фрагмент с-пептида человеческого проинсулина

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция, включающая (a) пептид, представляющий фрагмент С-пептида человеческого проинсулина, причем указанный пептид включает последовательность ELGGGPGAG (ПОСЛ. ID NO.2) или ее фрагмент или последовательность EGSLQ (ПОСЛ. ID NO.3) или ее фрагмент и обладает способностью стимулировать активность Na⁺K⁺ATФaзы, или (b) пептид длиной до 25 аминокислот, включающий последовательность ELGGGPGAG (ПОСЛ. ID NO.2) или EGSLQ (ПОСЛ. ID NO.3) и обладающий способностью стимулировать активность Na⁺K⁺ATФaзы, или (c) пептид, включающий последовательность ELGGGPGAG (ПОСЛ. ID NO. 2) или EGSLQ (ПОСЛ. ID NO.3) и одну или две дополнительные последовательности аминокислот, фланкирующие N и/или С конец последовательности ID NO.2 или ID NO.3, при условии, что любая указанная фланкирующая последовательность является ненативной к С-пептиду человеческого проинсулина, причем указанный пептид обладает способностью стимулировать активность Na⁺K⁺ATФaзы, вместе с, по крайней мере, одним фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой пептид имеет последовательность ELGGGPGAG (ПОСЛ. ID NO.2) или EGSLQ (ПОСЛ. ID NO.3) или ее фрагмент.

3. Фармацевтическая композиция по п. 2, в которой указанный фрагмент выбран из ELGG (ПОСЛ. ID NO.4) (пептид В), ELGGGP (ПОСЛ. ID NO.5) (пептид С), GGPGA (ПОСЛ. ID NO.6) (пептид D) и GSLQ (ПОСЛ. ID NO.7) (пептид F).

4. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой пептид имеет последовательность LALEGSLQ (ПОСЛ. ID NO.12), ALEGSLQ (ПОСЛ. NO.13) или LEGSLQ (ПОСЛ. ID NO.14).

5. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, в которой указанный пептид или фрагмент имеет длину 2-25 аминокислот.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, в которой указанный пептид или фрагмент имеет длину 2-9 аминокислот.

7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-6, дополнительно включающая, по крайней мере, один дополнительный активный агент, эффективный для борьбы с диабетом или диабетическими осложнениями.

8. Фармацевтическая композиция по п.7, в которой указанным дополнительным активным агентом является инсулин.

9. Способ борьбы с диабетом или диабетическими осложнениями или стимулирования активности Na⁺K⁺ATФaзы, включающий введение указанному пациенту пептида или фрагмента, определенного в любом из пп.1-6.

10. Способ по п.9, дополнительно включающий введение инсулина.

11. Способ по п. 9 или 10 для лечения диабета типа 1, необязательно с нефропатией, нейропатией или ретинопатией, или для торможения развития поздних диабетических осложнений.

12. Продукт, содержащий пептид, его фрагмент, определенные в любом из пп. 1-6, вместе с, по крайней мере, одним дополнительным активным агентом, эффективным для борьбы с диабетом или диабетическими осложнениями, в виде комбинированного препарата, полезный для одновременного, раздельного или последовательного использования в борьбе с диабетом и/или диабетическими осложнениями.

13. Пептид, имеющий последовательность ELGGGPGAG (ПОСЛ. ID NO.2) или ее фрагмент и обладающий способностью стимулировать активность Na⁺K⁺ATФaзы, но не включающий GGPG.

14. Пептид по п.13, выбранный из ELGGGPGAG (ПОСЛ. ID NO.2), ELGG (ПОСЛ. ID NO.4) (пептид В), ELGGGP (ПОСЛ. ID NO.5) (пептид С), GGPGA (ПОСЛ. ID NO. 6) (пептид D), GGGPGAG (ПОСЛ. ID NO. 8), GGGPG (ПОСЛ. ID NO. 9), GGGP (ПОСЛ. ID NO.10) или GGP.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение касается фрагментов С-пептида инсулина и их использования в лечении диабета и диабетических осложнений. Пациенты с инсулинзависимым сахарным диабетом (ИЗСД), известным также как диабет 1-го типа, не могут обходиться без терапии инсулином. ИЗСД является классической, опасной для жизни формой диабета, прорыв в лечении которого связан с открытием инсулина в 1922 году. Частота заболеваемости ИЗСД в странах Европы, Северной Америки и Японии составляет 0,25-0,4% населения. Существует сезонная зависимость заболеваемости ИЗСД, с преобладанием больных в осенне-зимний период. Мужчины болеют ИЗСД несколько чаще, но с возрастом это различие становится менее заметным.

Классическими симптомами ИЗСД в его острой фазе являются жажда, полиурия, утомляемость и потеря веса. С меньшей частотой и выраженностью встречаются такие симптомы, как мышечные судороги, кожные инфекции, затуманенное зрение. На более поздних стадиях могут наблюдаться тошнота и рвота, что свидетельствует об угрозе развития кетоацидоза и комы. Продолжительность симптомов невелика и составляет обычно не более 2-3 недель. У больных наблюдается высокая концентрация глюкозы и кетоновых тел в крови и моче, а уровень инсулина снижен или не обнаруживается.

Этиология ИЗСД мультифакториальна, но чаще всего включает генетическую предрасположенность к аутоиммунной реактивности в сочетании с запускающими факторами окружающей среды, возможно через вирусную инфекцию, результатом чего является частичное или полное разрушение бета-клеток поджелудочной железы. Процесс разрушения бета-клеток может продолжаться 6-12 месяцев до первых проявлений заболевания. Таким образом, в острой фазе ИЗСД доминирующим патофизиологическим механизмом является дефицит инсулина.

После начала инсулинотерапии многим больным достаточно лишь небольших доз инсулина для поддержания должного уровня глюкозы в крови. Ранняя фаза, так называемый "медовый месяц", которая может продолжаться от нескольких месяцев до года, возможно, отражает частичное восстановление функционирования бета-клеток. Это, однако, лишь временная стадия, и в конечном итоге прогрессирующее аутоиммунное разрушение бета-клеток ведет к увеличению потребности в экзогенном инсулине.

Хотя начальные проявления гипоинсулинемии в острой фазе ИЗСД могут успешно регулироваться введением инсулина, дальнейшее естественное течение ИЗСД омрачено появлением у многих больных потенциально серьезных осложнений. Они включают специфические диабетические проблемы, такие как нефропатия, ретинопатия и нейропатия. Такие состояния часто связывают с микроваскуляторными осложнениями, хотя они и не являются единственной причиной. Также может развиться атеросклероз крупных артерий, особенно коронарных и артерий нижних конечностей.

Нефропатия развивается приблизительно у 35% больных ИЗСД, особенно у мужчин и пациентов, заболевших в возрасте до 15 лет. Диабетическая нефропатия характеризуется стойкой альбуминурией, возникающей вследствие повреждения клубочковых капилляров, прогрессирующим снижением уровня клубочковой фильтрации и, в конечном итоге, развитием терминальной стадии почечной недостаточности.

Диабетическая ретинопатия наиболее часто встречается у больных с возникновением ИЗСД в молодом возрасте, и ее частота увеличивается по мере течения заболевания. Пролиферативная ретинопатия встречается приблизительно у 25% больных спустя 15 лет и у 50% и свыше спустя 20 лет течения заболевания. Самым ранним проявлением диабетической ретинопатии является утолщение базальной капиллярной мембраны, затем следует расширение капилляров, повышение их проницаемости и формирование микроаневризм. В дальнейшем происходит окклюзия сосудов сетчатки, в результате которой возникает гипоперфузия участков сетчатки, отек, кровоизлияние и формирование новых сосудов с прогрессирующей потерей зрения.

Диабетическая нейропатия включает широкий спектр нарушений соматической и автономной нервной функции. Сенсорная нейропатия может вызывать прогрессирующую потерю чувствительности или, альтернативно, приводить к неприятным ощущениям, частым болям в ногах и ступнях. Двигательная нейропатия обычно сопровождается мышечной атрофией и слабостью. Биопсия нервов обычно выявляет дегенерацию аксонов, демиелинизацию и нарушения иннервации сосудов. Нейрофизиологические исследования обнаруживают снижение скорости проводимости двигательных и чувствительных нервов. Автономной нейропатией страдают около 40% больных с продолжительностью ИЗСД более 15 лет. При этом могут развиваться нарушения терморегуляции, импотенция и дисфункция мочевого пузыря, с дальнейшим нарушением кардиоваскулярных рефлексов. Поздние проявления могут включать генерализованные нарушения потоотделения, постуральную гипотонию (ортостатический коллапс), желудочно-кишечные нарушения, и сниженное субъективное восприятие гипогликемии. Последний симптом имеет неблагоприятный клинический прогноз.

Было разработано несколько теорий, рассматривающих возможный(ые) механизм(ы), вовлеченные в патогенез различных диабетических осложнений (1). Важную роль могут играть метаболические факторы, и последние исследования показывают, что хороший контроль метаболизма сопровождается значительным снижением частоты осложнений всех типов (2). Тем не менее, через 7-10 лет успешного контроля метаболизма у 15-25% больных появляются симптомы начинающейся нефропатии, 10-25% имеют симптомы ретинопатии и у 15-20% больных обнаруживается снижение скорости проводимости нервной ткани, что указывает на нейропатию. При дальнейшем течении заболевания частота осложнений увеличивается.

С-пептид является частью молекулы проинсулина, которая в свою очередь является предшественником инсулина, образуемым в бета-клетках поджелудочной железы. Человеческий С-пептид является пептидом, состоящим из 31 аминокислоты со следующей последовательностью: EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ. (ПОСЛ ID. 1). В ЕР 132769 было предложено, что для лечения диабета может быть использован С-пептид, а в SE 460334 - что для лечения диабета и для предотвращения его осложнений может использоваться инсулин в сочетании с С-пептидом.

В последние годы стало очевидно, что диабет 1 типа сопровождается стойким снижением активности фермента Nа⁺K⁺AТФазы в некоторых тканях, таких как почечные клубочки, сетчатка, периферические нервы, сердце и скелетная мускулатура (3,4,5). Nа⁺K⁺АТФаза является ферментом, располагающимся в клеточной мембране и вырабатывающим энергию как для межклеточного транспорта Na⁺ и К⁺, так и для всех входящих и выходящих субстратов во всех клетках млекопитающих. Таким образом, очевидно, что активность этого фермента имеет фундаментальное значение для нормального функционирования клеток. Весьма вероятно, что недостаточная Nа⁺K⁺АТФазная активность нервной ткани, почечных клубочков и сетчатки является важным патогенетическим фактором в развитии диабетической нейропатии, нефропатии и ретинопатии. Nа⁺K⁺АТФазная активность регулируется концентрацией Na⁺ и действием гормонов; некоторые гормоны стимулируют (тироидный гормон, норадреналин, ангиотензин, нейропептид Y, инсулин) или ингибируют (допамин, ANF) ферментативную активность (6). Несмотря на адекватную инсулинотерапию, обеспечивающую хороший гликемический контроль, у больных с диабетом 1-ого типа впоследствии появляются признаки недостаточной Nа⁺K⁺АТФазной активности.

Настоящее изобретение основано на открытии группы пептидов из средней части и С-конечной части молекулы С-пептида, которые характеризуются высокой способностью стимулировать Nа⁺K⁺ТФазную активность. Все эти пептиды являются небольшими фрагментами молекулы С-пептида. С-пептид сам по себе стимулирует Nа⁺K⁺ТФазу путем активации G-белка, увеличивает концентрацию внутриклеточного Са²⁺ и активирует протеинфосфатазу 2В (7). Однако стимулирующее действие на Nа⁺K⁺ТФазную активность более коротких пептидов является таким же или более высоким, чем самого С-пептида. Существуют свидетельства как in vitro так и in vivo, подтверждающие, что введение одного из этих пептидов на фоне регулярной инсулинотерапии улучшает функцию почек, вызывает регресс ранних проявлений ретинопатии и улучшает функционирование соматической и автономной нервной системы. Лечение этими специфическими пептидами, не обязательно в сочетании с обычной инсулинотерапией, полезно таким образом для предотвращения или существенного замедления развития поздних осложнений диабета. Возможное преимущество малых пептидов над С-пептидом заключается в том, что они могут вводиться орально, а не инъекционно, как в случае С-пептида и инсулина.

Один аспект данного изобретения состоит в том, что предложен пептид, являющийся фрагментом человеческого С-пептида инсулина, указанный пептид включает последовательность ELGGGPGAG (ПОСЛ. ID 2) (в дальнейшем "пептид А") либо его фрагмент, или последовательность EGSLQ (ПОСЛ. ID 3) (в дальнейшем "пептид Е") либо его фрагмент, и способен стимулировать Nа⁺K⁺ТФазную активность.

Более конкретно, настоящее изобретение предоставляет пептид с последовательностью ELGGGPGAG (ПОСЛ. ID. 2) или EGSLQ (ПОСЛ. ID 3), либо их фрагменты.

Особенностью данного изобретения является то, что оно предоставляет такие пептиды для использования в терапии, и, более конкретно, для использования в борьбе с диабетом и его осложнениями.

Другой аспект данного изобретения заключается в том, что оно предоставляет фармацевтическую композицию, включающую пептид изобретения или его фрагмент, описанные выше, и, по крайней мере, один фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

Следующий аспект данного изобретения заключается в том, что оно предоставляет использование пептида изобретения или его фрагмента, описанных выше, в производстве лекарственного средства для борьбы с диабетом или его осложнениями.

Термин "борьба", используемый здесь, означает как лечение, так и профилактику.

Настоящее изобретение таким образом относится к использованию следующих пептидов, каждый из которых является фрагментом С-пептида: Пептид А (аминокислотная последовательность ELGGGPGAG) (ПОСЛ. ID 2) или его компоненты, например Пептид В (ELGG) (ПОСЛ. ID 4), Пептид С (ELGGGP) (ПОСЛ. ID 5) или Пептид D (GGPGA) (ПОСЛ. ID 6). Дополнительно изобретение включает Пептид Е (EGSLQ) (ПОСЛ. ID 3) и его части, например, Пептид F (GSLQ) (ПОСЛ. ID 7). Все они предназначены для производства лекарственных средств для лечения диабета 1-го типа.

Было доказано, что фрагменты изобретения в широкой степени стимулируют Nа⁺K⁺АТФазную активность. Так, исследования на клетках почечных канальцев in vitro показывают, что Пептиды A-D стимулируют Nа⁺K⁺АТФазную активность в такой же степени, как и целая молекула С-пептида. До 90% эффекта достигается в течение 3 минут. Кроме того, пептиды Е и F обладают стимулирующим действием на Nа⁺K⁺ТФазную активность почечных клеток, сравнимым или более высоким, чем действие целой молекулы. Результаты стимуляции ферментной активности при комбинации пептидов A-D с пептидом Е или F оказались более высокими, чем при действии этих пептидов в отдельности. Более подробные примеры стимулирующего действия вышеуказанных пептидов смотрите ниже в Примере 1.

С-пептид способен специфически связываться с поверхностью некоторых типов клеток, особенно клеток почечных канальцев и фибробластов. Когда флуоресцентно меченый С-пептид инкубируют с клетками, он связывается с их поверхностью. Специфичность связывания иллюстрируется тем, что предварительная инкубация немеченным С-пептидом препятствует связыванию флуоресцентно меченного С-пептида. При проведении предварительной инкубации с фрагментами изобретения, особенно с фрагментом Е или F, было найдено, что фрагменты препятствуют связыванию флуоресцентно меченых С-пептидов, что демонстрирует специфическое связывание фрагментов с теми же участками на поверхности клеток, что и самого С-пептида. Более детальные примеры связывания фрагмента Е смотрите ниже в Примере 28.

Как упоминалось выше, изобретение охватывает не только пептиды, включающие последовательность А и Е, но и их фрагменты. В случае нонапептида А длина таких фрагментов может составлять от 8 до 2-х аминокислот. В случае пентапептида пептида Е длина таких фрагментов может составлять от 4 до 2-х аминокислот. Примеры фрагментов В, С и D (для пептида А) и F (для пептида Е) приведены выше, но включены также и другие фрагменты.

Что касается пептида А, некоторые исследования Nа⁺K⁺АТФазной активности, касающиеся способности фрагментов пептида стимулировать активность Nа⁺K⁺АТФазы сегментов почечных канальцев у крыс, показали, что важное значение могут иметь один или несколько центральных триглициновых остатков, предпочтительные пептидные фрагменты, когда речь идет о пептиде А, включают, по крайней мере, один и более, предпочтительно, два центральных триглициновых остатка. Таким образом, помимо пептидов В, С и D, о которых упоминалось выше, показательными примерами других фрагментов пептидов могут быть GGGPGAG (ПОСЛ. ID 8), GGGPG (ПОСЛ. ID 9), GGGP (ПОСЛ. ID 10), GGP и GGPG (ПОСЛ. ID 11).

Далее было обнаружено, что пептиды, как, например, дипептид D-LG или D, L-LG, содержащие неприродные изомеры D-аминокислот, также могут быть активными. Таким образом, в область изобретения входят и "неприродные" (ненативные) изомеры "природных" (нативных) L-аминокислотных С-пептидных последовательностей. Что касается пептида А, полагают, что присутствие, по крайней мере, одного (в случае D-пептида) или двух (в случае L-пептида) центральных триглициновых остатков может быть важным в пептидных сегментах, состоящих из 9 или меньше аминокислот.

В случае пептида Е, наглядным примером фрагментов являются не только тетрапептид, пептид F, но также и SLQ и LQ. Полагают, что С-терминальный Q остаток может играть важную роль. Аналогичным образом ненативные изомеры или производные пептидов, например пептидов, включающих D-аминокислоты, также включены в объем изобретения.

В изобретение включены пептиды, имеющие последовательности пептидов А и Е. Таким образом, в объем изобретения входят пептиды, имеющие N- и / или С-терминальную структуру, или фланкирующие последовательности, по отношению к последовательностям пептидов А и С. Такие пептиды могут включать дополнительные аминокислоты, которыми могут быть кислоты, замещающие соответствующее положение в фрагменте С-пепида человеческого проинсулина или являться другими аминокислотами (за исключением, разумеется, случаев, при которых происходит перестройка всего инсулин С-пептида). Длина таких "удлиненных" пептидов может варьироваться, но предпочтительно длина пептидов изобретения составляет не более, чем 25 или 20, особенно предпочтительно, но не более чем 15 или 10 аминокислот. Примерами пептидов являются окта-, гепта- или гекса- пептиды, включающие последовательность пептида Е, например, LALEGSLQ (ПОСЛ. ID 12), ALEGSLQ (ПОСЛ. ID 13) и LEGSLQ.(ПОСЛ. ID 14).

Пептиды, относящиеся к изобретению, могут быть использованы для лечения диабета и его осложнений, а именно диабета 1-го типа и его осложнений. Используемый здесь термин "диабетические осложнения" подразумевает все осложнения, известные в данной области, которые связаны с разными формами диабета. Не вдаваясь в теорию, на основании вышеизложенного будем считать, что полезность пептидов связана с их способностью стимулировать Na⁺K⁺ATФaзнyю активность.

В соответствии с другим аспектом изобретения предлагаются пептиды и их применение для изготовления лекарственного средства для использования в стимуляции Nа⁺K⁺АТФазной активности у больных.

Na⁺K⁺ATФaзнaя активность может быть свободно проанализирована с помощью методов, известных специалистам и описанных в литературе, и таким образом можно легко определить стимулирующее действие пептидов на Na⁺K⁺ATФaзнyю активность (например, см. ссылку 7).

Таким образом, пептиды могут использоваться для производства лекарственного сырья для стимуляции Na⁺K⁺ATФaзнoй активности с целью лечения больных диабетом 1-го типа с ретинопатией, для лечения больных диабетом 1-го типа с нефропатией, с целью лечения больных диабетом 1-го типа с нейропатией, и для замедления развития поздних осложнений диабета. Лекарственное средство может включать инсулин. Изобретение относится также к способу лечения или предотвращения (или профилактики) вышеупомянутых состояний.

Пептиды, относящиеся к изобретению, могут использоваться отдельно или в сочетании, и таким образом может приготавливаться фармацевтическая композиция или лекарственное средство, включающее один или несколько пептидов. Как упоминалось выше, наблюдался синергизм между пептидом А или пептидами на основе пептида А или его производных с одной стороны ("группа пептида А"), и пептидом Е или пептидами на его основе или его производных - с другой ("группа пептида Е"). Таким образом, синергические сочетания пептида из группы А с пептидом из группы Е представляет предпочтительную реализацию изобретения.

Пептиды также могут использоваться в комбинации или сочетании с другими активными или эффективными агентами для лечения диабета и/или его осложнений. Таким другим активным агентом может быть, например, инсулин.

При такой "комбинационной" терапии пептид(ы) и другой активный агент могут вводиться вместе в одной и той же композиции или раздельно в виде отдельных композиций одновременно или последовательно.

Дальнейший аспект изобретения также предоставляет продукт, содержащий пептид согласно изобретению или его фрагмент, определенные выше с дополнительным активным агентом, эффективным в борьбе с диабетом или его осложнениями в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного использования в борьбе с диабетом и/или его осложнениями. Предпочтительно таким дополнительным активным агентом является инсулин.

При такой комбинированной терапии с использованием инсулина следует понимать, что термин "инсулин" охватывает все формы, типы и производные инсулина, которые могут использоваться в лечении, т.е. синтетические, модифицированные или усеченные варианты активных последовательностей человеческого инсулина.

Композиции согласно изобретению могут вводиться орально или парентерально подкожным, внутримышечным или внутривенным путем. Композиции данного изобретения состоят из активных фрагментов/пептидов молекулы С-пептида (например, Пептиды А-F) вместе с фармацевтически приемлемым для них носителем и, необязательно, другими терапевтическими ингредиентами, например, человеческим инсулином. Общее количество активных ингредиентов в композиции варьирует от 99,99 до 0,01 процента веса. Носитель должен быть приемлем с точки зрения совместимости с другими компонентами композиции и не являться вредным для реципиента.

Композиции могут формироваться (т.е. приготавливаться в виде готовой формы) в соответствии с технологией и процедурами, хорошо известными в данной области и широко описанными в литературе, и могут включать любые из известных носителей, разбавителей и эксципиентов. Так, например, композиции данного изобретения, подходящие для парентерального введения, включают стерильные водные растворы и/или суспензии фармацевтически активных ингредиентов (например, пептидов A-F), предпочтительно сделанные изотоническими по отношению к крови реципиента; обычно с использованием хлорида натрия, глицерина, глюкозы, маннита, сорбита или подобных веществ. Кроме того, композиции могут содержать любой из ряда адъювантов, таких как буферы, консерванты, диспергирующие агенты, агенты, способствующие быстрому началу действия или увеличению продолжительности действия, и т.п.

Композиции изобретения, подходящие для орального применения, могут, например, включать активные фрагменты/пептиды молекулы С-пептида (например, пептидов A-F) в виде стерильного очищенного готового порошка, предпочтительно покрытого защитной пленкой или пленками (энтерокапсулы) для защиты от разрушения (декарбоксилирования или гидролиза) активных пептидов в желудке и тем самым обеспечения возможности абсорбции этих веществ из десны или в тонкой кишке. Пленка(и) может содержать любой из ряда адъювантов, таких как буферы, консервирующие агенты, агенты, которые способствуют более длительному или быстрому высвобождению, создавая оптимальную биодоступность композиций изобретения и т.п.

Кроме того, к данному изобретению относятся все непептидные соединения, обладающие таким же стимулирующим эффектом, как и их аналоги - производные С-пептида. Такие пептидомиметики, или "небольшие молекулы", способные имитировать активность природных белков или пептидов, по всей вероятности, лучше годятся, например, для перорального введения благодаря своей высокой химической стабильности (8, 9).

Сейчас достаточно распространено заменять пептиды или активные агенты белковой природы, например терапевтические пептиды, такими пептидомиметиками с функционально эквивалентной активностью. Существуют различные молекулярные библиотеки и комбинаторные химические методы, с помощью которых, используя стандартную методику, легко можно идентифицировать, выбрать и/или синтезировать такие соединения (10). Такие стандартные методики могут использоваться для получения пептидомиметических соединений согласно данному изобретению, а именно пептидомиметических органических соединений, обладающих по существу сходной или той же способностью активизировать Nа⁺K⁺АТФазу и/или клеточные связи, как и пептиды изобретения, например, описанные здесь в Примерах.

Дальнейшим аспектом изобретения является предоставление биомиметических органических соединений, основанных на пептидах изобретения, которые характеризуются тем, что указанные соединения активизируют Nа⁺K⁺ТФазу и/или клеточную связь клеток почечных канальцев и фибробластов, по крайней мере на уровне, на котором действуют пептиды или фрагменты пептидов, относящихся к изобретению, определенные выше.

Изобретение будет описано более детально в следующих неограничивающих Примерах, которые демонстрируют, inter alia (среди прочего), стимулирующий эффект специфических пептидов на Nа⁺K⁺АТФазную активность и клеточные связи со ссылкой на чертеж, который показывает хроматограмму после препаративной очистки с обращенной фазой человеческого С-пептида, меченного тетраметилродамином. Колонку промывали ацетонитрилом с градиентом в 20-40% (ацетонитрил в 0,1% трифторуксусной кислоте (ТФК) в течение 20 минут. Пик А соответствует непрореагировавшей фракции С-пептида. Пики В и С соответствуют С-пептиду, меченному тетраметилродамином. Разделение В и С пиков отражает наличие двух тетраметилродаминовых изомеров в активированном реагенте. В дальнейших исследованиях использовались данные С-пика. Сплошная линия характеризует абсорбтивность при 220 нм (пептид), а пунктирная линия - абсорбтивность при 555 нм (тетраметилродамин).

Пример 1

Изучался стимулирующий эффект пептидов A-F на Nа⁺K⁺АТФазную активность клеток почечных канальцев у крыс. Единичные проксимальные извитые канальцы приготавливались из почек крыс путем микропрепарирования. Канальцы инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с каждым из Пептидов A-F или С-пептидом 1 крыс. Nа⁺K⁺АТФазную активность измеряли после подвержения канальцев гипотоническому шоку и инкубации в течение 15 минут в среде, содержащей ³²Р-АТФ в присутствии или отсутствии убаина.

Стимулирующая активность 5-10^-7 М С-пептида 1 крыс была принята за 100%. При той же концентрации Пептидов A-F были получены следующие относительные параметры активности:

Пептид А 883 процента

Пептид В 362 процента

Пептид С 463 процента

Пептид D 654 процента

Пептид Е 1103 процента

Пептид F 962 процента

Пептид В+С 863 процента

Ниже приведены примеры конкретных фармацевтических композиций данного изобретения.

Пример 2

Человеческий инсулин: Пептид А отдельно или в эквимолярной смеси с Пептидами В, С, D, Е и F (1:4 по молярности при 100 Единиц М инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл состава (композиции) смешивают:

Человеческий Инсулин (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид А отдельно - 16,8 мг

М-Крезол - 25 мг

Глицерин - 160 мг

Добавляют воду и/или 10% соляную кислоту или 10% гидроксид натрия для доведения объема композиции до 10 мл и конечной величины рН до 7,0 - 7,8, или смесь, в которую входят:

Пептид А - 16,8 мг

Пептид В - 8,8 мг

Пептид С - 13, 6 мг

Пептид D - 10 мг

Пептид Е - 12,4 мг

Пептид F - 9,2 мг

М-Крезол - 25 мг

Глицерин - 160 мг

Добавляют воду и/или 10% соляную кислоту или 10% гидроксид натрия в количестве, достаточном для доведения объема композиции до 10 мл и конечной величины рН до 7,0-7,8.

Пример 3

Человеческий инсулин: Пептид В (1:4 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл состава смешивают:

Человеческий Инсулин (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид В - 8,8 мг

М-Крезол - 25 мг

Глицерин - 160 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,7-7,8.

Пример 4

Человеческий инсулин: Пептид С (1:4 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл состава смешивают:

Человеческий Инсулин (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид С - 13,6 мг

М-Крезол - 25 мг

Глицерин - 160 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,0-7,8.

Пример 5

Человеческий инсулин: Пептид D (1:5 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл композиции смешивают:

Человеческий Инсулин (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид D - 10,0 мг

М-Крезол - 25 мг

Глицерин - 160 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,0-7,8.

Пример 6

Человеческий инсулин: Пептид Е (1:4 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл состава смешивают:

Человеческий Инсулин (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид Е - 12,4 мг

М-Крезол - 25 мг

Глицерин - 160 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,0 - 7,8.

Пример 7

Человеческий инсулин: Пептид F (1:4 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл состава смешивают:

Человеческий Инсулин (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид F - 9,2 мг

М-Крезол - 25 мг

Глицерин - 160 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,7 - 7,8.

Пример 8

Человеческий инсулин: Пептид А отдельно или в эквимолярной смеси с фрагментами В, С, Д, Е и F (1:1 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл состава смешивают:

Человеческий Инсулин (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид А - 4,2 мг

М-Крезол - 25 мг

Глицерин - 160 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,0-7,8, или смесь, в которую входят:

Пептид А - 4,2 мг

Пептид В - 2,2 мг

Пептид С - 3,4 мг

Пептид D - 2,5 мг

Пептид Е - 3,1 мг

Пептид F - 2,3 мг

М-Крезол - 25 мг

Глицерин - 160 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,0-7,8.

Пример 9

Человеческий инсулин: Пептид В (1:1 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл состава смешивают:

Человеческий Инсулин (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид В - 2,2 мг

М-Крезол - 25 мг

Глицерин - 160 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,0-7,8.

Пример 10

Человеческий инсулин: Пептид С (1:1 по молярности при 100 единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл состава смешивают:

Человеческий Инсулин (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид С - 3,4 мг

М-Крезол - 25 мг

Глицерин - 160 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,0-7,8.

Пример 11

Человеческий инсулин: Пептид D (1:1 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл состава смешивают:

Человеческий Инсулин (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид D - 2,5 мг

М-Крезол - 25 мг

Глицерин - 160 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,0-7,8.

Пример 12

Человеческий инсулин: Пептид Е (1:1 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл состава смешивают:

Человеческий Инсулин (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид Е - 3,1 мг

М-Крезол - 25 мг

Глицерин - 160 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,0-7,8.

Пример 13

Человеческий инсулин: Пептид F (1:1 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл состава смешивают:

Человеческий Инсулин (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид F - 2,3 мг

М-Крезол - 25 мг

Глицерин - 160 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,0-7,8.

Пример 14

Человеческий цинк-инсулин: Пептид А отдельно или в эквимолярной смеси с фрагментами В, С, D, Е и F (1:4 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл состава смешивают:

Человеческий Инсулин аморфной модификации 300 Е и кристаллической модификации 700 Е (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид А - 16,8 мг

Цинк - 1,3 мг

Хлорид натрия - 70 мг

Ацетат натрия - 16 мг

Метил парагидроксибенз - 10 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,1-7,4, или смесь, в которую входят:

Пептид А - 16,8 мг

Пептид В - 8,8 мг

Пептид С - 13,6 мг

Пептид D - 10 мг

Пептид Е - 12,4 мг

Пептид F - 9,2 мг

Цинк - 1,3 мг

Хлорид натрия - 70 мг

Ацетат натрия - 16 мг

Метил парагидроксибенз - 10 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,1-7,4.

Пример 15

Человеческий цинк-инсулин: Пептид В (1:4 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл состава смешивают:

Человеческий Инсулин аморфной модификации 300 Е и кристаллической модификации 700 Е (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид В - 8,8 мг

Цинк - 1,3 мг

Хлорид натрия - 70 мг

Ацетат натрия - 16 мг

Метил парагидроксибенз - 10 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,1-7,4.

Пример 16

Человеческий цинк-инсулин: Пептид С (1:4 по молярности 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл состава смешивают:

Человеческий Инсулин аморфной модификации 300 Е и кристаллической модификации 700 Е (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид С - 13,6 мг

Цинк - 1,3 мг

Хлорид натрия - 70 мг

Ацетат натрия - 16 мг

Метил парагидроксибенз - 10 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,1-7,4.

Пример 17

Человеческий цинк-инсулин: Пептид D (1:4 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл вещества смешивают:

Человеческий Инсулин аморфной модификации 300 Е и кристаллической модификации 700 Е (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид D - 10,0 мг

Цинк - 1,3 мг

Хлорид натрия - 70 мг

Ацетат натрия - 16 мг

Метил парагидроксибенз - 10 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,1-7,4.

Пример 18

Человеческий цинк-инсулин: Пептид Е (1:4 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл вещества смешивают:

Человеческий Инсулин аморфной модификации 300 Е и кристаллической модификации 700 Е (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид Е - 12,4 мг

Цинк - 1,3 мг

Хлорид натрия - 70 мг

Ацетат натрия - 16 мг

Метил парагидроксибенз - 10 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,1-7,4.

Пример 19

Человеческий цинк-инсулин: Пептид F (1:4 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл вещества смешивают:

Человеческий Инсулин аморфной модификации 300 Е и кристаллической модификации 700 Е (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид F - 9,2 мг

Цинк - 1,3 мг

Хлорид натрия - 70 мг

Ацетат натрия - 16 мг

Метил парагидроксибенз - 10 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,1-7,4.

Пример 20

Человеческий цинк-инсулин: Пептид А отдельно или в эквимолярной смеси с фрагментами В, С, D, Е и F (1:1 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл вещества смешивают:

Человеческий Инсулин аморфной модификации 300 Е и кристаллической модификации 700 Е (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид А - 4,2 мг

Цинк - 1,3 мг

Хлорид натрия - 70 мг

Ацетат натрия - 16 мг

Метил парагидроксибенз - 10 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,1-7,4, или смесь, в которую входят:

Пептид А - 4,2 мг

Пептид В - 2,2 мг

Пептид С - 3,4 мг

Пептид D - 2,5 мг

Пептид Е - 3,1 мг

Пептид F - 2,3 мг

Цинк - 1,3 мг

Хлорид натрия - 70 мг

Ацетат натрия - 16 мг

Метил парагидроксибенз - 10 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,1-7,4.

Пример 21

Человеческий цинк-инсулин: Пептид В (1:1 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл вещества смешивают:

Человеческий Инсулин аморфной модификации 300 Е и кристаллической модификации 700 Е (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид В - 2,2 мг

Цинк - 1,3 мг

Хлорид натрия - 70 мг

Ацетат натрия - 16 мг

Метил парагидроксибенз - 10 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,1-7,4.

Пример 22

Человеческий цинк-инсулин: Пептид С (1:1 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл вещества смешивают:

Человеческий Инсулин аморфной модификации 300 Е и кристаллической модификации 700 Е (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид С - 3,4 мг

Цинк - 1,3 мг

Хлорид натрия - 70 мг

Ацетат натрия - 16 мг

Метил парагидроксибенз - 10 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,1-7,4.

Пример 23

Человеческий цинк-инсулин: Пептид D (1:1 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл вещества смешивают:

Человеческий Инсулин аморфной модификации 300 Е и кристаллической модификации 700 Е (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид D - 2,5 мг

Цинк - 1,3 мг

Хлорид натрия - 70 мг

Ацетат натрия - 16 мг

Метил парагидроксибенз - 10 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,1-7,4.

Пример 24

Человеческий цинк-инсулин: Пептид Е (1:1 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл вещества смешивают:

Человеческий Инсулин аморфной модификации 300 Е и кристаллической модификации 700 Е (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид Е - 3,1 мг

Цинк - 1,3 мг

Хлорид натрия - 70 мг

Ацетат натрия - 16 мг

Метил парагидроксибенз - 10 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,1-7,4.

Пример 25

Человеческий цинк-инсулин: Пептид F (1:1 по молярности при 100 Единиц (Е) инсулина на мл).

Для приготовления 10 мл вещества смешивают:

Человеческий Инсулин аморфной модификации 300 Е и кристаллической модификации 700 Е (20 Е/мг) - 1000 Е

Человеческий Инсулин аморфной модификации 300 Е и кристаллической модификации 700 Е (28 Е/мг) - 1000 Е

Пептид F - 2,3 мг

Цинк - 1,3 мг

Хлорид натрия - 70 мг

Ацетат натрия - 16 мг

Метил парагидроксибенз - 10 мг

Добавляют достаточное количество воды и/или 10% соляной кислоты или 10% гидроксида натрия для доведения композиции до объема 10 мл и конечной величины рН 7,1-7,4.

Пример 26

Пептид А

Для приготовления подъязычных таблеток или энтерокапсул, каждая из которых содержит композицию, эквимолярную 100 Е инсулина, смешивают:

Пептид А - 0,42 мг

Лактоза - 30 мг

и составляющие в достаточном количестве

или смесь Пептида А: Пептида В: Пептида С: Пептида D:

Пептида Е: Пептида F: (1:1:1:1:1:1 по молярности).

Для приготовления подъязычных таблеток или энтерокапсул, каждая из которых содержит композицию, эквимолярную 100 Е инсулина, смешивают:

Пептид А - 0,42 мг

Пептид В - 0,22 мг

Пептид С - 0,34 мг

Пептид D - 0,25 мг

Пептид Е - 0,31 мг

Пептид F - 0,23 мг

Лактоза - 30 мг

и составляющие в достаточном количестве.

Пример 27

Пептид А

Для приготовления подъязычных таблеток или энтерокапсул, каждая из которых содержит композицию эквимолярную 100 Е инсулина, смешивают:

Пептид А - 1,67 мг

Лактоза - 30 мг

и составляющие в достаточном количестве или смесь Пептида А: Пептида В: Пептида С: Пептида D: Пептида Е: Пептида F: (1:1:1:1:1:1 по молярности).

Для приготовления подъязычных таблеток или энтерокапсул, каждая из которых содержит вещество, эквимолярное 400 Е инсулина, смешивают:

Пептид А - 1,68 мг

Пептид В - 0,88 мг

Пептид С - 1,36 мг

Пептид D - 1,0 мг

Пептид Е - 1,24 мг

Пептид F - 0,92 мг

Лактоза - 30 мг

и составляющие в достаточном количестве.

Пример 28

Специфическое связывание пептида Е с клеточной поверхностью иллюстрируется на следующих примерах. Человеческий биосинтетический С-пептид (Eli-Lilly, Inc. , Индианаполис, США) метили тетраметилродамином, используя активированный реагент сложного суцинимидилового эфира тетраметилродамина FluoReporter (Набор меченых белков. Art. no F-6163; Molecular Probes Europe BV, Leiden, Netherlands). Реакцию сочетания проводили при рН 8,3 (0,1 М NаНСОз, буфер) с пятикратным стехиометрическим избытком активированного реагента по отношению к С-пептиду. Тетраметилродаминовая группа имеет абсорбцию/эмиссию соответственно максимум при 555/580 нм, и она включается в N-конец С-пептида. Меченые С-пептиды очищали методом гелевой фильтрации (обессоливание на фоне 50 мМ фосфатного буфера, 0,1 М NaCl, при рН 7,4) на колонке NAP-5; Pharmacia Biotech Uppsala, Швеция) и затем проводили обратную фазовую хроматографию (колонка 250 мм Kromasil C8, диам. 4,6 мм, размер частиц 7 мкм, размер пор 10 нм, Eka-Nobel, Surte, Швеция) с использованием ВЭЖХ хроматографической системы 1090 Hewlett Packart HPLC (Гренобль, Франция) (см. чертеж). Элюированный материал немедленно доводили до рН 8, добавляя аммиак и затем его лиофилизовали.

Культивированные клетки почечных канальцев человека (проксимальные извитые канальцы РСТ) инкубировали с меченым родамином С-пептидом, синтезированным вышеописанным методом. Клетки приготавливали из здоровой части человеческой почки, удаленной хирургически по поводу гипернефромы. Наружный корковый слой почки толщиной 150 мкм удаляли на микротоме и инкубировали в растворе коллагеназы (0,05%) при 37^oС в течение 15 минут. Суспензию ткани центрифугировали и дважды прополаскивали в 0,01% ингибиторным раствором трипсина соевых бобов (Gibco Laboratories, Гранд Айленд, Нью-Йорк, США), и концентрат фрагментов РСТ и клеток РСТ помещали на предметное стекло и прикрывали покровным стеклом. Клетки культивировали в модифицированной по способу Дюльбекко среде Игла (DMEM) 20 ммоль/л 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтан серная кислота (HEPES), 24 ммоль/л NаНСО₃ 50,000 МЕ/л пенициллина и 50 мг/л стрептомицина, рН 7,4) с 10% плодной бычьей сывороткой (Gibco) в инкубаторе при 37^oС с 95% О₂ и 5% CO₂. Через 28 часов культивирования среду заменили на DMEM с 1% плодной бычьей сывороткой. Клетки проверяли примерно через 18-36 часов.

Взаимодействие между С-пептидами и поверхностями клеток почечных канальцев регистрировали методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии (11). Было найдено, что концентрации С-пептида 5 нМ 92% пептида связывалось с поверхностью клеток в пределах 50 минут. Напротив, когда клетки предварительно инкубировали с 5 мкм пептида Е, связывание С-пептида в пределах 50 минут составляло не более 12%. Аналогично, когда С-пептид связывался с клетками в течение 50 минут, и после этого добавлялся Пептид Е, происходило вытеснение большей части С-пептида из его сайта связывания в пределах 4 часов; только 14% оставалось связанным. Аналогичные результаты были получены при использовании пептида F. Результаты свидетельствуют, что пептиды - аналогично С-пептиду - связываются со специфическими сайтами связывания на поверхности клеток.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Biochemical Basis of Microvascular Disease, C.J. Mullarkey and M. Brownlee, p. 534-545, in Textbook of Diabetes, Volume 2, editors J. Pickup and G. Williams. Blackwell, Oxford 1991.

2. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus, DCCT group. N Engl J Med 1993; 329: 977-983.

3. К. Kjeldsen, H. Braendgaard, P. Sidenius, J. Stenfatt Larsen and A. Nergaard. Diabetes decreases Nа⁺K⁺ pump concentration in skeletal muscles, heart ventricular muscle, and peripheral nerves of rat. Diabetes 1987; 36: 842-848.

4. L. C. MacGregor and F.M. Matschinsky. Experimental diabetes impairs the function of the retinal pigmented epithelium. Metab Clin Exp 1986; 35: suppi 1, 28-34.

5. D.A. Greene and S.A. Lattimer. Impaired rat sciatic nerve sodium potassium adenosine triphosphatase in acute streptozocin diabetes and its correction by dietary myoinositol supplementation. J Clin Invest 1983; 72: 1058-1063.

6. Т. Clausen and M.E. Everts. Regulation of the Na, K-pump in skeletal muscle. Kidney International 1989; 35: 1-13.

7. Y. Ohtomo, A. Aperia, B.L. Johansson and J. Wahren. C-peptide stimulates renal Nа⁺K⁺ATPase activity in synergism with neuropeptide Y. Diabetologia 1996; 39: 199-205.

8. Т. Clackson and J. Wells. In vitro selection from protein and peptide libraries. Trends in Biotechnology 1995, 12: 173-184.

9. H. Nakanishi, S. Ramurthy, A. Raktabutr, R. Shen and M. Eahn. Peptidomimetics of the immunoglobulin supergene family - a review. Gene 1993, 137: 51-56.

10. Т. Kieber-Emons, R. Murali and M.I. Greene. Therapeutic peptides and peptidomimetics. Current Opinion in Biotechnology 1997, 8: 435-441.

11. R. Rigler. Journal of Biotechnology 1995, 41: 177-186.