Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh- ii

Классы МПК:A61K38/00 Лекарственные препараты, содержащие пептиды
A61K38/09 гормон высвобождения лютеинизированного гормона (LHRH); относящиеся к нему пептиды
A61K47/34 получаемые иначе, чем реакциями с участием только ненасыщенных углерод-углеродных связей
A61P35/00 Противоопухолевые средства
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):ФЕРРИНГ Б В (NL)
Приоритеты:
подача заявки:
1999-12-02
публикация патента:

Изобретение относится к области клинической фармакологии. Сущность заключается в том, что создана фармацевтическая композиция для пролонгированного высвобождения пептида, обладающего терапевтическим действием, или его соли, где указанный пептид представлен следующей последовательностью: pyroGlu-His-Trp-Ser-Xaa1-Gly-Xaa2-Xaa3-Pro-Gly-NH2, где Хаа1 представляет собой His или Tyr, Хаа2 представляет собой Trp или Leu и Хаа3 представляет собой Tyr или Arg, при условии, что в том случае, когда Хаа1 представляет собой Tyr и Хаа2 представляет собой Leu, Хаа3 не означает Arg, причем композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый биоразлагаемый полимер. Технический результат - расширение арсенала композиций, используемых для лечения заболеваний, связанных с нарушением костей и простаты. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

Рисунки к патенту РФ 2233170

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5

Область техники

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим препаратам, которые высвобождают терапевтическое средство в течение длительного периода времени.

Уровень техники

Исследования физиологии системы гипоталамус-гипофизгонады привели к обнаружению рилизинг-гормона гонадотропина (GnRH, иначе называемого рилизинг-гормоном лютеинизирующего гормона, LHRH), являющегося одним из ключевых регуляторных гормонов. Рилизинг-гормон гонадотропина GnRH выделяется гипоталамусом и воздействует на гипофиз, стимулируя секрецию лютеинизирующего гормона (LH) и фолликулостимулирующего гормона (FSH). Совсем недавно был идентифицирован пептид, гомологичный GnRH (White et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95, 305-309, 1998). Этот пептид был назван GnRH-II. Последовательности двух пептидов приведены ниже для сравнения.

GnRH pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (SEQ ID NО 5)

GnRH-II pyroGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2 (SEQ ID NО 6)

Название "GnRH-II" в некоторой степени вводит в заблуждение. Новый пептид является самостоятельным генным продуктом и заметно отличается от GnRH по своему распределению в тканях. Вероятно, GnRH-II не действует как эндогенный рилизинг-фактор по отношению к LH и FSH. Поскольку не были представлены никакие конкретные данные относительно физиологической роли GnRH-II, никакого внимания практическим аспектам использования этого пептида в качестве терапевтического средства не уделялось.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что GnRH-II играет важную роль в функционировании ряда органов. Например, он воздействует на остеогенез, а также регулирует пролиферацию эпителиальных клеток простаты. В соответствии с этим авторы настоящего изобретения предложили средства, с помощью которых этот агент и его аналоги могли бы быть удобно доставлены к участку, нуждающемуся в лечении, и целью настоящего изобретения явилось создание подходящей композиции для достижения указанной цели. Композиция согласно настоящему изобретению основывается на использовании биоразлагаемого полимера, предназначенного для удерживания пептида в депо, из которого он высвобождается в системный кровоток с контролированной скоростью. Такие композиции включают два ключевых элемента, биологически активный пептид и биоразлагаемый полимер. Биологически активный пептид представляет собой декапептид, представленный следующей последовательностью:

pyroGlu-His-Trp-Ser-Xaa1-Gly-Xaa2-Xaa3-Pro-Gly-NH2 (SEQ ID NO 7)

где Хаа1 представляет собой His или Тyr,

Хаа2 представляет собой Тrр или Leu,

Хаа3 представляет собой Тyr или Аrg,

при условии, что в том случае, когда Хаа1 представляет собой Туr и Хаа2 представляет собой Leu, Хаа3 не означает Аrg. Полимер представляет собой любой фармацевтически приемлемый биоразлагаемый полимер и предпочтительно является сополимером гликолевой и молочной кислот. Настоящее изобретение также включает применение композиции для лечения патологий человека.

Описание чертежа

На чертеже показано влияние повышения доз GnRH-II на концентрацию кальция в сыворотке крови у крыс, подвергнутых овариэктомии.

Описание изобретения

В настоящем описании сокращения, которые относятся к аминокислотам, используются в общепринятом значении и обозначают природный L-изомер (за исключением ахиральной аминокислоты глицин).

В своем первом аспекте предлагаемое изобретение включает фармацевтическую композицию, которая высвобождает пептид, обладающий терапевтическим действием, с контролируемой скоростью в течение продолжительного периода времени (а именно, в течение периода, равного по меньшей мере одному дню, предпочтительно нескольким дням и более предпочтительно по меньшей мере одной неделе), в частности предназначенную для лечения заболеваний кости и простаты. Пептид, обладающий терапевтическим действием, представляет собой декапептид, характеризующийся следующей последовательностью:

pyroGlu-His-Trp-Ser-Xaa1-Gly-Xaa2-Xaa3-Pro-Gly-NH2 (SEQ ID NO 7)

где Хаа1 представляет собой или His, или Тyr,

Хаа2 представляет собой или Тrр, или Leu,

Хаа3 представляет собой или Тyr, или Аrg,

при условии, что в том случае, когда Хаа1 представляет собой Тyr и Хаа2 представляет собой Leu, Xaa3 не означает Аrg. Предпочтительно Хаа1 представляет собой His, Xaa2 представляет собой Тrp, Хаа3 представляет собой Тyr. Следует отметить, что такой пептид может образовывать соли с кислотами (например, такими как уксусная кислота, трифторуксусная кислота, бензойная кислота, хлороводородная кислота, фосфорная кислота и подобные им кислоты). В той степени, в которой такие соли образуются с фармацевтически приемлемыми кислотами, эти соли входят в объем настоящего изобретения.

Вторым существенным компонентом композиции является биоразлагаемый фармацевтически приемлемый полимер. Такие полимеры известны из уровня техники. Они могут представлять собой либо гомополимеры (т.е. полимеры, образованные одним мономером), либо сополимеры (т.е. полимеры, образованные двумя или более различными мономерами). Подходящие мономеры включают амино- и гидроксипроизводные карбоновых кислот. В предпочтительном случае осуществления настоящего изобретения полимер состоит из гидроксиацильных мономерных фрагментов и более предпочтительно из композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170-гидроксиацильных фрагментов. Наиболее предпочтительно, когда полимер представляет собой полимер гликолевой кислоты, полимер молочной кислоты или сополимер гликолевой и молочной кислот. Такой полимер имеет следующую химическую структуру:

композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170

где R представляет собой водород в случае полимера гликолевой кислоты, метил в случае полимера молочной кислоты и расположенные случайным образом водород или метил в сополимере.

Можно отметить два различных метода приготовления композиции, являющейся предметом настоящего изобретения. Пептид может быть либо введен в полимерную матрицу, либо, более предпочтительно, может быть инкапсулирован при помощи полимера. В этом втором случае инкапсулированный пептид может находиться либо в твердом состоянии, либо в жидком состоянии. Предпочтительно, чтобы пептид находился в твердом состоянии.

Такая композиция пригодна для лечения патологий человека, включая нарушения, связанные с новообразованиями кости (включая возрастной остеопороз и остеопороз, связанный с постклимактерическим гормональным статусом, первичный и вторичный гиперпаратиреоидизм, остеопороз вследствие недостаточной нагрузки, остеопороз, связанный с диабетом, и глюкокортикоид-связанный остеопороз) и новообразования простаты (включая доброкачественную гиперплазию простаты и рак простаты).

В своем втором аспекте предлагаемое здесь изобретение включает способ лечения индивидуума, страдающего от нарушения, связанного с новообразованием кости или новообразованием простаты, или индивидуума, который, как полагают, входит в группу риска в отношении указанных заболеваний. Этот способ лечения включает введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей в качестве активного начала пептид, характеризующийся последовательностью

pyroGlu-His-Trp-Ser-Xaa1-Gly-Xaa2-Xaa3-Pro-Gly-NH2 (7)

или его фармацевтически приемлемую соль, где Хаа1, Хаа2, Хаа3 являются такими, как определено выше, а в качестве второго компонента - фармацевтически приемлемый биоразлагаемый полимер, при этом композиция высвобождает пептид в системный кровоток при деградации полимера. Способ лечения может включать однократное введение композиции, но более вероятно включает курс повторяющихся введений композиции. Частота введения может варьироваться от одного раза в день до одного раза в месяц. Количество активного пептида в каждой дозе будет зависеть от планируемой дозировки и способа введения. Как правило, оно находится между 1 мг и 1 г. Практикующий врач сможет определить точную дозу в зависимости от параметров, которые обычно рассматривают как релевантные в данной области техники. Композицию вводят путем внутримышечной или подкожной инъекции.

Пептиды, которые представляют собой активные средства, входящие в композиции согласно настоящему изобретению, могут быть получены методами, в большинстве случаев известными из уровня техники. Например, пептиды могут быть получены твердо-фазным синтезом. Этот метод включает последовательное присоединение аминокислотных остатков к присоединенному к полимерному носителю промежуточному соединению согласно следующей схеме.

1. Образование присоединенного к полимеру первого промежуточного соединения

PG-Aaa-OH + FG-Res - PG-Aaa-L-Res

Ааа означает аминокислоту,

PG означает защитную группу,

FG означает функциональную группу,

Res означает полимер,

L означает группу-линкер (-O- или -NH-).

2. Снятие защиты

PG-Aaa-L-Res - H-Aaa-L-Res.

3. Удлинение цепи

PG-Bbb-OH + H-Aaa-L-Res - PG-Bbb-Aaa-L-Res.

4. Повторение стадий 2 и 3, если это необходимо

PG-Bbb-Aaa-L-Res---PG-Nnn- _ -Bbb-Aaa-L-Res.

5. Отсоединение/снятие защиты

PG-Nnn- _ -Bbb-Aaa-L-Res - H-Nnn- _ -Bbb-Aaa-OH (или -NH2).

На первой стадии защищенная аминокислота взаимодействует с функционализированным полимером. Защитная группа (PG), как правило, представляет собой трет-бутоксикарбонильную (Воc) или 9-флуоренилметилоксикарбонильную (Fmoc) группу. Функциональная группа (FG) полимера, как правило, представляет собой хлоралкильную группу, гидроксильную группу или аминогруппу. В том случае, когда группа FG представляет собой хлоралкильную или гидроксильную группу, группа-линкер (L) представляет собой атом кислорода (-O-). В том случае, когда группа FG представляет собой аминогруппу, L представляет собой -NH-.

На второй стадии защитную группу (PG) снимают с композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170-аминогруппы. В том случае, когда защитная группа PG представляет собой группу Вос, эта процедура может быть осуществлена путем обработки полимера кислотами, например, такими как трифторуксусная кислота или хлороводород в дихлорметане. В том случае, когда защитная группа PG представляет собой Fmoc, снятие защиты может быть осуществлено путем обработки полимера основаниями, например, таким как пиперидин.

На третьей стадии пептидную цепь удлиняют на один аминокислотный остаток. Защищенная аминокислота присоединяется к аминогруппе, высвобожденной на стадии два. Из уровня техники известно множество реагентов для осуществления этого превращения. Одна из комбинаций представляет собой дициклогексилкарбодиимид (DCC) и гидроксибензотриазол (HOBt). Как правило, необходимо также использовать основание. Подходящие основания включают триэтиламин и N,N-диизопропилэтиламин. В качестве растворителя, как правило, используют дихлорметан, диметилформамид или их смесь.

Если в боковых цепях аминокислот (Ааа - Nnn) содержатся реакционноспособные группы (например, аминогруппы, группы карбоновых кислот, гидроксильные группы), то тогда эти группы нуждаются в защите. Защитные группы, которые выбирают для защиты боковой цепи, как правило, являются такими группами, которые стабильны в условиях, необходимых для удаления защитной группы (PG) с композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170-аминогруппы. В том случае, когда защитная группа PG представляет собой группу Fmoc, удобно, чтобы защитная группа для боковой цепи была основана на трет-бутильной структуре. С другой стороны, если защитная группа PG представляет собой группу Вос, защитная группа для боковой цепи может быть основана на флуоренилметильной структуре. Также могут быть использованы другие защитные группы, известные из уровня техники.

На четвертой стадии цикл снятие защиты/удлинение цепи повторяют до тех пор, пока не будет построена необходимая пептидная последовательность.

На пятой стадии пептид, обладающий полной последовательностью, отделяют от полимера. Защитные группы удаляют с боковых цепей либо до, либо после отсоединения от полимера. В том случае, когда группа-линкер L представляет собой -NH-, высвобожденный пептид находится в форме С-концевого амида. В том случае, когда группа-линкер L представляет собой -О-, высвобожденный пептид часто представляет собой С-концевую свободную кислоту и для образования С-концевого амида требуется вторая стадия.

Пептиды также могут быть получены синтезом в жидкой фазе, и это может быть более удобным в том случае, когда необходимо большое количество материала.

Полимеры, необходимые для приготовления композиции, как правило, хорошо известны из уровня техники. Как указывалось ранее, композиция может иметь форму простой дисперсии пептида в полимерной матрице, или пептид может быть представлен микрокапсулированным с помощью полимера. Дисперсия может быть получена смешением пептида (в виде твердого вещества) и полимера до гомогенного состояния, с последующим прессованием смеси с образованием твердой массы. Для того чтобы получить образующую единое целое композицию, может быть необходимо добавление к смеси связующего агента. Затем полученная масса может быть размолота для получения частиц, пригодных для получения суспензии в биологически совместимой жидкости (например, такой как вода или изотонический солевой раствор) и лекарственных препаратов для инъекций.

Микрокапсулированные композиции могут быть получены либо из пептида в твердом состоянии (в виде порошка) или из раствора пептида, в частности из водного раствора. Сначала полимер растворяют в подходящем органическом растворителе. Затем пептид добавляют к этому раствору и смесь энергично перемешивают для того, чтобы диспергировать пептид в органической фазе. Затем добавляют второй органический растворитель. Указанный второй растворитель выбирают для снижения растворимости полимера в органической фазе. Полимер выпадает из раствора с образованием покрытия вокруг частиц твердого пептида (или вокруг капелек диспергированного водного раствора). Полученные микрокапсулы затем отверждают путем промывания для удаления следов органических растворителей. После этого они готовы к суспендированию в подходящей жидкости для введения.

Приведенное выше описание далее уточняется путем приведения ряда примеров. Они предназначены для иллюстрации некоторых аспектов изобретения. Они не предназначены для ограничения объема изобретения каким-либо образом.

Примеры

ПРИМЕР 1. Синтез GnRH-II

1А. Получение связанного с полимером защищенного пептида

pyroGlu-His(Воm)-Trp(CHO)-Ser(Bzl)-His(Воm)-Gly-Trp(CHO)-Туг(Bzl)-Pro-Gly-Ores

Этот пептид получают, используя общепринятый метод твердофазного синтеза, исходя из Boc-Gly-этерифицированного полимера Мэррифильда (Merrifield) (60 г, 1 ммоль/г). Синтез осуществляют в ручном синтезаторе с суммарным объемом растворителя и реагента, равным 300 мл для каждой операции. Известная методика, включающая снятие защиты/промывание/присоединение, представлена в таблице 1.

композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170

Сложные бензотриазолильные эфиры используют в качестве активированных сложных эфиров на всем протяжении синтеза. Их получают из соответствующих защищенных аминокислот путем реакции с 1-гидроксибензотриазолом (1 экв.) и дициклогексилкарбодиимидом (1 экв.). Используемые количества (по отношению к емкости смолы в отношении замещения) приведены в таблице 2.

композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170

После заключительного присоединения полимер промывают дихлорметаном (3х3 л) и высушивают при пониженном давлении при +40композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170С до достижения постоянного веса.

Аминокислотный анализ: данные согласуются с предполагаемым строением последовательности.

1В. Отсоединение и снятие защиты pyroGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2 (6)

Полученный согласно примеру 1А пептид, зафиксированный на полимере, помещают в полотняном мешке в автоклав. После этого автоклав наполняют газообразным аммиаком до конечного давления, равного 4 атм. Через 72 часа избыток аммиака выпускают и полимер экстрагируют уксусной кислотой (3х100 мл) и этанолом (3х100 мл). Объединенные экстракты дегазируют азотом, добавляют 10% палладий, нанесенный на уголь, и смесь перемешивают в атмосфере водорода. После того как реакция заканчивается (как оценивается с помощью метода ВЭЖХ), полученную смесь фильтруют и фильтрат упаривают. Остаток очищают методом ВЭЖХ с обращенной фазой, получая при этом указанное в заглавии соединение.

ПРИМЕР 2. Микрокапсулирование пептида

Используется сополимер D,L-молочной и гликолевой кислот с соотношением молочной и гликолевой кислот, равным 50/50. К раствору этого полимера (3,7 г) в дихлорметане (100 мл), находящемся в реакционном сосуде, снабженном мешалкой, добавляют ацетат GnRH-II (0,15 г, полученный растворением пептида, полученного согласно примеру 1, в уксусной кислоте и лиофилизацией полученного раствора). Смесь перемешивают со скоростью 500 оборотов в минуту, затем в течение 10 минут добавляют силиконовое масло (Dow Corning 360 Medical Fluid®, 45 г). После этого смесь вводят тонкой струей в триглицерид каприловой и каприновой кислот (Miglyol® 812, 3,3 л) при непрерывном перемешивании со скоростью 1000 оборотов в минуту. После того как добавление завершено, перемешивание продолжают в течение 1 часа, затем микрокапсулы собирают фильтрацией, дважды промывают изопропанолом и в заключение высушивают.

ПРИМЕР 3. Анализ влияния GnRH-II и аналогов на популяцию остеогенных клеток ln vitro

(a) Остеобласты человека выделяют из костей, подверженных раку, путем хирургической операции (Nilsson et al., 1995) согласно общепринятой методике, известной из уровня техники. Эксплантат кости измельчают до получения мелкой костной стружки и затем тщательно промывают в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM)/F12 (1:1 Gibco, Paisley, U.K). Эти подобные остеобластам клетки, остеобластные клетки крысы линии МС3Т3-Е1, клональные клетки остеосаркомы человека линии MG-63 (неминерализованные), клетки линии SaOS-2 (минерализованные, остеосаркома) выращивают в среде DMEM:F12, 1:1, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS, Gibco), фунгизона (500 мг/л), гентамицинсульфата (50 мг/л), L-глутамина (2 мМ) и L-аскорбиновой кислоты (100 мг/л) в камере в атмосфере увлажненного СO2 при 37композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170С.

(b) Клетки стромы костного мозга человека выделяют из фрагментов кости и промывают в забуференном фосфатом солевом растворе. Клетки костного мозга собирают и центрифугируют через колонку Ficoll Hypaque (Kimble et al., J.Clin.Invest., 1959-1967, 1994). Клетки образуют осадок на границе раздела фаз, их подсчитывают и высевают в кювету с площадью поверхности 75 см2. Клетки инкубируют в камере в атмосфере увлажненного СO2 при 37композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170С, среду заменяют один раз в неделю. После слияния клетки собирают, используя трипсин и ЭДТА, и пересевают в композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170-минимальную поддерживающую среду (композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170-МЕМ), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS, Gibco), пенициллин (100 Ед/мл), стрептомицин (100 мг/мл), фунгизон и L-глутамин (2 мМ).

(c) Все культуры клеток испытывали недостаток в сыворотке за 48 часов перед добавлением GnRH-I и GnRH-II. Клетки помещались в среду DMEM, не содержащую фенольный красный (для того, чтобы избежать эстрогеноподобные эффекты фенольного красного), содержащую 10% очищенной активированным углем сыворотки, на 48 часов в 12-луночных планшетах. Эффект дозы GnRH-I, GnRH-II и аналогов пептидов исследовали после добавления пептидов в конечной концентрации, варьирующейся от 10-9 до 10-6 М. В качестве контроля использовали 1 мМ дибутирил сАМР. Клетки инкубировали с пептидом в течение 24, 48 и 96 часов, пептид заменяли каждые 24 часа.

(d) Для оценки влияния пептидов на пролиферацию клеток добавляли [3Н]тимидин в количестве 1 мКи/мл дополнительно на 24 часа и оценивали включение [3H]тимидина. Радиоизотопное включение определяли используя сцинтилляционный счетчик, результаты вычислены в виде числа распадов в минуту на мг суммарного белка.

(e) Также определяли экспрессию маркеров дифференцировки остеобластов (Tintut Y. et al., J.Biol.Chem., 273, 7547-7553, 1998). Всю РНК выделяли в несколько стадий перед обработкой, через 24, 48, 72 и 96 часов после добавления пептидов. Экспрессию проколлагена типа I, остеопонтина и 28S РНК (использовали в качестве внутреннего контроля) определяли нозерн-блоттингом. Щелочную фосфатазу, матриксный GLA-белок, остеокластин и GAPDH (в качестве внутреннего контроля) определяли полимеразной цепной реакцией с обратной транскриптазой (RT-PCR) со специфическими праймерами, предназначенными для каждого гена.

Пептиды, являющиеся предметом настоящего изобретения, обладали значительным эффектом при концентрации, меньшей 100 мкМ.

ПРИМЕР 4. Исследование влияния GnRH-II и аналогов на популяцию остеокластов in vitro

(а) Клонированные линии клеток-предшественников остеокластов человека (FLG 29.1) использовали в качестве модели дифференцировки остеокластов in vitro (Gattei V. et al., Cell Growth Differ, 7, 753-763, 1996). В дополнение к этому оценивали миграционные, адгезивные, цитохимические, морфологические и биохимические изменения совместных культур клеток линии FLG 29.1 и остеобластных клеток (SaOS-2). Эффект дозы GnRH-I, GnRH-II и аналогов пептидов исследовали после добавления пептидов к культурам клеток линии FLG 29.1 и к совместным культурам клеток в конечной концентрации, варьирующейся от 10-9 до 10-6 М. В качестве контроля добавляли паратироидный гормон. Оценивали потенцирование (или ингибирование) дифференцировки преостеокластов (слияние клеток в большие многоядерные элементы) и ряд других факторов (Oriandini et al., Cell Tissue Res., 281, 33-42, 1995). А именно, определяли:

1. Позитивное окрашивание при использовании тартрат-резистентной кислой фосфатазы для клеток линии FLG 29.1.

2. Снижение активности щелочной фосфатазы, экспрессируемой клетками линии SaOS-2.

3. Появление типичных ультраструктурных признаков зрелых остеокластов у клеток линии FLG 29.1.

4. Высвобождение в культуральную среду фактора, стимулирующего колонии гранулоцитов-макрофагов.

5. Для оценки влияния пептидов на пролиферацию клеток добавляли [3H]тимидин в количестве 1 мКи/мл дополнительно на 24 часа и определяли включение [3Н]тимидина, как описано выше.

(b) Клетки костного мозга, выделенные из фрагментов кости человека, культивировали в присутствии 10 нМ 1,25-(ОН2) витамина D3 в течение нескольких дней для того, чтобы генерировать многоядерные остеокласты, используя общепринятую методику, известную из предшествующего уровня техники (Takahashi et al., Endocrinol., 122, 1473-1482, 1988). Культуральную среду (композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170-МЕМ) удаляли и заменяли на свежую среду, свободную от фенольного красного, в которую добавлены антибиотики и очищенная 10% активированным углем инактивированная нагреванием эмбриональная сыворотка теленка FCS, и содержащую GnRH-I, GnRH-II или аналоги, и культуры выдерживали еще в течение 24 часов. Всплывшие клетки собирали и остеокласты окрашивали для экспрессии тартрат-резистентной кислой фосфатазы (TRAP), маркера дифференцировки остеокластов (Hughes et al., Nat.Med., 2, 1132-1135, 1996).

1. Клетки инкубируют в 0,2М ацетатном буфере, рН 4,7-5,0, содержащем винную кислоту и 2% нафтол AS-B1 фосфата (растворенный в простом монометиловом эфире этиленгликоля в концентрации 20 мг/мл) в течение 15 минут при 37композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170С. Затем клетки переносят во второй раствор, содержащий тот же самый буфер и винную кислоту в той же концентрации, с добавлением 0,1% параросаноилинхлорида (гексазотированного смешением с равным объемом 4% нитрита натрия в течение 5 минут при комнатной температуре) в течение 10 минут при 37композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170С. Такая обработка приводит к красному цитоплазматическому окрашиванию клеток, экспрессирующих TRAP. Гематоксилин Харриса служит в качестве ядерного сокомпонента окрашивания.

2. Апоптотические многоядерные остеокласты идентифицируют по сильной экспрессии TRAP, большему размеру, чем размер соответствующих жизнеспособных TRAP-позитивных клеток. Для подтверждения апоптоза используют окрашивание акридиновым оранжевым. Жизнеспособные остеокласты подсчитывают после фиксации в 95% этаноле и окрашивания TRAP и гематоксилином, причем количество апоптотических остеокластов выражают как процент от общего числа многоядерных остеокластов (и жизнеспособных, и апоптотических) в каждой лунке с культурой.

Пептиды, являющиеся предметом настоящего изобретения, обладают значительным эффектом при концентрации, меньшей 100 мкМ.

ПРИМЕР 5. Анализ экспрессии GnRH мРНК в популяциях остеогенных клеток и клеток остеокластов.

Суммарную РНК экстрагируют из следующих культур клеток, как описано выше:

1) клетки, подобные остеобластам, выделенные из подверженной раку кости,

2) остеобластные клетки крыс линии МС3Т3-Е1,

3) клетки линии MG-63 (неминерализованные),

4) клетки линии SaOS-2 (минерализованные, остеосаркома),

5) клетки стромы костного мозга человека,

6) предшественники клеток остеокластов человека линии FLG 29.1,

7) многоядерные остеокласты, генерированные из костного мозга.

Экспрессию GnRH-I и GnRH-II определяли полимеразной цепной реакцией с обратной транскриптазой (RT-PCR) с использованием PCR-праймеров, представленных последовательностями SEQ ID №№1-4. Полноту генерированной кДНК определяли путем оценки относительного уровня амплификации актина.

ПРИМЕР 6. Влияние GnRH-II на плотность минерализации кости у крыс, подвергнутых овариэктомии

(а) Крысы-самки линии Sprague Dawley (возраст 8 недель, 200-215 г) были подвергнуты двусторонней овариэктомии (OVX). Животных выдерживали в течение 4 недель после доставки перед началом лечения. Корм для крыс "Purina" (1,00% кальция, 0,61% фосфора) и вода предоставлялись без ограничений. Каждое исследование проводилось с 6 подобранными по весу группами (n=8/группа).

(b) Лечение начинали через 4 недели после OVX. Через 4 недели базисная контрольная OVX-группа была сакрифицирована (группа А). Оставшимся группам крыс вводили один раз в день растворитель (группа В), GnRH-II 1 мкг/кг массы тела (группа С), 10 мкг/кг массы тела (группа D), 100 мкг/кг массы тела (группа Е) и hPTH (1-34)80 мкг/кг массы тела (группа F).

(c) Каждые четыре дня всех крыс взвешивали, и дозировки выбирали таким образом, чтобы получить увеличение среднегрупповой массы на 50 г. Крысы получали через день подкожные инъекции кальцеина (30 мг/кг) или тетрациклина (30 мг/кг) в 2% растворе бикарбоната натрия в физиологическом растворе, в соответствии с показателем минерализации поверхности на 10, 19 и 26 день, с последующим введением лекарства. Плотность минерализации кости определяли методом поглощения рентгеновского излучения двух уровней энергии-DEXA). На 28 день уровень кальция в сыворотке крови определяли колориметрическим методом с использованием коммерческого набора для колориметрии.

(d) Благоприятный исход OVX подтверждали при вскрытии, устанавливая невозможность определить наличие овариальных тканей и путем установления заметной атрофии рогов матки. Обе голени были экзартикулированы до бедра. Левая большая берцовая кость была освобождена от излишнего количества мускулатуры и мягких тканей и помещена в 70% этанол. Переднее возвышение метафиза правой большой берцовой кости снимали лезвием бритвы, только обнажая костный мозг. Как правое бедро, так и правую берцовую кость затем помещали в 10% забуференный фосфатом формалин на 24 часа и переносили в 70% этанол.

У подвергнутых овариэктомии животных, получавших ежедневно 10 и 100 мкг/кг GnRH-II и 80 мкг/кг РТН в течение 28 дней, наблюдалась отчетливо выраженная гиперкальциемия. Полученные результаты приведены на чертеже.

ПРИМЕР 7. Локализация GnRH-II в клетках в парафинированных срезах кости крысы в норме и кости человека в норме

(a) Замороженные и/или парафинированные срезы кости крысы и кости человека фиксировали в течение 3-36 часов, в зависимости от размера (3-5 часов при комнатной температуре, затем примерно 24 часа при 4композиция контролированного высвобождения, включающая gnrh-  ii, патент № 2233170С) и затем вымачивали в 0,1М Tris+5% ЭДТА (12,11 г + 50 г ЭДТА), рН 7,3, до достижения декальцификации.

(b) Затем срезы подвергали окрашиванию с антителами (поликлональные антитела кролика к GnRH-II), используя общепринятые методики.

Окрашивание с GnRH-II наблюдали в случае тромбоцитов, мегакариоцитов в культуральных планшетах (особенно в случае пролиферирующих хондроцитов). Некоторое окрашивание также наблюдалось в случае костеобразующих клеток, в частности для активных остеобластов, а также в случае молодых остеоидов.

Пример 1 демонстрирует получение пептидов, используемых согласно настоящему изобретению, которые могут быть использованы для получения композиций таким образом, как показано в примере 2. Примеры от 3 до 7 иллюстрируют биологическую активность пептидов, представляющих интерес. Предполагается, что объем изобретения ни в коей мере не ограничивается приведенными примерами. В частности, необходимо понимать, что может быть приготовлено множество различных композиций контролированного высвобождения, содержащих эти пептиды, при варьировании полимера и/или физической природы комбинируемых пептида и полимера. Однако такие вариации приведут к получению композиций с эквивалентными биологическими свойствами и, как предполагается, будут входить в объем изобретения в том виде, как он представлен следующей формулой изобретения.

SEQ ID NO 1-4, на которые дается ссылка в примере 5, являются следующими:

CTG CAG CTG ССТ GAA GGA С (1)

GGG CGG GGC GGG GCT CTC G (2)

АТТ СТА CTG ACT TGG TGC GTG (3)

GGA ATA TGT GCA ACT TGG TGT (4)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Фармацевтическая композиция пролонгированного высвобождения пептида, обладающего терапевтическим действием, или его соли, где пептид представлен следующей последовательностью:

pyroGlu-His-Trp-Ser-Xaa1-Gly-Xaa2-Xaa3-Pro-Gly-NH2,

где Хаа1 представляет собой His или Туr;

Хаа2 представляет собой Тrр или Leu;

Хаа3 представляет собой Туr или Arg,

при условии, что в том случае, когда Хаа1 представляет собой Туr и Хаа2 представляет собой Leu, Хаа3 не означает Arg,

и где композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый биоразлагаемый полимер.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой пептид представляет собой

pyroGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2.

3. Композиция по п.1, в которой полимер представляет собой полимер гидроксипроизводного карбоновой кислоты или сополимер таких производных.

4. Композиция по п.3, в которой полимер представляет собой полимер гликолевой кислоты, полимер молочной кислоты или сополимер молочной и гликолевой кислот.

5. Композиция по п.1, в которой пептид является микрокапсулированным с помощью полимера.

6. Композиция по любому из пп.1-5 для лечения или для профилактики нарушений, связанных с новообразованиями кости или с новообразованиями простаты.

7. Композиция по п.6 для лечения или для профилактики нарушений, выбранных из группы, включающей возрастной остеопороз, остеопороз, связанный с постклимактерическим гормональным статусом, первичный и вторичный гиперпаратиреоидизм, остеопороз вследствие недостаточной нагрузки, остеопороз, связанный с диабетом, глюкокортикоид-связанный остеопороз, доброкачественную гиперплазию простаты и рак простаты.

8. Способ получения лекарственного средства пролонгированного высвобождения, предназначенного для лечения или для профилактики нарушений, связанных с новообразованиями кости или с новообразованиями простаты, включающий объединение пептида или его соли, определенных в п.1 или 2, с фармацевтически приемлемым биоразлагаемым полимером.

9. Способ по п.8, где указанный полимер представляет собой [a] полимер гидроксипроизводного карбоновой кислоты или сополимер таких производных, или [b] полимер гликолевой кислоты, полимер молочной кислоты или сополимер молочной и гликолевой кислот.

10. Способ по п.8 или 9, где указанное нарушение выбирают из группы, включающей возрастной остеопороз, остеопороз, связанный с постклимактерическим гормональным статусом, первичный и вторичный гиперпаратиреоидизм, остеопороз вследствие недостаточной нагрузки, остеопороз, связанный с диабетом, глюкокортикоид-связанный остеопороз, доброкачественную гиперплазию простаты и рак простаты.

11. Способ лечения состояний и заболеваний человека, который включает введение индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества композиции пролонгированного высвобождения пептида по п.1 или 2.

12. Способ лечения или профилактики нарушений, связанных с новообразованиями кости или с новообразованиями простаты у человека, который включает введение индивидууму, нуждающемуся в таком лечении или профилактике, терапевтически эффективного количества композиции по любому из пп.1-5.

13. Способ по п.12, в котором указанное нарушение выбирают из группы, включающей возрастной остеопороз, остеопороз, связанный с постклимактерическим гормональным статусом, первичный и вторичный гиперпаратиреоидизм, остеопороз вследствие недостаточной нагрузки, остеопороз, связанный с диабетом, глюкокортикоид-связанный остеопороз, доброкачественную гиперплазию простаты и рак простаты.

Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A61K38/00 Лекарственные препараты, содержащие пептиды

Патенты РФ в классе A61K38/00:
способ лечения рака толстой кишки -  патент 2529831 (27.09.2014)
внутрижелудочковая доставка ферментов при лизосомных болезнях накопления -  патент 2529830 (27.09.2014)
стабильные составы бортезомиба -  патент 2529800 (27.09.2014)
композиции для усиления антибактериальной активности миелопероксидазы и способы их применения -  патент 2529799 (27.09.2014)
способ лечения больных с синдромом внутрипеченочной портальной гипертензии -  патент 2529414 (27.09.2014)
фармацевтическое средство, содержащее эпитопные пептиды hig2 и urlc10, для лечения рака, способы и средства для индукции антигенпрезентирующей клетки и цитотоксического т-лимфоцита (цтл), антигенпрезентирующая клетка и цтл, полученные таким способом, способ и средство индукции иммунного противоопухолевого ответа -  патент 2529373 (27.09.2014)
модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения -  патент 2529034 (27.09.2014)
лейколектины и их применение -  патент 2528860 (20.09.2014)
модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)
применение пептида актг (4-7)-пгп гепатопротекторного воздействия -  патент 2528741 (20.09.2014)

Класс A61K38/09 гормон высвобождения лютеинизированного гормона (LHRH); относящиеся к нему пептиды

Патенты РФ в классе A61K38/09:
модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения -  патент 2529034 (27.09.2014)
способ выбора тактики лечения местно-распространенного рака предстательной железы -  патент 2524309 (27.07.2014)
композиции пептидов и способы их получения -  патент 2517135 (27.05.2014)
лечение метастатической стадии рака предстательной железы дегареликсом -  патент 2504394 (20.01.2014)
способ лечения рака предстательной железы антагонистом гонадотропин-высвобождающего гормона (gnrh) дегареликсом -  патент 2504393 (20.01.2014)
подкожные имплантанты, содержащие устойчивый к деградации полимер полилактид -  патент 2451519 (27.05.2012)
способ профилактики гормонорезистентности при гиперплазии эндометрия -  патент 2445962 (27.03.2012)
композиция пролонгированного действия и способ получения указанной композиции -  патент 2434644 (27.11.2011)
твердая композиция пролонгированного действия, содержащая ацетат трипторелина -  патент 2399384 (20.09.2010)
молекулярный конъюгат на основе синтетических аналогов люлиберина и его применение в качестве средства доставки днк в клетки гормон-чувствительных опухолей (варианты) -  патент 2377247 (27.12.2009)

Класс A61K47/34 получаемые иначе, чем реакциями с участием только ненасыщенных углерод-углеродных связей

Патенты РФ в классе A61K47/34:
способ лечения атрофической возрастной макулярной дегенерации -  патент 2521338 (27.06.2014)
имплантат октреотида, содержащий высвобождающее вещество -  патент 2521291 (27.06.2014)
композиции и устройства -  патент 2519329 (10.06.2014)
усовершенствование всасывания терапевтических средств через слизистые оболочки или кожу -  патент 2519193 (10.06.2014)
перфторуглеродный кровезаменитель - газотранспортный заменитель донорской крови: состав и средство лечения -  патент 2518313 (10.06.2014)
способ получения микрокапсул лекарственных препаратов группы цефалоспоринов в полудане -  патент 2514111 (27.04.2014)
способы и композиции, содержащие клонидин, предназначенные для лечения послеоперационной боли -  патент 2510263 (27.03.2014)
усилитель чрескожного всасывания и трансдермальный препарат с его использованием -  патент 2504363 (20.01.2014)
фармацевтические композиции -  патент 2504360 (20.01.2014)
трехфункциональные блоксополимеры этиленоксида и пропиленоксида для доставки активных веществ в живые клетки -  патент 2501570 (20.12.2013)

Класс A61P35/00 Противоопухолевые средства

Патенты РФ в классе A61P35/00:
способ лечения рака толстой кишки -  патент 2529831 (27.09.2014)
способ оценки эффекта электромагнитных волн миллиметрового диапазона (квч) в эксперименте -  патент 2529694 (27.09.2014)
новые (поли)аминоалкиламиноалкиламидные, алкил-мочевинные или алкил-сульфонамидные производные эпиподофиллотоксина, способ их получения и их применение в терапии в качестве противораковых средств -  патент 2529676 (27.09.2014)
производные 1, 2-дигидроциклобутендиона в качестве ингибиторов фосфорибозилтрансферазы никотинамида -  патент 2529468 (27.09.2014)
фармацевтическое средство, содержащее эпитопные пептиды hig2 и urlc10, для лечения рака, способы и средства для индукции антигенпрезентирующей клетки и цитотоксического т-лимфоцита (цтл), антигенпрезентирующая клетка и цтл, полученные таким способом, способ и средство индукции иммунного противоопухолевого ответа -  патент 2529373 (27.09.2014)
модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения -  патент 2529034 (27.09.2014)
модулирующие jak киназу хиназолиновые производные и способы их применения -  патент 2529019 (27.09.2014)
лечение опухолей с помощью антитела к vegf -  патент 2528884 (20.09.2014)
способ лечения местнораспространенного неоперабельного рака поджелудочной железы -  патент 2528881 (20.09.2014)
новые бензолсульфонамидные соединения, способ их получения и применение в терапии и косметике -  патент 2528826 (20.09.2014)

Наверх