1-пропинил)эстр-5(10)-ен-17-ол в соответствии с вышеописанными способами, т. пл. 57°С.

Пример 14

Синтез (7)-3-метилен-7-метилэстр-5(10)-ен-17-он O-метилоксима

(7)-3,3-Диметокси-7-метилэстр-5(10)-ен-17-он (100 мг, 0,3 ммол.) добавляют к раствору метоксиламина. НСl (100 мг, 1,2 ммол.) и ацетата натрия (123 мг, 1,5 ммол.) в 6 мл МеОН. Реакционную смесь перемешивают в течение 3 дней при комнатной температуре. Добавляют воду и раствор насыщенного двууглекислого натрия и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают рассолом, сушат (Na₂SO₄) и упаривают досуха, получая сырой (7)-3,3-диметокси-7-метилэстр-5(10)-ен-17-он O-метилоксим, который превращают в (7)-3-метилен-7-метилэстр-5(10)-ен-17-он O-метилоксим в соответствии с вышеописанными способами. [] _D+149° (с 0,11 в этаноле).

Пример 15

Синтез (7)-3-метилен-7-метилэстр-5(10)-ен-17-он оксима

Данный оксим получают из (7)-3,3-диметокси-7-метилэстр-5(10)-ен-17-она и гидроксиламина. НСl в соответствии с вышеописанными способами, т.пл. 149°С.

Пример 16

Аллергическая реакция замедленного типа (DTH)

В начале эксперимента используют группу из восьми мышей-самок Balb/c (Harlan, Zeist, The Netherlands) в возрасте приблизительно 8 недель. Перед началом эксперимента используемых мышей помещают в клетки Macrolon в обычных условиях и акклиматизируют в течение 3-5 дней. Группы получают либо соединение, либо плацебо.

Их взвешивают в 1-й и последний день эксперимента. Животным делают подкожные (sc) инъекции один раз в день в заднюю часть шеи либо вводят перорально через зонд, начиная с 1-го по 11-й день, исследуемое соединение при концентрации, составляющей от 1,2; 3, 4, 6 до 12 мг/кг. Объем инъекции составляет 0,1 мл наполнителя для инъекции, состоящей из физиологического раствора, содержащего 0,5% желатина и 5% маннита. В каждый эксперимент включают группу, получающую плацебо (только наполнитель), и группу, получающую 4 мг/кг дексаметазона в качестве сравнительного соединения.

На 2-й день животных иммунизируют с применением 0,1 мл устойчивой суспензии 3,75 Lf антигена Tetanus Toxoid (TT от RIVM, Zeist, The Netherlands) в 1 мг/мл бромида диметилдиоктадециламмония (DDA), полученного в результате разделения фаз, в 2-х местах на груди, интрадермально.

На 9-й день животных стимулируют на вентральной стороне правой (R) лапы с применением 0,05 мл раствора, содержащего 50 Lf ТТ и 1 мг Аl(ОН)₃ на мл. В подошву левой (L) лапы (контроль) вводят только наполнитель с Аl(ОН)₃. Через 24 и 48 часов толщину подошвы левой и правой лап (параметры L и R, соответственно) измеряют при помощи денситометра с кронциркулем в мм и определяют процентную величину антиген-специфичного опухания подошвы лапы в соответствии со следующей формулой: [(R-L)/L]×100%.

Результаты
Соединение	Количество соединения, вводимого sс. в мг/кг, приводящего 50% снижению реакции DTH по сравнению с плацебо
Пример 1	1,9-3,4
Пример 2	20
Пример 3	11
Пример 4	>20
Пример 5	10
Пример 7	6

Пример 17

Не тучные мыши с диабетом (NOD)

Используют мышей NOD, выращенных на месте (пары для размножения первоначально приобретают в Hattori, Boston, USA, 58-е поколение) или приобретенных в Bomholtgard (Denmark), в возрасте 6-7 недель.

Для оценки действия соединений на спонтанное развитие сиаладенита, характеризуемого инфильтрацией лейкоцитов поднижнечелюстной железы, используют только мышей-самок.

Группы, включающие 6-8 мышей-самок, содержат в обычных условиях и один раз в день вводят им (подкожно или перорально) с 8- до 14- или 20-недельного возраста 0,1 мл соединения (при концентрации 1,2; 4 или 12 мг/кг/день) либо плацебо (только наполнитель), либо ничего не вводят. Начиная с 12-й недели, им еженедельно делают анализы на наличие глюкозы в моче (Diabur-test 5000, Boehringer Mannheim).

На 8-й (группа с предварительным введением), 14-й или 20-й неделе, после 6 или 12 недель введения, соответственно, животных умерщвляют под эфирной анестезией; органы удаляют, отсекают жир и взвешивают органы. Поднижнечелюстные железы фиксируют в сублимате-формалине в течение 18-24 часов и переносят в 70% спирт. Срезы тканей помещают в парафин и окрашивают с применением НЕ в соответствии с обычными способами. Для оценки срезов ткани на инфильтрат проводят два независимых исследователя под микроскопами в соответствии с обычными способами. Такое исследование может служить для демонстрации активности соединений в соответствии с данным изобретением.

Пример 18

Коллагеновый артрит

Мышей-самок DBA-1J/BOM приобретают в Bomholtgard, Denmark. Всех животных содержат в обычных условиях и акклиматизируют в течение по меньшей мере 7 дней.

В возрасте 10-12 недель всех животных иммунизируют интрадермально у основания хвоста с применением 100 мкг эмульсии очищенного бычьего коллагена, тип II [СII] (2 мг/мл в 0,05 уксусной кислоте), эмульгированного в равных объемах полного адъюванта Фрейнда (CFA, содержащий 4 мг/мл МТ H37Ra, Difco Laboratories, Detroit, USA). На 21-й день после иммунизации делают интраперитонеальную бустерную инъекцию 100 мкг СII, растворенного в солевом растворе. Введение осуществляют один раз в день, начиная с 1-го дня (за день до иммунизации) до аутопсии на 44-й день.

Группам, включающим от 9 до 10 животных, вводят либо исследуемое соединение (1,5 мг/кг/день ежедневно до 22-го дня, а затем - только 3 раза в неделю), либо циклоспорин А (вначале 100 мг/кг/день, а с 4-го дня - 20 мг/кг), либо дексаметазон (2 мг/кг/день), либо наполнитель (5% Mulgofen (EL 719, GAF) в солевом растворе). Включают также не получающую препаратов контрольную группу.

Мышей взвешивают каждую неделю, при этом активность клинического артрита (визуальное проявление артрита в периферических суставах) определяет (в соответствии с обычными способами) один и тот же наблюдатель, не имеющий информации о вводимых препаратах, начиная с 19-го дня, каждые 2-3 дня вплоть до аутопсии на 44-й день.

Клинический артрит оценивают по шкале 0-2 на лапу и выражают в виде кумулятивного артритного числа на мышь с максимальной величиной, составляющей 8. В конце эксперимента коленные и голеностопные суставы изолируют и подвергают рентгеновскому анализу как показатель разрушения костей с последующей немедленной фиксацией в 4% формальдегиде для гистологии.

Рентгеновские снимки тщательно изучают под стереомикроскопом, оценивая разрушение костей суставов по шкале 0-5 в соответствии с обычными способами, начиная с неповрежденных суставов до их полного разрушения. Такое исследование может служить для демонстрации активности соединений в соответствии с данным изобретением.

Таблица 1 АЛЛЕРГИЧЕСКАЯ РЕАКЦИЯ ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА (DTH)
Пример	Количество соединения, необходимое для формирования опухания (статистически достоверного), мг/кг
Пример 1	3-12
Пример 2	12
Пример 3	12
Пример 5	12
Пример 6	12
Пример 7	12
Пример 9	6-24
Пример 10	12
Пример	Опухание, %
Плацебо	77.1
Пример 1	6.09
Пример 4	69.1
Пример 5	33
Пример 6	20.5
Пример	Опухание, %
Плацебо	56
Пример 1	17.9
Пример 8	52.6
Пример 9	33.5
Пример 10	30.6
Пример 11	28.9
Пример 12	38.6
Пример 13	35.3
Пример 14	34.3
Пример 15	43.5