способ количественной оценки эффективности сдвиговой регуляции функции тромбоцитов

Формула изобретения

Способ количественной оценки эффективности сдвиговой регуляции функции тромбоцитов, включающий определение среднего размера агрегатов и числа объектов, адгезированных на жесткой подложке, отличающийся тем, что адгезию и агрегацию тромбоцитов определяют в пробе крови одного пациента при низкой (200 с^-1) и высокой (1300 с^-1) скоростях сдвига и рассчитывают индекс сдвиговой регуляции агрегации (ИСРагр) как отношение значения среднего размера агрегатов при высокой скорости сдвига к его значению при низкой скорости сдвига и индекс сдвиговой регуляции адгезии (ИСРадг) как отношение среднего числа адгезированных объектов при высокой скорости сдвига к значению данного показателя при низкой скорости сдвига.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано в различных областях экспериментальной и клинической медицины для оценки состояния тромбоцитов при различных формах патологии и воздействии различных физических и медикаментозных факторов. Предлагаемый метод позволяет оценить чувствительность тромбоцитов к изменяющейся скорости сдвига, обеспечиваемой вязким взаимодействием элементов движущейся среды.

Оценка функции тромбоцитов при различных патологических состояниях является важным звеном диагностики и служит основой для разработки эффективных методов патогенетической терапии многих заболеваний. Известно, что одним из регуляторных контуров, обеспечивающих оптимальную адгезивную и агрегационную функции тромбоцитов, является так называемая "сдвиговая регуляция", осуществляемая за счет возникновения мембранного клеточного сигнала при изменении скорости смещения вязких элементов среды при движении форменных элементов в потоке крови [1, 3, 5]. В различных участках сосудистого русла за счет локальных особенностей вазоархитектоники, различий в диаметре сосудов и величине перфузионного давления возникают реальные колебания скорости потока крови и, следовательно, имеют место различные значения скорости сдвига. Важным фактором в восприятии и реализации сдвигового сигнала является состояние самих кровяных пластинок [3, 5, 6].

В условиях патологии, например при развитии атеросклеротического процесса, изменяются реологические свойства крови, возникают нарушения ламинарности тока крови вследствие формирования бляшек в просвете сосуда, происходит изменение скоростных режимов кровотока, что естественно отражается на характере сдвиговой регуляции функции кровяных пластинок [4, 7]. При этом изменяется и состояние самих тромбоцитов, что приводит к изменению эффективности сопряжения мембранного сдвигового сигнала и конечного клеточного ответа в виде адгезии и агрегации.

Если сам факт наличия и значимости сдвиговой регуляции функции тромбоцитов в настоящее время не вызывает сомнений, то в литературе отсутствует описание методов, позволяющих количественно оценить состояние сдвиговой регуляции в норме и патологии.

Нами впервые предлагается способ количественной оценки эффективности сдвиговой регуляции функции тромбоцитов, включающий определение среднего размера агрегатов и числа объектов, адгезированных на жесткой подложке, в пробе крови одного пациента при низкой (200 с^-1) и высокой (1300 с^-1) скоростях сдвига и расчет индекса сдвиговой регуляции агрегации (ИСРагр) как отношения значения среднего размера агрегатов при высокой скорости сдвига к его значению при низкой скорости сдвига, и индекса сдвиговой регуляции адгезии (ИСРадг) как отношения среднего числа адгезированных объектов при высокой скорости сдвига к значению данного показателя при низкой скорости сдвига. Метод реализуется in vitro и заключается в следующем.

У пациента по стандартной методике забирается проба цитратной крови (соотношение кровь-цитрат 9:1). Кровь выдерживается при комнатной температуре в течение 40 мин и делится на 2 аликвоты (для исследования при низкой и высокой скорости сдвига). Затем проводится исследование поведения тромбоцитов на жесткой подложке - экстраклеточном матриксе (ЭКМ), представляющем собой комплекс продуктов, вырабатываемых эпителием роговицы быка, и содержащих различные типы коллагена, фибриноген, фибронектин, витронектин, фактор Виллебранда, тромбоспондин, ламинин и гликопротеины [2], или на полистирене. Используются стандартные 4-ячейные планшеты из полистирена, на дно ячеек которых нанесен ЭКМ, либо ячейки без ЭКМ. В ячейку помещаются 200 мкл цельной цитратной крови. Исследования проводятся с использованием прибора "Cone and Plate Analyzer" (CPA), позволяющего исследовать поведение тромбоцитов при различных скоростях сдвига. В приборе используется принцип ротационной вискозиметрии. В ячейки с биоматериалом опускается цилиндр с концевой конусной конфигурацией, благодаря которой между ним и дном ячейки образуется зазор. Вращение цилиндра с заданной скоростью создает необходимые параметры скорости сдвига. Используются две скорости сдвига: низкая - 200 с^-1 (являющаяся подпороговой для запуска механизмов сдвиговой активации) и высокая - 1300 с^-1 (активирующая функции тромбоцитов). Исследование на приборе каждой аликвоты занимает 2 минуты.

Затем ячейки с осевшими тромбоцитами на 2 мин заполняются красителем май-грюнвальд. Далее краска отсасывается, препарат подсыхает на воздухе и анализируется на имидж-анализаторе. При этом рассчитываются следующие параметры - количество адгезированных объектов (показатель, характеризующий адгезивную способность тромбоцитов) и средний размер агрегатов (показатель, характеризующий агрегационную способность тромбоцитов).

Поскольку при наличии скорости сдвига включается дополнительный фактор стимуляции кровяных пластинок, различия в регистрируемых параметрах при низкой и высокой скоростях сдвига будут отражать эффективность (степень выраженности) сдвиговой регуляции в стимуляции функции тромбоцитов. Для ее количественного выражения нами предлагается для каждого показателя рассчитывать индекс сдвиговой регуляции (ИСР), представляющий собой отношение значения исследуемого показателя при высокой скорости сдвига к его значению при низкой скорости сдвига. Так, индекс сдвиговой регуляции агрегации тромбоцитов (ИСРагр) рассчитывается по формуле

ИСРагр=СРАвыс/СРАниз,

где СРАвыс - средний размер агрегатов при высокой скорости сдвига, СРАниз - средний размер агрегатов при низкой скорости сдвига.

Индекс сдвиговой регуляции адгезии тромбоцитов (ИСРадг) рассчитывается по формуле

ИСРадг=КАОвыс/КАОниз,

где КАОвыс - количество адгезированных объектов при высокой скорости сдвига, КАОниз - количество адгезированных объектов при низкой скорости сдвига.

Активация тромбоцитов при высокой скорости сдвига зависит от реактивности самих кровяных пластинок, а также от содержания в плазме крови и ЭКМ фактора Виллебранда [3, 5]. Однако в предлагаемом методе концентрация фактора Виллебранда в двух сравниваемых пробах крови, а также на ЭКМ, является постоянной и, следовательно, изменение ИСР отражает изменение реактивности кровяных пластинок в плане их чувствительности к сдвиговой регуляции (активации).

Для верификации данного метода нами проведены исследования сдвиговой регуляции функции тромбоцитов в группе здоровых доноров (n=15) мужского пола. Возраст обследуемых - от 18 до 34 лет. Результаты исследований представлены в таблице.

Пример. Донор М. 28 лет. Из локтевой вены получены 5 мл цитратной крови. После 40 минутного выдерживания при комнатной температуре 200 мкл крови помещены в ячейку с ЭКМ, которая установлена в прибор "Cone and Plate Analyser" и проведено исследование при малой (200 с^-1) скорости сдвига. Далее препарат окрашен краской май-грюнвальд 2 мин. Затем в другую ячейку с ЭКМ помещена следующая порция (200 мкл) крови и проведено ее исследование при высокой (1300 с^-1) скорости сдвига. Препарат окрашен краской май-грюнвальд 2 мин. После подсыхания оба препарата анализировались на имидж-анализаторе. Подсчитывались количество адгезированных объектов (КАО) и средний размер адгезированных объектов (СРО). Получены следующие результаты:

КАОвыс=6412; КАОниз=4287;

СРОвыс=42,8 мкм²; СРОниз=22,9 мкм²;

С учетом этих показателей рассчитаны ИСРадг и ИСРагр:

ИСРадг=КАОвыс/КАОниз=6412:4287=1,50

ИСРагр=СРОвыс/СРОниз=42,8:22,9=1,87

Данный тест, благодаря его простоте и быстроте выполнения, может явиться важным дополнительным критерием в оценке функционального состояния тромбоцитов при различных заболеваниях. Кроме того, он может быть использован при исследовании влияния различных фармакологических препаратов и физических факторов на состояние сдвиговой регуляции функции тромбоцитов. При увеличении ИСР делается заключение об усилении (повышении эффективности) сдвиговой регуляции, что является основанием для применения средств, ингибирующих функцию тромбоцитов. Уменьшение ИСР свидетельствует о гипореактивности (понижении эффективности регуляции) кровяных пластинок, что требует применения препаратов, активирующих их функцию.

Источники информации

1. Левтов В.А., Регирер С.А., Шадрина Н.Х. Реология крови. М., Медицина, 1982.

2. Gospodarowich D., Vlodavsky I., Savion N. The extracellular matrix and the control of proliferation of vascular endothelial and smooth muscle cells // J.Supermol. Struct. - 1980. - Vol.13. - P.339-372.

3. Kroll M.H., Hellums J.D., McIntire L.V., Schafer A.I., Moake J.L. Platelets and shear stress // J.Amer.Soc.Hematol. - 1996. - Vol.88. - N.5. - P. 1525-1541.

4. Ross J.M., McIntire L.V. Molecular mechanisms of mural thrombosis under dynamic flow conditions // News in Physiological Sciences. - 1995. - Vol.10. - P.117-122.

5. Ruggeri Z.M. Mechanisms of shear-induced platelet adhesion and aggregation // Thrombosis and Haemostasis. - 1993. - Vol.70, N1. - P.119-123.

6. Shenkman В., Linder N., Savion N., Tamarin I., Dardik R., Kennet G., German В., Varon D. Increased neonatal platelet deposition on subendothelium under flow conditions: the role of plasma von Willebrand factor // Pediatric Research. - 1999. - Vol.45, N 2. - P.270-275.

7. Slack S.M., Cui Y., Turitto V.T. The effect of flow on blood coagulation and thrombosis // Thrombosis and Haemostasis. - 1993. - Vol.70, N1. - P.129-134.