штамм № 1734 "приморский-2000" вируса ящура типа о для изготовления диагностических и вакцинных препаратов

Классы МПК:C12N7/00 Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их
A61K39/135 вирус ящура
Автор(ы):, , , , , , , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное учреждение Всероссийский научно- исследовательский институт защиты животных
Приоритеты:
подача заявки:
2001-11-01
публикация патента:

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Штамм 1734 "Приморский-2000" получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных культурах клеток. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов ВГНКИ 22.03.2000 под регистрационным 1734 "Приморский-2000-ДЕП". Вирус штамма О1 1734 "Приморский-2000" репродуцируется в чувствительных культурах клеток и в течение 20-24 ч инкубирования накапливается до 7,5-8,0 Ig ТЦД50/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 4 ч. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в культурах клеток в течение 10 пассажей. Штамм вируса ящура типа О обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и пригоден для изготовления средства специфической профилактики и диагностики ящура типа О, гомологичного эпизоотическому вирусу, циркулирующему в России, регионах азиатского континента, включая Юго-Восточную и Среднюю Азию. 12 табл., 2 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8

Формула изобретения

Штамм вируса Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, вид Aphtae, тип О, коллекция ВГНКИ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств для специфической профилактики и диагностики ящура типа О.

Ящур - это острое высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными (афтозными) поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытной щели и сопровождающееся нарушением движения. Для этого заболевание характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Эта болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, тем самым затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность.

Многолетний опыт показывает, что наличие эндемичного ящура снижает доходы в молочном и мясном животноводстве на 35-40%.

Вирус ящура относится к роду афтовирусов, семейству пикорнавирусов. Он включает 7 иммунологических типов и большое количество подтипов [1, 2].

Известной особенностью возбудителя ящура является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки, на разных территориях, зависящая от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других факторов. Известно, что основной причиной антигенной изменчивости является изменение аминокислотной последовательности в полипептидах вирусных белков, составляющих капсид вириона. Такие антигенные изменения могут выражаться как в незначительных отличиях между штаммами, улавливаемых только с помощью тонких методов молекулярного анализа, так и в появлении совершенно отличающихся штаммов, требующих использования новых средств для серологической диагностики и специфической профилактики болезни, вызываемой этими штаммами [2, 3].

Известны штаммы вируса ящура типа О, которые используются на территории России в течение последних 34-35 лет. К ним относятся следующие штаммы: O1 1618 "Чечено-Ингушский", выделенный в 1966 году в Чечено-Ингушской АССР; O1 194, выделенный в 1967 году в Волгоградской области и O1 1182/83, выделенный в 1983 году на территории Армении [4, 5].

Вакцины из этих производственных штаммов ранее обеспечивали довольно напряженный иммунитет у привитых животных в отношении гомологичных либо близких им в антигенном отношении возбудителей.

Однако в последние годы было зарегистрировано несколько вспышек ящура, которые в ряде случаев не удалось ликвидировать в первичных очагах, несмотря на энергичные ветеринарно-санитарные мероприятия общего и специального характера.

Это было обусловлено недостаточной эффективностью вакцин, применяемых в отношении эпизоотического вируса, вызывающего прорывы иммунитета даже у многократно вакцинированных животных. Поэтому назрела необходимость подготовить новый производственный штамм вируса для успешной специфической профилактики с/х животных от вновь выделенного вируса ящура типа О.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм О1 194 "Волгоградский", выделенный в 1967 году и используемый в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении диагностических и вакцинных препаратов, применяемых на территории России и стран-членов СНГ [6].

Штамм 194 вируса ящура О1 имеет следующие характеристики, представленные в таблице 1.

Недостатки данного штамма состоят в его низкой биологической, антигенной и иммуногенной активности.

Об этом свидетельствует тот факт, что в 2000 году в России (Приморский край) и странах Закавказья (Грузия) были отмечены очаги заболевания ящуром типа О крупного рогатого скота и свиней, иммунизированных бивалентной вакциной АО, в состав которой входит антиген из производственного штамма О1 194. Однако вакцина не обеспечила удовлетворительной защиты иммунизированных животных. Лабораторными исследованиями во ВНИИЗЖ афтозного материала, выделенного от больных свиней, был установлен вирус ящура типа О, имеющий антигенные отличия от штамма О1 194 и O1 1618 в реакции связывания комплемента (РСК) и реакции иммуноферментного анализа (ИФА). Это свидетельствовало о несоответствии используемых средств специфической профилактики и диагностики ящура типа О, используемых Россией и странами СНГ, эпизоотическому вирусу, циркулирующему в 2000 году в России (Приморский край) и странах Закавказья (Грузия).

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового производственного штамма вируса ящура типа О, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего изготовление диагностических и вакцинных препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся в России и странах Закавказья.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в получении нового производственного штамма вируса ящура типа О, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и пригодного для изготовления диагностических и вакцинных препаратов против ящура типа О, гомологичных эпизоотическому вирусу, циркулирующему в России (Приморский край) и странах Закавказья (Грузия).

Указанный технический результат достигнут получением штамма 1734 "Приморский-2000" вируса ящура типа О. Штамм O1 1734 "Приморский-2000" является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма 01 1734 "Приморский-2000" выделен 13.04.2000 г. от больных свиней в хозяйстве ОПХ "Степное" (с. Элитное) Уссурийского района Приморского края. Производственный штамм O1 1734 "Приморский-2000" получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Полученный штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (ВГНКИ) 22.03.2000 г. под регистрационным номером 1734 "Приморский-2000"-ДЕП.

По сравнению с прототипом штамм O1 1734 "Приморский-2000" обладает более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена его возможность использования для приготовления диагностических препаратов и инактивированной вакцины. Штамм 1734 "Приморский-2000" вируса типа О обеспечивает получение диагностических препаратов, позволяющих производить серологическую диагностику изолятов вируса ящура типа О, вызвавшего вспышки заболевания в 2000 году в России (Приморский край) и странах Закавказья (Грузия), и противоящурной инактивированной вакцины, создающей защиту восприимчивых животных против указанного возбудителя заболевания.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, где на:

фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность белка VP1 штамма 1734 "Приморский-2000" вируса ящура типа О;

фиг. 2 изображена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма 1734 "Приморский-2000" с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.

Штамм O1 1734 "Приморский-2000" вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм O1 1734 "Приморский-2000" относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в РДП, ИФА и РН. При вакцинации КРС и свиней вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП и РН. При гипериммунизации морских свинок концентрированным инактивированным вирусом индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:40-1:80, в ИФА в разведении 1: 3000-1: 4000. При определении антигенного родства штамм О1 1734 "Приморский-2000" с производственными штаммами О1 194, O1 1618, а также с другими штаммами, выделенными в странах Закавказья и других зарубежных стран в 1997-2000 годах, было проведено сравнительное исследование первичной структуры гена и белка VP1.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма 1734 "Приморский-2000". Из нее была выведена первичная структура белка VP1 (фиг.1). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм 1734 "Приморский-2000" принадлежит к Паназиатской генетической линии вируса ящура типа О (фиг.2). Паназиатский вирус вызвал пандемию ящура в 1999-2000 годах в большинстве стран Азии, в том числе во Вьетнаме, Китае, Тайване, Японии, Корее, Монголии, Армении, Грузии. Опустошительная эпизоотия ящура в Великобритании в 2001 году также была вызвана Паназиатским вирусом.

Исследуемый вирус имеет наиболее высокий уровень гомологии (98,74%) с изолятами О1-Вьетнам-1999 и О1-Тайвань-1999 (фиг.2).

Филогенетические взаимоотношения исследованных изолятов с ранее изученными штаммами, выделенными в разных странах мира за три последние десятилетия, указаны на дендрограмме (фиг.2). Установлено, что исследованные изоляты отличаются от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от штаммов 1 194 и O1 1618, используемых в настоящее время для изготовления средств диагностики и специфической профилактики ящура типа О.

Антигенное родство вируса ящура O1 1734 "Приморский-2000" с соответствующими производственными и ранее выделенными штаммами на территории Армении, Тайваня, Монголии и Вьетнама изучено в РСК. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что эпизоотический штамм O1 1734 отличается от производственных штаммов O1 194 и O1 1618, но в то же время близко родственен штаммам О1-Тайвань-1999, O1 1704-Армения-1997, О1-Вьетнам-1999 и О1-Монголия-2000. Аналогичные результаты получены и в реакции ИФА.

Биологические характеристики

Штамм O1 1734 "Приморский-2000" проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для использования в качестве сырья для получения диагностических препаратов, а также изготовления инактивированной противоящурной вакцины. Вирус штамма O1 1734 репродуцируется в монослойной первично-трипсинизированной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), IB-RS-2, ВНК-21 и в течение 20-24 часов инкубирования накапливается до 6,5-7,5 Ig ТЦД50/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 4 часа.

После 3-5 пассажей инкубирования накапливается до 6,5-7,5 1д ТЦД50/мл. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Штамм O1 1734 "Приморский-2000" является РНК-содержащим вирусом с мол. массой 7штамм № 1734 106 Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой с мол. массой 2,8штамм № 1734 108 МД. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует. Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержатся приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 6 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Проведено определение первичной структуры участка генома вируса с помощью ПЦР и сиквенса. Результаты исследований представлены на фиг.1 и 2. Сравнительный анализ показал, что данный изолят принадлежит к новой генетической линии вируса ящура типа О. Представителей этой линии выделяли в последние годы в различных регионах азиатского континента, включая Юго-Восточную и Среднюю Азию и Дальний Восток. Исследуемый вирус ящура O1 1734 имел наиболее высокий уровень гомологии (98,74%) с изолятами О1-Вьетнам-1999 и О1-Тайвань-1999.

В то же время его гомология с представителями других генетических линий вируса ящура типа О составляла всего лишь 80-90% (фиг.2).

Широкое географическое распространение генетической линии вируса ящура, к которой принадлежит штамм О1 1734, позволяет говорить о возможной панзоотии.

Физические свойства

Масса вириона - 8,4штамм № 1734 10-18 г. Коэффициент сентиментации - 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность - 1,45 г/мл.

Устойчивость к внешним факторам

Вирус штамма O1 1734 "Приморский-2000" устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и др. органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, штамм № 1734 -облучению и высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, крольчат и морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм O1 1734 "Приморский-2000" по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа О.

Для снижения его эпизоотической опасности необходимо обеспечить своевременную лабораторную диагностику и вакцинопрофилактику вновь возникающих очагов болезни, для чего необходимы высокоактивные и специфичные антительные и антигенные диагностикумы и вакцина, полученные с использованием данного штамма в качестве производственного.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм соответствует условиям патентоспособности "новизна" и "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения.

Пример 1

Штамм вируса ящура 01 1734 "Приморский-2000" был изолирован из полевого материала, поступившего во ВНИИЗЖ в виде эпителия афт от свиней, подозреваемых в заболевании ящуром, при проведении лабораторной диагностики этого заболевания и дифференциации его от других везикулярных болезней. При изоляции вируса использован комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных [7].

Биологические и вирусологические методы включали адаптацию исходного вируса к культурам первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Были использованы культуры клеток СП, ПСГК-30, IB-RS-2 и ВНК-21. Для постановки биопробы первичные и перевиваемые культуры клеток выращивали на соответствующих питательных средах во флаконах емкостью 50-100 мл, отмывали от ростовой среды и заражали 10%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД50 на клетку), приготовленной в растворе Игла с антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали хлороформом в отношении 1: 10. После 30-минутного инкубирования при 37-38oС во флаконы вносили по 5-10 мл поддерживающей питательной среды и инкубировали при 37-38oС до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000g в течение 15-20 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК и ИФА на наличие вирусного антигена, при этом использовали набор коммерческих типоспецифических сывороток и сыворотки, хранящиеся в музее штаммов ВНИИЗЖ.

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 3.

Результаты, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о хорошей адаптационной активности штамма O1 1734 к использованным клеточным культурам.

Изолированный с помощью перечисленных методов вирус был исследован в РСК с набором диагностикумов на все типы вируса ящура, везикулярной экзантемы, везикулярной болезни свиней и везикулярного стоматита с целью идентификации типовой принадлежности и контроля на чистоту. Результаты типирования вируса в РСК представлены в таблице 4.

Приведенные в таблице 4 результаты свидетельствуют о том, что выделенный вирус относится к типу О; со всеми остальными сыворотками был получен отрицательный результат.

Пример 2

Для гипериммунизации морских свинок используют антиген из вируса ящура, штамм O1 1734 "Приморский-2000", репродуцированный в суспензионной культуре клеток ВНК-21. Вируссодержащую суспензию очищают от балластных белков добавлением 0,05% полигуанидина. Очищенный вирус концентрируют в 100 раз с помощью ПЭГ-6000 (10% по объему) и инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,01-0,05% и рН 7,8-8,0.

Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта вводят морским свинкам внутримышечно в дозе 1,0 см3. Через 21 день иммунизацию дважды повторяют (интервал 7 дней) и через 10 дней животных обескровливают. Индивидуальные пробы сывороток крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК согласно [7].

После этого готовят серию путем смешивания типоспецифичных индивидуальных проб одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двухсторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.

После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при 4oС в течение 30 дней полученную сыворотку фасуют в ампулы по 0,5-1,0 см3 и лиофилизируют.

Способом, описанным в примере 2, было приготовлено 2 серии гипериммунных сывороток, характеристики которых представлены в таблице 5.

Данные таблицы 5 свидетельствуют, что получены диагностические сыворотки, по специфической активности отвечающие требованиям [7].

Пример 3

Для получения антигена для иммунохимических реакций используют вирус ящура, штамм O1 1734 "Приморский-2000", адаптированный к культурам клеток перевиваемых сублиний ПСГК-30 и IB-RS-2. Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10%-ной суспензии из стенок афт свиней. Адаптацию проводят в течение 4-5 последовательных пассажей. Полученную матричную расплодку вируса используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике. Полученную вируссодержащую жидкость концентрируют в 100 раз с помощью 10% ПЭГ-6000. Полученный концентрат инактивируют прогреванием при 58oС в течение 40 минут, фасуют в ампулы по 1 см3 и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Указанным способом было приготовлено 2 серии диагностического антигена, характеристики которых приведены в таблице 6.

Результаты исследований, приведенные в таблице 6, свидетельствуют, что получены диагностические антигены, специфическая активность которых соответствует требованиям [7].

Пример 4

Для изготовления адсорбат-вакцины вирус ящура О1 1784 "Приморский-2000" репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,2-7,4. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,005-0,1 ТЦД50 на клетку. Культивирование вируса ведут при температуре 36-37oС. Через 8-10 часов инкубирования при достижении количества мертвых клеток 90-95% культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S+75S компонентов. Количество 146S+75S компонентов суспензии должно соответствовать не менее 0,5 мкг/мл. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20% раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 часов при 36-37oС и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. По окончании инактивации суспензию антигена охлаждают до 4-8oС. В охлажденную супензию добавляют 10% раствор полигексаметиленгуанидина (ПГМГ) до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией. Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вируссодержащего белка и 146S+75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем гидрата окиси алюминия (ГОА). Для этого в охлажденную суспензию антигена добавляют расчетный объем геля ГОА 3% концентрации.

После седиментации ГОА сливают расчетный объем надосадочной жидкости или измеряют объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62-0,488 Р<0,01 мг/мл n=10, а концентрация 146S+75S компонентов вируса ящура, по меньшей мере, 6,0 мкг/мл. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% раствор сапонина до конечной концентрации, по меньшей мере, 0,075%. Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и подвергают контролю на стерильность по [8].

Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2,0 мл, а затем подкожно в дозе 10 мл. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или морских свинках.

Результаты контроля иммуногенной активности полученной вакцины на КРС приведены в таблице 7. Приведенные в таблице 7 результаты показали, что все шесть голов КРС были защищены от генерализации процесса после контрольного заражения через 21 день.

Иммунный ответ КРС на введение адсорбат-вакцины из ящурного антигена O1 1734 проверили также на 5 головах КРС массой 200-300 кг. Результаты исследований представлены в таблице 8. Приведенные в таблице 8 данные свидетельствуют о том, что противоящурная адсорбат-вакцина из штамма О1 1734 индуцирует хороший иммунный ответ, начиная с 21 дня после вакцинации. Уровень вируснейтрализующих антител (ВНА) к 61 дню увеличился на 5,07 лог2 по сравнению с 21 днем после вакцинации.

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

Оптимальный компонентный состав полученной адсорбат-вакцины против ящура типа О приведен в таблице 9.

Пример 5

Для изготовления эмульсионной вакцины вирус ящура типа О, штамм 1774 "Приморский-2000", репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21, инактивируют и очищают от балластных примесей и возможных контаминантов, подвергают контролю на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, иммуногенных компонентов (146S+75S) и стерильность так, как описано в примере 4. Необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем. Полученный концентрат антигена хранят при 4-6oС до момента использования в вакцине. Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования концентрата антигена и масляного адъюванта на коллоидных мельницах в соотношении 3:7-1:1 соответственно.

В результате получают инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типа О, которая представляет собой молокоподобную жидкость, нерастворимую в воде. Вакцина имеет жидкую консистенцию, легко рассасывается в месте введения, не вызывает образования абсцессов, не вызывает общей реакции в виде подъема температуры и обладает выраженной иммуногенностью для свиней в дозе 2 мл через 1-21 день после вакцинации, для КРС - в дозе 5 мл через 3-21 день после вакцинации и для овец - в дозе 1 мл через 3-21 день после введения. Вакцину вводят свиньям внутримышечно, а КРС и овцам - подкожно. В прививном объеме должно содержаться не менее 4 мкг 146S+75S компонентов. Оптимальный компонентный состав полученной эмульсионной вакцины против ящура типа О приведен в таблице 10.

Иммуногенная активность эмульсионной вакцины проверена на свиньях массой 35-40 кг. Результаты исследований представлены в таблицах 11 и 12. ИмД50= 0,18 мл. В прививном объеме 2 мл содержится 11,2 ИмД5о для свиней. В таблице 11 показано, что вакцина из вируса ящура O1 194 индуцирует в организме подсвинков в 2-3 раза меньшее количество ВНА против гетерологичного штамма вируса O1 1784 "Приморский-2000" по сравнению с гомологичным штаммом.

Представленные в таблице 12 данные демонстрируют уровень гуморального иммунитета у подсвинков, привитых противоящурными эмульсионными вакцинами с разным содержанием иммуногенного компонента.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- штамм 1734 "Приморский-2000" вируса ящура типа О, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- штамм 1734 "Приморский-2000" вируса ящура типа О, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригоден для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации

1. Ререр Х. Ящур. Пер. с нем. Г.А.Сурковой. Под ред. и с предисл. канд. вет. наук. П.В.Малярца, М., Колос, 1971, 432с.

2. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. Под ред. А.Н.Бурдова.-М., Агропромиздат, 1990, 320с.

3. Сюрин и др. Вирусные болезни животных.-М., ВНИТИБП, 1998.-c.532-548.

4. Кругликов Б. А., Штефан М.К. и Тарасенко Т.Я. Изучение инфекционных свойств штаммов вируса ящура типа О, выделенных в разные периоды эпизоотии. - В кн.: Акт. пробл. вет. вирусол. - Владимир, 1988. -ч. 1. -с. 77-78.

5. Авт. свид. СССР 1739559, А 61 К 39/135, 10.04.2000 г.

6. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21). Утверждена ГУВ Госкомиссии CM CCP по продовольствию и закупкам 24.01.91 г. (прототип).

7. ГОСТ 25384-82 "Методические указания по выделению идентификации штаммов вируса ящура". М., Колос.-1974.

8. ГОСТ 28085-89.

9. Шажко Ж.А., Фомина Т.А. и др. Некоторые характеристики эпизоотических штаммов вируса ящура, изолированных в СССР. Ящур (К новой стратегии борьбы с ящуром), Владимир, 1992.-ч. 1.-с. 82-96.

Класс C12N7/00 Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их

холодоадаптированный штамм вируса гриппа в-в/виктория/2/63/87, предназначенный в качестве штамма-донора аттенуации для получения реассортантов холодоадаптированных штаммов для живой гриппозной вакцины -  патент 2529772 (27.09.2014)
штамм "г 244/11" вируса блютанга 14 серотипа для вирусологических исследований, изготовления вакцинных и диагностических препаратов -  патент 2528057 (10.09.2014)
флавивирус с двухкомпонентным геномом и его использование -  патент 2527891 (10.09.2014)
поликатионное соединение "тривирон (triviron)" и способ его получения -  патент 2527256 (27.08.2014)
аттенуированный рекомбинантный парвовирус, пригодный для защиты собак от инфицирования парвовирусом -  патент 2527157 (27.08.2014)
кодон-оптимизированная кднк, кодирующая дисферлин человека, генно-инженерная конструкция, рекомбинантный аденовирус и фармацевтическая композиция для лечения дисферлинопатий -  патент 2527073 (27.08.2014)
вакцина против ящура типа а инактивированная сорбированная -  патент 2526570 (27.08.2014)
способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов -  патент 2526504 (20.08.2014)
способ удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины -  патент 2526494 (20.08.2014)
набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации рнк вируса хунин методом полимеразной цепной реакции в реальном времени -  патент 2525938 (20.08.2014)

Класс A61K39/135 вирус ящура

вакцина против ящура типа а инактивированная сорбированная -  патент 2526570 (27.08.2014)
способ изготовления вакцины против ящура -  патент 2522868 (20.07.2014)
применение этония в качестве адъюванта для производства сорбированной противоящурной вакцины -  патент 2521513 (27.06.2014)
полиэпитопный белок, нуклеотидная последовательность, кодирующая полиэпитопный белок, плазмида с последовательностью, кодирующей полиэпитопный белок, и препарат полиэпитопного белка для индукции иммунного ответа против вируса ящура -  патент 2467014 (20.11.2012)
состав полиэпитопного белка для индукции иммунного ответа против вируса ящура -  патент 2453557 (20.06.2012)
штамм а 2045/киргизия/2007 вируса ящура aphtae epizooticae типа а для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а -  патент 2451745 (27.05.2012)
способ изготовления инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц и вакцина инактивированная эмульгированная против гриппа птиц -  патент 2358760 (20.06.2009)
способ изготовления вакцины против ящура и вакцина против ящура -  патент 2332233 (27.08.2008)
штамм азия-1/таджикистан/2004(1960) вируса ящура типа азия-1 для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов -  патент 2297452 (20.04.2007)
вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа а -  патент 2294760 (10.03.2007)
Наверх