Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

производные бетулина как ингибиторы комплемента

Классы МПК:C07J53/00 Стероиды, в которых циклопента (а) гидрофенантреновый скелет модифицирован конденсированием с карбоциклическими кольцами или получением дополнительного кольца за счет образования непосредственной связи между двумя атомами углерода кольца
C07J63/00 Стероиды, в которых циклопента (а) гидрофенантреновый скелет модифицирован расширением только одного из колец на один или два атома
A61K31/56  соединения, содержащие циклопента(а)гидрофенантреновые кольцевые системы; их производные, например стероиды
A61P37/04 иммуностимуляторы
Автор(ы):, , , ,
Патентообладатель(и):Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2003-12-24
публикация патента:

Описываются производные бетулина общей формулы I

производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233

где R1, R2 одинаковые или различные и независимо или вместе

- SO2(OH) и их соли

- Р(O)(ОН)2 и их соли

- СН2СООН и их соли

где R3, -С(СН3)(=СН 2)

- СН(СН3)2

производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233

как ингибиторы комплемента. I проявляют более высокую активность, их получают из доступного тритерпена бетулина, выделяемого из коры березы. 5 табл.

Предложенное изобретение относится к области медицины, а конкретно к иммунологии.

Система комплемента является частью иммунной системы организма, которая активируется при попадании в организм чужеродных бактерий и антигенов. После уничтожения чужеродных тел активация комплемента прекращается. Однако широкий спектр иммунных, аутоиммунных и иммунодефицитных заболеваний, сопровождающихся поражением собственных тканей организма, связан с чрезмерной и (или) несвоевременной активацией системы комплемента. К группе острых состояний, связанных с активацией системы комплемента, можно отнести респираторный дистрессиндром взрослых, ишемические повреждения (инфаркт миокарда, скелетных мышц, легких), сепсис, ожоговую болезнь, раневую болезнь, астму, повторный (послеоперационный) стеноз сосудов, синдром множественной органной недостаточности, кровотечения, синдром Гийена-Барре. В группу хронических состояний входят пароксизмальная ночная гемоглобинурия, гломерулонефрит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Альшеймера, отторжение органов при трансплантациях, миастения, рассеянный склероз. Часто активация системы комплемента, приводящая к осложнениям, возникает из-за неполной биосовместимости материалов в аппаратах для гемодиализа, искусственного сердца и др. В связи с этим создание эффективных модуляторов системы комплемента, способных предотвращать ее деструктивное действие на организм, является одной из актуальных задач современной молекулярной иммунологии

Известны высокомолекулярные терапевтические препараты на основе природных и рекомбинантных форм естественных ингибиторов системы комплемента (C1-ING и sCRl) [Asghar S.S. Pharmacological manipulation of the complement system in human diseases. //Frontiers in Bioscience. 1996. March 1. V.1 P.15-25]. Причина привлекательности рекомбинантных белков, как терапевтических препаратов, заключена в уже заложенных в них биологических свойствах Однако высокая стоимость рекомбинантных белков и их возможная иммуногенность делает их неконкурентоспособными по сравнению с простыми и дешевыми низкомолекулярными ингибиторами системы комплемента.

На сегодняшний день найдено много сильных низкомолекулярных ингибиторов активации комплемента in vitro. Среди них противоопухолевые, потивовоспалительные, антифибринолитические агенты. Розмариновая кислота (1) ингибирует активацию комплемента при IC50 180 мкМ [Sahu A., Rawal N. Inhibition of

производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233

complement by covalent attachment of rosmarinic acid to activated C3b //Biochem. Pharmacol. 1999. V.57, P.1439-1446]. Это природное соединение труднодоступно, к тому же недостаточно активно.

Наиболее близкими по структуре и достигаемому результату к предлагаемому предмету изобретения являются полусинтетические аналоги олеановой кислоты (2). Из табл.1 видно, что наиболее активное соединение этого ряда ингибирует активацию комплемента при IС50 31.4 мкМ [Assefa H., Nimrod A. Synthesis and evaluation of potential complement inhibitory semisynthetic analogs of oleanolic acid. //Bioorg.Med.Chem.Lett. 1999. V.9. P. 1889-1894].

производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233

производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233

К несомненным недостаткам такого ингибитора следует отнести недостаточно высокую активность, малую доступность исходной олеановой кислоты, многостадийность получения ее производных, обладающих необходимым свойством.

Технической задачей данного изобретения является синтез более активного ингибитора комплемента.

Для достижения лучшего технического результата нами предложены новые ингибиторы комплемента, блокирующие активацию комплемента при IC50 до 7 мкМ. Они получаются из выделяемого из коры березы тритерпена бетулина.

Ингибиторы комплемента общей формулой

производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233

где R1, R2 одинаковые или различные и независимо или вместе представляют:

- SO2(OH) и их соли (А)

- Р(O)(ОН)2 и их соли (В)

- СН2СООН и их соли (С)

где R3, -С(СН 3)(=СН2) (I)

- СН(СН3); (II)

производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233

Пример 1

3,28-Дисульфаты бетулина и его производных (IA-VIA). Сульфатирование бетулина (1, R1=R2=H) и его производных (II-VI, Rl=R2=H) проводят по следующей схеме. К смеси 9.5 ммоль серной кислоты и 9.5 ммоль уксусного ангидрида в 10 мл пиридина при температуре от 18 до 90°С прибавляют 1.6 ммоль соответствующего производного бетулина и перемешивают в течение 30-60 минут. Затем смесь нейтрализуют, осадок неорганических солей отфильтровывают, раствор упаривают досуха. Полученные кристаллы дважды промывают 20 мл воды и сушат. Выходы продуктов 90-97%.

Дисульфат бетулина (IA): 1Н-ЯМР (CDCl3-CD3ОD, 1:1, производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233 , м.д.): 0.68-1.99 (42Н, 6СН3, (СН2)n, м.), 3.65 (1H,=CHOS, т.), 4.0 (2Н, CH2OS, д. д.). 4.55, 4.70 (2Н, СН2=С, 2 с.).

Пример 2

3,28-Дифосфаты бетулина и его производных (IB-VIB) получают по следующей методике. 3.20 ммоль производного бетулина нагревают с 32.04 ммоль хлорокиси фосфора и 0.41 ммоль трихлорида фосфора при механическом перемешивании при 90-95°С 24 ч, продувая аргоном, затем добавляют еще 10.7 ммоль хлорокиси фосфора и нагревают при тех же условиях еще 76 ч. Избыток хлорокиси фосфора отгоняют под вакуумом. Оставшуюся маслянистую жидкость кристаллизуют при температуре -4° С с 10 мл гексана. Осадок отделяют декантированием, приливают 32 мл гептана, 20 мин кипятят с обратным холодильником, отделяют нерастворившийся осадок декантированием и раствор помещают в холодильник (-4° С) для кристаллизации. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, растворяют в 5 мл теплой воды и сушат над Р 2O5 и КОН. Выход 68-75%.

Дифосфат бетулина (IB): 1Н-ЯМР (CDCl3-CD3ОD, 1:1, производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233 , мд): 0.68-1.99 (42Н, 6СН3, (СН2)n. м.), 3.61 (1Н,=СНОР, т.), 3.90 (2Н, СН2OР, д. д.), 4.55, 4.70 (2Н, СН2=С, 2с.).

Пример 3

3,28-Ди-О-карбоксиметилбетулин и его производные (IC-VIC) получают по следующей методике. К 3.2 ммоль гидрида натрия в 20 мл тетрагидрофурана добавляют 1.6 ммоль производного бетулина, а затем 3.2 ммоль этилового эфира бромуксусной кислоты. Реакционную смесь кипятят при перемешивании 30 минут, затем упаривают. Добавляют 10 мл воды и 2 мл концентрированной соляной кислоты и упаривают до 3 мл. После охлаждения выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают 5 мл воды и сушат. Выходы продуктов 85-95%.

3,28-Ди-О-карбоксиметилбетулин (IC): 1Н-ЯМР (CDCl3-CD3ОD, 1:1, производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233 , м.д.): 0.68-1.99 (42Н, 6СН3, (СН2)n, м.), 3.63 (1H,= производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233 OСН2СООН, т.), 3.95 (2H, производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233 OСН2СООН, д. д.), 4.49 (4Н, СН2СООН, с), 4.55, 4.70 (2Н, СН2=С, 2 с.).

Пример 4

20,29-Дигидробетулин (II, R1 =R2=H) получают каталитическим гндрированием бетулина в тетрагилрофуране на 5%-ом палладии на угле при комнатной температуре и атмосферном давлении. Выход количественный.

Пример 5

20,29-Дигидро-20,29-дихлорметиленбетулин (V, R1=R2=H) и 20.29-дигидро-20,29-дибромметиленбетулин (IV, R1=R2=H) получают в гетерофазной смеси бетулина (I, R1=R2=H), хлористого метилена и хлороформа (либо бромоформа) с 50% водным раствором гидрооксида натрия в присутствии катализатора межфазного переноса в течение 20 ч. Смесь упаривают и экстрагируют конечные вещества тетрагидрофураном, перекристаллизовывают из этилацетата. Выходы 85 и 60% соответственно.

20,29-Дигидро-20,29-дихлорметиленбетулин (V, R1 =R2=H): т. пл. 201-202,50C. 1 Н-ЯМР (CDCl3): 3.72 (1H, д, J 10.7, 28-СН2OН), 3.22 (1Н, д, J 10.7, 28-СН2OН). 3.18 (1Н. м, 3Н). 2.30 (1Н, м, 19Н). 1.22 (3Н, с, СН3), 0.99 (3Н, с, СН 3), 0.98 (3Н, с, СН3), 0.96 (3Н, с, СН3 ), 0.81 (3Н, с, СН3), 0.74 (3Н, с, СН3 ). Найдено, %: С 70.84, Н 9.59. С31H50Cl 2O2. Вычислено, %: С 69.39, Н 9.65.

20,29-Дигидро-20,29-днбромметиленбетулин (IV, R1 =R2=H): т. пл.162-164° С; 1Н-ЯМР (CDCl 3): 3.72 (1H, д, J 10.2, 28-СН2OН), 3.22 (1Н, д, J 10.2, 28-СН2ОН). 3.18 (1Н, м, 3Н), 2.40 (1H, м, 19Н), 1.66 (3Н, с, СН3), 1.59 (3Н, с, СН 3), 1.36 (3Н, с, СН3), 1.00 (3Н, с, СН3 ), 0.94 (3Н, с, СН3), 0.81 (3Н, с, СН3 ). Найдено, %: С 60.59, Н 8.20. C31H50Br 2O2. Вычислено, %: С 60.82, Н 8.83.

Пример 6

20,29-Дигидро-20,29-метиленбетулин (III, R 1=R2=H) получают из 2 ммоль бетулина (I, R 1=R2=H) и 3 ммоль дииодометана в эфире в присутствии металлической меди активированной цинковой пылью в течение суток. Раствор фильтруют, упаривают, перекристаллизовывают из этилацетата. Выход 60%. т. пл.233-234,5° С, 1Н-ЯМР (CDCl3): 3.72 (1H, д, J 10.7, 28-СН2OН), 3.22 (1H, д, J 10.7, 28-СН2OН), 3.18 (1H, м, 3-Н), 2.30 (1H, м, 19-Н), 1.22 (3Н, с, СН3), 0.99 (3Н, с, СН3), 0.98 (3Н, с, СН3), 0.96 (3Н, с, СН3), 0.81 (3Н, с, СН3), 0.74 (3Н, с, СН3), 0.24 (4Н, м, СН2-СН2); EI-MS m/z 457 М+.

Найдено, %: С 81.52, Н 11.47. С31H52О2. Вычислено, %: С 78.06, Н 11.52.

Пример 7

30-Бромбетулин (VI) получают бромированием 1,5 ммоль бетулина (I) 1,6 ммоль N-бромсукцинимидом в 20 мл четыреххлористого углерода в течение 24 ч. После упаривания и промывания 10 мл горячей воды получают кристаллический порошок. Выход 91%. 1Н-ЯМР (CDCl3): 5.00, 5.11 (2Н, с, 29-СН2=), 3.95 (2Н, с, 30-СН2Вr), 3.72 (1Н, д, J 10.7, 28-СН2OН), 3.22 (1Н, д, J 10.7, 28-СН2OН), 3,18 (1Н, м, 3-Н), 2.30 (1H, м, 19-Н), 1.22 (3Н, с, СН3), 0.99 (3Н, с, СН3), 0.98 (3Н, с, СН3), 0.96 (3Н, с, СН3), 0.81 (3Н, с, СН3), 0.74 (3Н, с, СН3).

Пример 8

Определение антигемолитической активности (АА) проводят в стандартной гемолитической системе следующего состава: сенсибилизированные кроличьими антителами бараньи эритроциты, образец исследуемого вещества, комплемент морской свинки, вероналовый буфер (рН 7.4), содержащий ионы Са2+ и Mg2+ (VBS++ ) [Козлов Л.В., Ростовцева Л.И., Ломака Т.С., Сутовская Н.С., Сорокина И.Б, Баркова Т-И. // Биоорганич. Химия, 1985, т. 11, с. 1510-1518].

Приготовление буфера. При перемешивании и нагревании растворяют 3 г (0.0145 моль) мединала и 5.75 г (0.0312 моль) веронала в 1.5 л дистиллированной воды. Растворяют 85 г (1.45 моль) NaCl и доводят объем до 2 л. Добавляют безводный NaOH (0.4-0-5 г) до рН 7.4. Затем добавляют 5 мл 1 М раствора хлорида магния и 1.5 мл 1 М раствора хлорида кальция.

Подготовка эритроцитов. Эритроциты хранятся при +4°С в стерильных пробирках в растворе Олсвера в анаэробных условиях. В экспериментах используют эритроциты в VBS++. Во всех экспериментах используют только холодный буферный раствор (чтобы снизить спонтанный лизис эритроцитов). Для проведения эксперимента стерильно отбирают 2-3 мл суспензии эритроцитов, добавляют 20 мл буфера, аккуратно встряхивают до гомогенного состояния, и центрифугируют при 3000g 5 мин. Затем супернатант аккуратно сливают, добавляют немного VBS++ и ресуспендируют осадок. После этого добавляют буфер до достижения прежнего уровня. Описанная операция повторялась до тех пор, пока супернатант не обесцветился. Полученную суспензию эритроцитов далее стандартизуют.

Приготовление сенсибилизированных эритроцитов. К 10 мл взвеси эритроцитов (1· 109 клеток/мл) прибавляют 10 мл раствора кроличьих антител, полученного разбавлением буфером (VBS++) в отношении 1:400, перемешивают и инкубируют 30 мин при 37° С, периодически взбалтывая. Взвесь центрифугируют при 3000g 5 мин. Затем супернатант аккуратно сливают, добавляют немного VBS++ и ресуспендируют осадок.

Стандартизация сенсибилизированных эритроцитов. Взвесь эритроцитов доводят до концентрации 1.5· 108 клеток/мл. Для этого к 1900 мкл дистиллированной воды прибавляют 100 мкл суспензии сенсибилизированных эритроцитов и встряхивают до тех пор, пока раствор не стал прозрачным. Необходимо добиться того, чтобы оптическая плотность раствора лежала в пределах 1.000-1.050. Для этого, если нужно, разбавляют суспензию эритроцитов буфером и повторяют операцию приготовления лизированного раствора и измерения оптической плотности. В дальнейшем используют стандартизованные эритроциты.

Подбор концентрации комплемента. Для тестирования веществ подбирают концентрация комплемента, при которой лизис составляет 75-80%. Это делали следующим образом. В пробирки добавляют компоненты согласно таблице 2 и инкубируют в течение 25 минут при 37° С, осторожно встряхивая их содержимое через каждые 5-7 мин.

производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233

По окончании термостатирования в пробирки вносят дополнительно по 3 мл холодного буфера. Все пробирки центрифугируют 5 мин при 3000g, измеряют оптическую плотность супернатанта (А414 экс и А414 п/л ср.). Далее по рассчитанным по формуле I значениям лизиса строят график зависимости величины лизиса от концентрации комплемента.

L=A414ЭКС 414 п/л ср.· 100% (I)

А414ЭКС - оптическая плотность супернатанта проб 5-16;

A 414 п/л ср.. - средняя оптическая плотность супернатанта проб 1-3.

Необходимо также обратить внимание на фоновый лизис эритроцитов - АКЭ (лизис в чистом буфере). Желательно, чтобы он не превышал значения оптической плотности 0.1. Если он превышает 0.2, следует взять новую порцию эритроцитов.

Для дальнейших экспериментов используют ту концентрацию комплемента, при которой наблюдается 75-80% лизис эритроцитов.

Для определения антигемолитической активности веществ в каждую пробирку добавляют компоненты геополитической системы и раствор тестируемого вещества, руководствуясь таблицей 3. Контроль на полный лизис осуществляют добавлением дистиллированной воды вместо буфера. Контроль 75-80% лизиса осуществляют в пробах 4-6.

производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233

Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37° С в течение 25 мин. После этого содержимое пробирок охлаждают до 4° С, разбавляют буфером в 4 раза и центрифугируют при 3000g в течение 5 мин. После этого супернатант отделяют, количество высвободившегося гемоглобина в пробе измеряют спектрофотометрически при 414 нм.

производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233

производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Производные бетулина общей формулы

производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233

где R1, R2 одинаковые или различные и независимо или вместе представляют

- SO2(OH) и их соли,

- Р(O)(ОН)2 и их соли,

- СН 2СООН и их соли,

R3 - -С(СН3 )(=СН2),

- СН(СН3)2

производные бетулина как ингибиторы комплемента, патент № 2243233

как ингибиторы комплемента.


Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C07J53/00 Стероиды, в которых циклопента (а) гидрофенантреновый скелет модифицирован конденсированием с карбоциклическими кольцами или получением дополнительного кольца за счет образования непосредственной связи между двумя атомами углерода кольца

Патенты РФ в классе C07J53/00:
способ получения а-секотритерпеновых с-3(28) моно-и диамидов и их секоинтермедиатов -  патент 2525546 (20.08.2014)
способ получения бетулина -  патент 2524778 (10.08.2014)
способ получения бетулина (варианты) -  патент 2523545 (20.07.2014)
способ синтеза производного эфира и глицирретиновой кислоты и соединение сложного эфира дезоксиглицирретиновой кислоты -  патент 2522455 (10.07.2014)
способ получения производных 3,28-дисульфата бетулина -  патент 2520971 (27.06.2014)
способ получения бетулина из бересты -  патент 2501805 (20.12.2013)
способ получения ацетата 16 ,17 -циклогексанопрегн-5-ен-3 -ол-20-она -  патент 2495047 (10.10.2013)
средство, обладающее антиоксидантной, противовоспалительной, нейропротекторной, гиполипидемической, гипохолестеринемической, гипогликемической, гепатопротекторной, иммуносупрессорной активностями -  патент 2487884 (20.07.2013)
способ получения натриевой соли 3-сульфата аллобетулина -  патент 2482126 (20.05.2013)
способ получения натриевой соли 3-сульфата аллобетулина -  патент 2482125 (20.05.2013)

Класс C07J63/00 Стероиды, в которых циклопента (а) гидрофенантреновый скелет модифицирован расширением только одного из колец на один или два атома

Патенты РФ в классе C07J63/00:
способ получения а-секотритерпеновых с-3(28) моно-и диамидов и их секоинтермедиатов -  патент 2525546 (20.08.2014)
способ получения бетулина -  патент 2524778 (10.08.2014)
способ получения бетулина (варианты) -  патент 2523545 (20.07.2014)
способ синтеза производного эфира и глицирретиновой кислоты и соединение сложного эфира дезоксиглицирретиновой кислоты -  патент 2522455 (10.07.2014)
способ получения производных 3,28-дисульфата бетулина -  патент 2520971 (27.06.2014)
способ получения 3-ацетата-28-сульфата бетулина -  патент 2477285 (10.03.2013)
средство, представляющее собой 3-o- -d-глюкуронопиранозил- -d-глюкуронопиранозид олеан-9( 11),12( 13)-диен-30-овой кислоты, проявляющее анти-вич-1 активность, и способ его получения -  патент 2475246 (20.02.2013)
способ получения мороновой кислоты -  патент 2472803 (20.01.2013)
способ получения 3,28-дисульфата бетулина -  патент 2468031 (27.11.2012)
способ получения бетулина -  патент 2465281 (27.10.2012)

Класс A61K31/56  соединения, содержащие циклопента(а)гидрофенантреновые кольцевые системы; их производные, например стероиды

Патенты РФ в классе A61K31/56:
способ выбора лечения акне у женщин -  патент 2529789 (27.09.2014)
способ персонифицированной профилактики эстрогензависимых заболеваний у здоровых женщин и женщин с факторами сердечно-сосудистого риска в возрасте 45-60 лет -  патент 2527357 (27.08.2014)
стабилизированная композиция для лечения псориаза -  патент 2526162 (20.08.2014)
способ получения фракции липофильных веществ из чаги -  патент 2522952 (20.07.2014)
способ синтеза производного эфира и глицирретиновой кислоты и соединение сложного эфира дезоксиглицирретиновой кислоты -  патент 2522455 (10.07.2014)
комбинированный аэрозольный препарат на основе салметерола и флутиказона для лечения заболеваний органов дыхания -  патент 2521975 (10.07.2014)
способы лечения и/или подавления прироста массы -  патент 2519642 (20.06.2014)
дисперсии фитостеролов -  патент 2501328 (20.12.2013)
средство, ингибирующее множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток -  патент 2494742 (10.10.2013)
ингаляционный препарат для лечения болезней органов дыхания, содержащий в качестве активных веществ микронизированный салметерол ксинофоат и микронизированный флутиказона пропионат и способ его получения -  патент 2494730 (10.10.2013)

Класс A61P37/04 иммуностимуляторы

Патенты РФ в классе A61P37/04:
способ лечения больных с синдромом внутрипеченочной портальной гипертензии -  патент 2529414 (27.09.2014)
профилактическая вакцина от туберкулеза -  патент 2526910 (27.08.2014)
питательная композиция для улучшения иммунной системы млекопитающих -  патент 2525429 (10.08.2014)
способ коррекции вторичных иммунодефицитов у телят -  патент 2525426 (10.08.2014)
способы усиления стабилизации индуцируемого гипоксией фактора-1 альфа -  патент 2521251 (27.06.2014)
биологически активная добавка к пище, обладающая гепатопротекторными и иммуностимулирующими свойствами -  патент 2516932 (20.05.2014)
иммуностимулирующее средство -  патент 2510277 (27.03.2014)
способ лечения больных красным плоским лишаем слизистой полости рта -  патент 2510269 (27.03.2014)
вакцинная композиция, пригодная при инфекциях hpv и вирусом гепатита в, и способ ее получения -  патент 2509570 (20.03.2014)
способ получения гидрогеля лечебного назначения -  патент 2508091 (27.02.2014)

Наверх