стабильный неводный препарат пептидного соединения (варианты), способ его получения (варианты) и способ лечения гормон-зависимого заболевания у субъекта (варианты)

Формула изобретения

1. Стабильный неводный препарат пептидного соединения, содержащий по меньшей мере одно близкое LHRH соединение и по меньшей мере один полярный непротонный растворитель, отличающийся тем, что в качестве по меньшей мере одного полярного непротонного растворителя он содержит растворитель, выбранный из группы, включающей ДМСО, ДМФ, гексаметилфосфотриамид и н-метилпирролидон, причем указанный препарат является стабильным при 37^oС в течение по меньшей мере 3 месяцев.

2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что он содержит по меньшей мере приблизительно 10 мас.% близкого LHRH соединения.

3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что он содержит по меньшей мере приблизительно 30 мас.% близкого LHRH соединения.

4. Препарат по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанное близкое LHRH соединение выбрано из группы, состоящей из лейпролида, LHRH, нафарелина и госерелина.

5. Препарат по п.1, отличающийся тем, что он стабилен при 80^oС в течение по меньшей мере 2 месяцев.

6. Препарат по п.1, отличающийся тем, что он стабилен при 37^oС в течение по меньшей мере 1 года.

7. Препарат по п.1, отличающийся тем, что он адаптирован для применения в имплантируемом устройстве для доставки лекарственного вещества.

8. Препарат по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит неводный протонный растворитель.

9. Препарат по п.1, отличающийся тем, что указанный полярный непротонный растворитель обладает эффектом против образования геля.

10. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве по меньшей мере одного близкого LHRH соединения он содержит от приблизительно 30 мас.% до приблизительно 50 мас.% лейпролида ацетата в ДМСО.

11. Препарат по п.1, отличающийся тем, что он содержит, в основном, лейпролид и ДМСО в соотношении 370 мг лейпролида в 1 мл ДМСО.

12. Препарат по п.1, отличающийся тем, что он стабилен после облучения.

13. Способ получения стабильного неводного препарата пептидного соединения, включающий растворение по меньшей мере одного близкого LHRH соединения в по меньшей мере одном полярном непротонном растворителе, отличающийся тем, что в качестве по меньшей мере одного полярного непротонного растворителя используют растворитель, который выбирают из группы, включающей ДМСО, ДМФ, гексаметилфосфотриамид и н-метилпирролидон.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что растворяют по меньшей мере приблизительно 10 мас.% близкого LHRH соединения.

15. Способ по п. 13, отличающийся тем, что растворяют по меньшей мере приблизительно 30 мас.% близкого LHRH соединения.

16. Способ по любому из пп.13-15, отличающийся тем, что указанное близкое LHRH соединение выбирают из группы, состоящей из лейпролида, LHRH, нафарелина и госерелина.

17. Способ по п. 13, отличающийся тем, что далее добавляют неводный протонный растворитель.

18. Способ по п. 13, отличающийся тем, что в качестве по меньшей мере одного близкого LHRH соединения используют лейпролида ацетат в количестве приблизительно от 30 мас.% до приблизительно 50 мас.%, которое растворяют в ДМСО.

19. Способ по п.13, отличающийся тем, что 370 мг лейпролида растворяют в 1 мл ДМСО.

20. Способ по п.13, отличающийся тем, что растворение проводят в атмосфере инертного газа.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что в качестве инертного газа выбирают сухой азот.

22. Способ лечения гормон-зависимого заболевания у субъекта, включающий введение близкого LHRH соединения, отличающийся тем, что указанному субъекту вводят эффективное количество препарата по п.1.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанное введение осуществляют парентерально.

24. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанное введение осуществляют длительно и непрерывно.

25. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанное введение осуществляют посредством имплантируемого устройства для доставки лекарственного вещества.

26. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанное состояние представлено раком простаты, причем в качестве близкого LHRH соединения используют лейпролид.

27. Способ по любому из пп.22-26, отличающийся тем, что осуществляют ежедневное введение по меньшей мере приблизительно 80 мкг лейпролида.

28. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанное ежедневное введение осуществляют в течение периода, выбранного из группы, состоящей из 3 месяцев, 6 месяцев и 12 месяцев.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что указанное ежедневное введение в течение указанного периода осуществляют непрерывно посредством имплантируемого устройства для доставки лекарственного вещества.

30. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанное состояние представлено раком простаты, причем в качестве близкого LHRH соединения используют антагонист LHRH.

31. Стабильный неводный препарат пептидного соединения, содержащий по меньшей мере одно близкое LHRH соединение и по меньшей мере один полярный непротонный растворитель, отличающийся тем, что в качестве по меньшей мере одного полярного непротонного растворителя он содержит растворитель, выбранный из группы, включающей ДМСО, ДМФ, гексаметилфосфотриамид и н-метилпирролидон, или их смесь, причем указанный препарат проявляет бактериостатическую, бактерицидную или спороцидную активность.

32. Способ получения стабильного неводного препарата по п.31, включающий растворение по меньшей мере одного близкого LHRH соединения в по меньшей мере одном полярном непротонном растворителе, отличающийся тем, что в качестве по меньшей мере одного полярного непротонного растворителя используют растворитель, который выбирают из группы, включающей ДМСО, ДМФ, гексаметилфосфотриамид и н-метилпирролидон.

33. Способ лечения гормон-зависимого заболевания у субъекта, включающий введение близкого LHRH соединения, отличающийся тем, что указанному субъекту вводят эффективное количество препарата по п.31.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к стабильным неводным полярным непротонным препаратам пептидных соединений, в частности к препаратам пептидных соединений в высоких концентрациях.

Уровень техники

Лютеинизирующий гормон-высвобождающий гормон (LHRH), известный так же как гонадотропин-высвобождающий гормон (GnRH), является декапептидом структуры:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-

-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂.

Он секретируется гипоталамусом и связывается рецепторами гипофиза, высвобождая лютеинизирующий гормон (LH) и фолликул-стимулирующий гормон (FSH). LH и FSH стимулируют синтез стероидных гормонов половыми железами. Известны многочисленные аналоги LHRH, включая пептиды, близкие LHRH, которые действуют как агонисты и пептиды, которые действуют как антагонисты (Zoladex (золадекс) (имплантат госерелина ацетата), справочник Physician"s Desk Reference, 50-е изд., с. 2858-2861 (1996); Патент США 3914412, выданный 21 октября 1975 г.; Патент США 4547370, выданный 15 октября 1985 г.; Патент США 4661472, выданный 28 апреля 1987 г.; Патент США 4689396, выданный 25 августа 1987 г.;

Патент США 4851385, выданный 25 июля 1989 г.; Патент США 5198533, выданный 30 марта 1993 г.; Патент США 5480868, выданный 02 января 1996 г.; WO 92/20711, опубликованная 26 ноября 1992 г.; WO 95/00168, опубликованная 05 января 1995 г. ; WO 95/04540, опубликованная 16 февраля 1995 г.; Статья "Stability of Gonadorelin and Triptorelin in Aqueous Solution", V.J. Helm, B. W. Muller, Pharmaceutical Research, 7/12, с. 1253-1256(1990); Статья "New Degradation Product of Des-Gly¹⁰-NH₂-LH-RH-Ethilamide (Fertirelin) in Aqueous Solution", J. Okada, T. Seo, F.Kasahara, K.Takeda, S.Kondo, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/2, с. 167-170 (1991); Статья "Characterizaton of the Solution Degradation Product of Histrelin, a Gonadotropin Releasing Hormone (LHRH) Agonist", A.R. Oyler, R.E. Naldi, J.R. Lloyd, D.A. Graden, C.J. Shaw, M. L. Cotter, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/3, с. 271-275 (1991); Статья "Parenteral Peptide Formulations: Chemical and Physical Properties of Native Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH) and Hydrophobic Analogues in Aqueous Solution", M. F. Powell, LM. Sanders, A.Rogerson, V.Si, Pharmaceutical Research, 8/10, с. 1258-1263 (1991)). Описание каждой публикации, патента или патентной заявки введено в заявку в виде ссылки во всей полноте в той же мере, как если бы содержание каждой отдельной публикации, патента или патентной заявки было специально и индивидуально введено посредством ссылки.

Известно, что аналоги LHRH используют для лечения гормон-зависимых заболеваний, таких как рак простаты, доброкачественная простатомегалия, эндометриоз, миома матки, фиброма матки, преждевременное половое созревание или рак молочной железы, а также в качестве противозачаточных средств (Патент США 5480868, выданный 02 января 1996 г.). Назначение лекарств с непрерывным их высвобождением является предпочтительным как для агонистов, близких LHRH соединений, которые снижают число доступных рецепторов после повторного приема лекарства таким образом, что подавляется образование стероидных гормонов, так и для антагонистов близких LHRH соединений, которые должны вводиться непрерывно для постоянного ингибирования эндогенного LHRH (Патент США 5480868, выданный 02 января 1996 г.).

Непрерывная (продолжительная) парентеральная доставка лекарств, особенно пептидных лекарств, имеет множество преимуществ. Применение имплантируемых устройств для непрерывной доставки широкого круга лекарств или других полезных агентов хорошо известно в уровне техники. Типичные устройства описаны, например, в Патентах США 5034229, 5057318 и 5110569. Описание каждого из данных патентов введено здесь в виде ссылки.

В общем случае биодоступность пептидов, включая близкие LHRH соединения, при пероральном введении является низкой (Статья "Degradation of the LHRH Analog Nafarelin Acetate in Aqueous Solution", D.M.Johnson, R.A.Pritchard, W.F.Taylor, D.Conley, G.Zuniga, K.G. McGreevy, Intl.J. of Pharmaceutics, 31, с. 125-129 (1986); Статья "Percutaneous Absorption Enhancement of Leuprolide", M.Y.Fu Lu, D. Lee, G.S.Rao, Pharmaceutical Research, 9/12, с. 1575-1576 (1992)).

Имеющиеся в настоящее время в продаже водные препараты LHRH, его аналогов и близких соединений, которые используют для парентеральных инъекций, обычно содержат относительно низкие концентрации близких LHRH соединений (0,05 до 5 мг/мл) и могут также содержать наполнители, такие как маннит или лактозу (Lutrepulse (латрепалс) (гонадорелина ацетат для внутривенных инъекций), Справочник Physician"s Desk Reference, 50-е изд. , с. 980-982 (1996); Factrel (фактрел) (гонадорелин HCl для подкожных и внутривенных инъекций), Справочник Physician"s Desk Reference, 50-е изд., с. 2877-2878 (1996); Lupron (лапрон) (лейпролида ацетат для подкожных инъекций), Справочник Physician"s Desk Reference, 50-е изд., с. 2555-2556 (1996)). Такие препараты близких LHRH соединений должны либо храниться охлажденными, либо они могут храниться при комнатной температуре в течение коротких периодов времени.

Доступные депо-препараты близких LHRH соединений, которые назначают для непрерывного высвобождения в течение 1-3 месяцев, включают препарат, содержащий 15% близкого LHRH соединения, диспергированного в матриксе сополимера D, L-мoлoчнoй и гликолевой кислот, представляющий собой цилиндр для подкожного введения (Zoladex (золадекс) (имплантат госерелина ацетата), справочник Physician"s Desk Reference, 50-е изд., с. 2858-2861 (1996)) и препарат, состоящий из микрочастиц, содержащих ядро из близкого LHRH соединения и желатина, которые окружены оболочкой из сополимера D,L-молочной и гликолевой кислот. Данные микрочастицы суспендированы в разбавителе для подкожной или внутримышечной инъекции (Lupron depot (лапрон депо) (лейпролида ацетат для депо-суспензии), Справочник Physician"s Desk Reference, 50-е изд., с. 2556-2562 (1996); Статья "Preparation of Three-Month Depot Injectable Microspheres of Leuprorelin Acetate Using Biodegradable Polymers", Pharmaceutical Research, 11/8, с. 1143-1147 (1994)). Эти продукты могут храниться при комнатной или более низкой температуре. Известно, что водные препараты близких LHRH соединений отличаются как химической, так и физической нестабильностью, а также разлагаются после облучения (Статья "Stability of Gonadorelin and Triptorelin in Aqueous Solution", V.J. Helm, B.W. Muller, Pharmaceutical Research, 7/12, с. 1253-1256(1990); Статья "New Degradation Product of Des-Gly¹⁰-NH₂-LH-RH-Ethilamide (Fertirelin) in Aqueous Solution", J. Okada, T. Seo, F.Kasahara, K. Takeda, S. Kondo, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/2, с. 167-170 (1991); Статья "Characterizaton of the Solution Degradation Product of Histrelin, a Gonadotropin Releasing Hormone (LHRH) Agonist", A.R. Oyler, R.E. Naldi, J.R. Lloyd, D.A. Graden, C.J. Shaw, M.L Cotter, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/3, с. 271-275 (1991); Статья "Parenteral Peptide Formulations: Chemical and Physical Properties of Native Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH) and Hydrophobic Analogues in Aqueous Solution", M.F. Powell, LM. Sanders, A. Rogerson, V.Si, Pharmaceutical Research, 8/10, с. 1258-1263 (1991); Статья "Degradation of the LHRH Analog Nafarelin Acetate in Aqueous Solution", D.M.Johnson, R.A. Pritchard, W.F. Taylor, D.Conley, G.Zuniga, K. G. McGreevy, Intl.J. of Pharmaceutics, 31, с. 125-129 (1986); Статья Pharmaceutical Manipulation of Leuprorelin Acetate to Improve Clinical Performance", H. Toguchi, J. of Intl. Medical Research, 18, с. 35-41 (1990); Статья "Long-Term Stability of Aqueous Solutions of Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Assessed by an In-Vitro Bioassayand Liquid Chromatography", Y. F. Shi, R. J. Sherins, D.Brightwell, J.F. Gallelli, D.C. Chatterji, J. of Pharmaceutical Sciences, 73/6, с. 819-821 (1984); Статья "Peptide Liquid Crystals: Inverse Correlation of Kinetic Formation and Thermodynamic Stability in Aqueous Solution", M.F. Powell, J. Fleitman, L.M.Sanders, V.C.Si, Pharmaceutical Research, 11/9, с. 1352-1354 (1994); Статья "Solution Behavior of Leuprolide Acetate, an LHRH Agonist, as Determined by Circular Dichroism Spectroscopy", M.E. Powers, A.Adejei, M.Y.Fu Lu, M.C. Manning, Intl.J. of Pharmaceutics, 108, с. 49-55 (1994)).

Препараты, которые, как было показано, являлись стабильными (t₉₀ приблизительно пять лет) были очень низкоконцентрированными (25 мкг/мл) водными забуференными (10 мМ буфер, ионная сила 0,15) растворами, которые хранили при температурах, не превышающих комнатную температуру (25^oС) (Статья "Parenteral Peptide Formulations: Chemical and Physical Properties of Native Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH) and Hydrophobic Analogues in Aqueous Solution", M. F. Powell, L.M.Sanders, A.Rogerson, V.Si, Pharmaceutical Research, 8/10, с. 1258-1263 (1991)).

Существует потребность в стабильных препаратах пептидов.

Сущность изобретения

Данное изобретение представляет стабильные неводные препараты, которые являются растворами пептидных соединений в полярных непротонных растворителях. В частности, предложены препараты с концентрациями пептидных соединений, по меньшей мере, приблизительно 10%. Данные стабильные препараты могут храниться при повышенных температурах (например, 37^oС) в течение длительных периодов времени, и особенно пригодны для использования в имплантируемых доставляющих устройствах для продолжительной доставки (например, 1-12 месяцев или дольше) лекарственного вещества.

В одном аспекте изобретение представляет стабильные неводные препараты пептидных соединений, где указанные препараты содержат, по меньшей мере, одно пептидное соединение в, по меньшей мере, одном полярном непротонном растворителе. Предпочтительные препараты включают, по меньшей мере, приблизительно 10% (мас./мас.) пептидного соединения.

В другом аспекте изобретение представляет способы приготовления стабильного неводного препарата пептидного соединения, где указанные способы предусматривают растворение, по меньшей мере, одного пептидного соединения в, по меньшей мере, одном полярном непротонном растворителе. Предпочтительные препараты содержат, по меньшей мере, приблизительно 10% (мас./мас.) пептидного соединения.

В еще одном аспекте изобретение представляет способы лечения субъекта, страдающего от состояния, которое может быть облегчено назначением приема пептидного соединения, где указанные способы предусматривают введение указанному субъекту эффективного количества стабильного неводного препарата, содержащего, по меньшей мере, одно пептидное соединение и, по меньшей мере, один полярный непротонный растворитель.

Перечень чертежей

Фиг. 1 иллюстрирует стабильность 40% раствора лейпролида ацетата (мас. /мас. ) в диметилсульфоксиде (метилсульфоксиде или ДМСО) через два месяца хранения при 80^oС при определении с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) (RP-HPLC).

На фиг. 2 представлена RP-HPLC того же самого образца, что показан на фиг. 1, подвергнутого хроматографии с использованием молекулярных сит или гель-фильтрации (SEC), которая показывает образование 3% димеров и тримеров и отсутствие обнаружения агрегатов высшего порядка.

На фиг. 3 представлен график Аррениуса, показывающий потерю лейпролида в 40%-ных растворах лейпролида ацетата в диметилсульфоксиде (ДМСО).

Фиг. 4 иллюстрирует химическую и физическую стабильность 40% раствора лейпролида в ДМСО спустя шесть месяцев хранения при 80^oС.

Фиг. 5 иллюстрирует потерю лейпролида в 40% растворе лейпролида ацетата в ДМСО после шести месяцев хранения при 37, 50, 65^oС или 80^oС.

Фиг. 6 иллюстрирует химическую стабильность 40% раствора лейпролида ацетата в ДМСО после девяти месяцев хранения при 37^oС.

Фиг. 7 показывает, что увеличение концентрации пептида лейпролида в растворе ДМСО повышает стабильность при 80^oС.

Фиг. 8 иллюстрирует, что увеличение содержания влаги в препаратах 40% лейпролид-ДМСО приводит к снижению стабильности при 80^oС.

Фиг. 9 иллюстрирует, что в препаратах, представленных на фиг. 8, содержание продуктов химического разложения увеличивалось с повышением содержания влаги.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Данное изобретение подводит к неожиданному открытию того, что растворение пептидных соединений в неводных полярных непротонных растворителях приводит к образованию стабильных водных препаратов. Ранее известные препараты пептидных соединений, которые представляют собой разбавленные забуференные водные растворы, содержащие наполнители, такие как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) или аскорбиновая кислота, которые должны храниться при низких температурах (4-25^oС), образуют продукты разложения посредством таких способов разложения, как катализируемый кислотой/щелочью гидролиз, дезамидирование, рацемизация и окисление. Напротив, описанные в данной заявке препараты стабилизируют пептидные соединения при повышенных температурах (например, от 37 до 80^oС) и при высоких концентрациях (т.е., по меньшей мере, приблизительно 10%).

Стандартные пептидные и белковые препараты состоят из разбавленных водных растворов. Стабильность лекарственного вещества обычно достигается варьированием одного или более из следующих параметров: рН, тип буфера, ионная сила, наполнители (EDTA, аскорбиновая кислота и т.п.). Для данных препаратов пути разложения, при которых требуется вода (гидролиз, дезамидирование, рацемизация), не могут быть полностью стабилизированы. Напротив, в данном изобретении показано, что препараты, приготовленные в неводных растворах, таких как диметилсульфоксид (ДМСО) и диметилформамид (ДМФ), являются химически и физически более стабильными, чем препараты, приготовленные в воде. ДМСО и ДМФ считаются полярными непротонными растворителями. Непротонные растворители, как можно было бы ожидать, снижают скорость разложения, поскольку не способны поставлять протоны для реакций разложения. Напротив, растворители более полярные, чем вода, (например, дипольный момент воды составляет 1,85, ДМФ - 3,82 и ДМСО - 3,96), как ожидается, будут повышать скорость разложения, поскольку они могут участвовать в стабилизации определяющей скорость стадии и повышении скорости разложения. Однако мы обнаружили, что общий эффект полярных непротонных растворителей был направлен в основном на стабилизацию растворов пептидов.

Изобретение состоит в применении неводных непротонных растворителей, таких как ДМСО и ДМФ, для стабилизации препаратов пептидов в отношении как химического, так и физического разложения. Открытие состоит в реализации того факта, что применение ДМСО и ДМФ улучшает общую стабильность пептидов в широких пределах условий нахождения препарата, включая высокие концентрации и повышенные температуры, и тем самым делает возможной доставку пептидов в имплантируемых устройствах пролонгированного действия, которая иным способом была бы неосуществимой.

А. Определения

Термины, используемые в контексте данной заявки, имеют следующие значения:

Термин "химическая стабильность" означает, что процент продуктов разложения, образующихся химическими путями, такими как окисление или гидролиз, является приемлемым. В частности, препарат считают химически стабильным, если спустя два месяца хранения при 37^oС образуется не более чем приблизительно 20% продуктов распада.

Термин "физическая стабильность" означает, что процент агрегатов (например, димеров, тримеров и более крупных форм) является приемлемым. В частности, препарат считают физически стабильным, если через два месяца хранения при 37^oС образуется не более чем приблизительно 15% агрегатов.

Термин "стабильный препарат (состав)" означает, что через два месяца хранения при 37^oС (или в эквивалентных условиях при повышенной температуре) остается, по меньшей мере, приблизительно 65% химически и физически стабильного пептидного соединения. В частности, предпочтительными препаратами являются препараты, которые сохраняют, по меньшей мере, приблизительно 80% химически и физически стабильного пептида в данных условиях. Особенно предпочтительными стабильными препаратами являются препараты, которые не разлагаются после стерилизующего облучения (например, -, -лучами или электронным пучком).

Термины "пептид" и/или "пептидное соединение" означают полимеры из не более чем 50 остатков аминокислот, связанных амидными (CONH) связями. Аналоги, производные, агонисты, антагонисты и фармацевтически приемлемые соли любого из указанных материалов включают в данные термины. Термины включают также пептиды и/или пептидные соединения, которые содержат D-аминокислоты, модифицированные, дериватизированные или не существующие в естественных условиях аминокислоты в D- или L-конфигурации и/или пептомиметические единицы, являющиеся частью их структуры.

Термин "близкое LHRH соединение" означает лютеинизирующий гормон-высвобождающий гормон (LHRH) и его аналоги и фармацевтически приемлемые соли. Окта-, нона- и декапептидные агонисты и антагонисты LHRH включены в понятие близкие LHRH соединения, равно как природный LHRH. В частности, предпочтительные близкие LHRH соединения включают LHRH, лейпролид, госерелин, нафарелин и другие известные активные агонисты и антагонитсы (Zoladex (золадекс) (имплантат госерелина ацетата), справочник Physician"s Desk Reference, 50-е изд. , с. 2858-2861 (1996); Патент США 3914412, выданный 21 октября 1975 г.; Патент США 4547370, выданный 15 октября 1985 г.; Патент США 4661472, выданный 28 апреля 1987 г.; Патент США 4689396, выданный 25 августа 1987 г.;

Патент США 4851385, выданный 25 июля 1989 г.; Патент США 5198533, выданный 30 марта 1993 г.; Патент США 5480868, выданный 02 января 1996 г.; WO 92/20711, опубликованный 26 ноября 1992 г.; WO 95/00168, опубликованный 05 января 1995 г. ; WO 95/04540, опубликованный 16 февраля 1995 г.; Статья "Stability of Gonadorelin and Triptorelin in Aqueous Solution", V.J. Helm, B. W. Muller, Pharmaceutical Research, 7/12, с. 1253-1256(1990); Статья "New Degradation Product of Des-Gly¹⁰-NH₂-LH-RH-Ethilamide (Fertirelin) in Aqueous Solution", J. Okada, T. Seo, F.Kasahara, K.Takeda, S.Kondo, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/2, с. 167-170 (1991); Статья "Characterizaton of the Solution Degradation Product of Histrelin, a Gonadotropin Releasing Hormone (LHRH) Agonist", A. R.Oyler, R.E.Naldi, J.R.Lloyd, D.A.Graden, C.J. Shaw, M. LCotter, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/3, с. 271-275 (1991); Статья "Parenteral Peptide Formulations: Chemical and Physical Properties of Native Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH) and Hydrophobic Analogues in Aqueous Solution", M.F. Powell, L.M.Sanders, A.Rogerson, V.Si, Pharmaceutical Research, 8/10, с. 1258-1263(1991); Статья "Degradation of the LHRH Analog Nafarelin Acetate in Aqueous Solution", D.M.Johnson, R.A.Pritchard, W. F. Taylor, D.Conley, G.Zuniga, K.G.McGreevy, Intl.J. of Pharmaceutics, 31, с. 125-129 (1986); Статья "Percutaneous Absorption Enhancement of Leuprolide", M. Y.Fu Lu, D. Lee, G.S.Rao, Pharmaceutical Research, 9/12, с. 1575-1576 (1992); Lutrepulse (латрепалс) (гонадорелина ацетат для внутривенных инъекций), Справочник Physician"s Desk Reference, 50-е изд., с. 980-982 (1996); Factrel (фактрел) (гонадорелин HCl для подкожных и внутривенных инъекций), Справочник Physician"s Desk Reference, 50-е изд., с.2877-2878 (1996); Lupron (лапрон) (лейпролида ацетат для подкожных инъекций), Справочник Physician"s Desk Reference, 50-е изд., с. 2555-2556 (1996); Lupron depot (лапрон депо) (лейпролида ацетат для депо-суспензии), Справочник Physician"s Desk Reference, 50-е изд., с. 2556-2562 (1996)).

Термин "высокая концентрация" означает, по меньшей мере, приблизительно 10% (мас./мас.) и до максимальной растворимости конкретного пептида.

Термин "наполнитель" означает более или менее инертную субстанцию в препарате, которую добавляют как разбавитель или носитель или для придания формы или консистенции. Наполнители отличаются от растворителей, таких как ЕtOН, который используют для растворения лекарственных веществ в препаратах, от неионных поверхностно-активных веществ, таких как Tween 20, которые используют для солюбилизации лекарственных веществ в препаратах, и от консервантов, таких как бензиловые спирты или метил- или пропилпарабены, которые используют для предупреждения или ингибирования роста микробов.

Термин "полярный непротонный растворитель" означает полярный растворитель, который не содержит кислотный водород и не действует как донор водородной связи. Примерами полярных непротонных растворителей являются диметилсульфоксид (ДМСО), диметилформамид (ДМФ), гексаметилфосфотриамид (триамидгексаметилфосфорной кислоты) (ГМФТ) и н-метилпирролидон.

Термин "неводный протонный растворитель" означает неполярный растворитель, который содержит водород, связанный с кислородом или азотом таким образом, что он способен к образованию водородных связей или быть донором протона. Примерами неполярных протонных растворителей являются полиэтиленгликоли (ПЭГи), пропиленгликоль (ПГ), поливинилпирролидон (ПВП), метоксипропиленгликоль (МПГ), глицерин и гликофурол.

В. Приготовление препаратов

Данное изобретение касается неводных препаратов пептидных соединений в полярном непротонном растворителе, которые стабильны в течение увеличенных периодов времени при повышенных температурах. Стандартные разведенные водные препараты пептидов и белков нуждаются в манипуляциях с типом буфера, ионной силой, рН и наполнителями (например, EDTA или аскорбиновой кислотой) для того, чтобы достигнуть стабильности. Напротив, в заявленных препаратах стабильность пептидных соединений достигается путем применения неводных полярных непротонных растворителей. В частности, в препаратах, соответствующих данному изобретению была обеспечена стабильность соединения в высоких концентрациях (по меньшей мере приблизительно 10% (маc./маc.).

Примеры пептидов и пептидных соединений, препараты которых могут быть получены с использованием данного изобретения, включают такие пептиды, которые обладают биологической активностью или могут быть использованы для лечения заболевания или другого патологического состояния. Они включают, но не ограничиваются адренокортикотропным гормоном, ангиотензинами I и II, предсердным натрийуретическим пептидом, бомбезином, брадикинином, кальцитонином, церебеллином, динорфином А, - и -эндорфином, эндотелином, энкефалином, эпидермальным ростовым фактором, фертирелином, фолликулярный гонадотропин-высвобождающим пептидом, галанином, глюкагоном, гонадорелином, гонадотропином, госерелином, ростовой фактор-высвобождающим пептидом, гистрелином, инсулином, лейпролидом, LHRH, мотилином, нафарелином, нейротензином, окситоцином, соматостатином, субстанцией Р, фактором некроза опухоли, трипторелином и вазопрессином. Могут быть также использованы аналоги, производные, антагонисты, агонисты и их фармацевтически приемлемые соли.

Пептидные соединения, применяемые в препаратах и способах, соответствующих данному изобретению, могут быть использованы в форме соли, предпочтительно фармацевтически приемлемой соли. Используемые соли известны специалистам и включают соли неорганических кислот, органических кислот, неорганических оснований и органических оснований. Предпочтительными солями являются ацетаты.

Для использования в данном изобретении предпочтительными являются пептиды и пептидные соединения, которые легко растворимы в неводных полярных непротонных растворителях. Специалист может легко установить, какие соединения будут использованы на основе их растворимости, т.е. соединение должно быть растворимым в определенном неводном полярном непротонном растворителе до, по меньшей мере, допустимого количества. Предпочтительные значения растворимости составляют, по меньшей мере, приблизительно 10% (маc./маc.). Особенно предпочтительными пептидными соединениями являются близкие LHRH соединения, включая лейпролид и лейпролида ацетат.

Количественное соотношение пептида может изменяться в зависимости от соединения, состояния, которое лечат, растворимости соединения, ожидаемой дозы и длительности введения. (См., например, монографии: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Oilman и соавт., 7-е изд. (1985) и Pharmaceutical Sciences, Remington, 18-е изд. (1990), описания которых введены здесь в виде ссылки). Концентрация пептида в высококонцентрированных препаратах может изменяться в интервале от, по меньшей мере, приблизительно 10% (маc. /маc.) до максимальной растворимости соединения. Предпочтительным интервалом является от приблизительно 20 до приблизительно 60% (маc./маc.). В действительности более предпочтительным интервалом является от приблизительно 30 до приблизительно 50% (маc./маc.) и наиболее предпочтительным интервалом является от приблизительно 35 до приблизительно 45% (маc./маc.).

Было неожиданно установлено, что увеличение концентрации пептида, который растворен в неводном полярном непротонном растворителе, может повышать стабильность пептидного препарата. Например, как показано на фиг. 7, при хранении растворов 5, 10, 20 и 40% лейпролида в ДМСО в течение 8 недель при 80^oС с периодическим отбором и анализом образцов для определения процента сохранившегося лейпролида, препараты, содержащие лейпролид в более высоких концентрациях, были более стабильны, чем препараты с более низкими концентрациями лейпролида.

В большинстве случаев стабильные препараты, соответствующие данному изобретению, могут быть приготовлены простым растворением нужного количества, которое может быть терапевтически эффективным количеством, желаемого пептидного соединения в выбранном неводном полярном непротонном растворителе. Предпочтительные полярные непротонные растворители включают ДМСО и ДМФ.

Повышение содержания воды в пептидных препаратах, соответствующих данному изобретению, увеличивало разложение пептидов, как показано на фиг. 8. Очевидно, что данное увеличение может быть обусловлено в основном увеличением количества продуктов химической деградации при том, что агрегация остается относительно постоянной (фиг. 9).

Было также обнаружено, что неводные протонные растворители, такие как ПЭГ (полиэтиленгликоль), ПГ (пропиленгликоль) и ПВП (поливинилпирролидон) в необязательном порядке также могут быть добавлены в заявленные препараты.

С. Способы

Нами было показано, что стабильные неводные препараты пептидных соединений могут быть приготовлены путем растворения пептидного соединения, из которого готовят препарат, в неводных полярных непротонных растворителях.

Мы протестировали данные препараты пептидных соединений, в частности, препараты близкого LHRH соединения лейпролида, на стабильность, помещая их в условия ускоренного старения при повышенной температуре и измеряя химическую и физическую стабильность препаратов. Результаты данных исследований (представленные, например, а Таблице II и на фиг. 1, 2, 4, и 6) показывают, что эти препараты были стабильными в условиях, которые приближаются или превышают условия хранения в течение одного года при 37^oС.

Мы также протестировали препараты пептидных соединений, приготовленные, как описано в контексте заявки, на стабильность после -облучения 2,5 Мрад. Результаты, представленные в Таблице V, показывают, что данные препараты оставались химически и физически стабильными после такого облучения.

Как показано в Таблице I, мы протестировали широкий круг пептидных препаратов, в частности лейпролида, госерелина, LHRH, ангиотензина I, брадикинина, кальцитонина, энкефалина, инсулина, нейротензина, вещества Р, трипсиногена и вазопрессина на стабильность путем растворения (или попытки растворения) их в неводном полярном непротонном растворителе ДМСО с последующим помещением их в условия ускоренного старения при повышенных температурах. Была определена стабильность препаратов. Результаты представлены в Таблице I, как период полураспада при 37^oС, принимая, что Е_a=22,2 ккал/моль. Многие протестированные пептиды были растворимы в ДМСО и сохраняли стабильность в условиях тестирования. Растворимость определенного пептида в определенном неводном полярном непротонном растворителе и стабильность полученного раствора легко определяют с помощью рутинных способов, известных специалистам.

Для препаратов 40% пептида в ДМСО, которые хранили в течение шести месяцев при 37, 50, 65 и 80^oС, показан нелинейный характер кинетики Аррениуса, что определяли по общей потере пептида в растворе. Это указывает на стабильность данных препаратов при повышенных температурах. Анализ результатов, полученных при 37^oС, дает значение t₉₀=14,4 месяца, показывая, что стабильность при 37^oС остается очень хорошей.

Вероятно, температура влияет как на скорость разложения, так и на соотношение продуктов разложения в препаратах, соответствующих данному изобретению. Исследования препаратов лейпролид-ДМСО показали, что при 65 и 80^oС окисление, очевидно, является основным путем химического разложения. Напротив, при 37 и 50^oС гидролиз и изомеризация представляются доминирующими путями разложения данных препаратов.

Мы также неожиданно обнаружили, что определенные пептидные препараты, соответствующие данному изобретению, являются бактериостатическими (т.е. ингибируют рост бактерий), бактерицидными (т.е. вызывают гибель бактерий) и спороцидными (т.е. убивают споры). В частности, препараты, содержащие 50-400 мг/мл лейпролида, проявляли бактериостатическую, бактерицидную и спороцидную активность. На стабильность образцов не влияло внесение бактерий, что указывает на то, что ферменты, выделяющиеся из убитых или лизированных бактерий, не оказывают вредного воздействия на стабильность продукта. Это служит доказательством того, что на данные препараты не влияет активность ферментов.

Известно, что некоторые пептиды, например кальцитонин и лейпролид, являются физически нестабильными, проявляя агрегацию, образование геля и фибрилляцию, когда из них готовят водный раствор. Улучшение физической стабильности может повысить биодоступность, облегчить сенсибилизацию и получение иммунного ответа и предоставляет возможность более простого парентерального введения, включая введение с использованием имплантируемых систем для доставки лекарственных веществ.

Было неожиданно обнаружено, что определенные пептиды, такие как лейпролид, госелерин и кальцитонин, в виде препаратов в неводных полярных непротонных растворителях, соответствующих данному изобретению, не образуют гель. Образование геля не было обнаружено даже через 12 месяцев хранения при 37^oС. Это, вероятно, происходит потому, что неводные полярные непротонные растворители вызывают у пептидов формирование случайной закрученной -спиральной конформации, которая не переукладывается в структуру -листа и, вследствие этого, гель не образуется. Таким образом, данные растворители обладают антижелирующим эффектом.

Главным аспектом изобретения является то, что неводные растворы, содержащие пептидные соединения в полярных непротонных растворителях, являются химически и физически стабильными при высоких температурах в течение длительных периодов времени. Такие препараты стабильны даже при использовании высоких концентраций. Таким образом, данные препараты имеют преимущество в том, что они могут транспортироваться и храниться при комнатной и более высокой температуре в течение длительных периодов времени. Они также пригодны для применения в имплантируемых доставляющих устройствах.

Описание примеров изобретения

Для осуществления исследований, изложенных ниже в Примерах, используют следующие методы.

1. Приготовление растворов лейпролида ацетата

Лейпролида ацетат (полученный, например, от Mallinckrodt, St. Louis, Missouri) взвешивают и растворяют при перемешивании или с помощью центрифугирования в носителе (растворителе) (ДМСО, ДМФ, ДМСО/ПЭГ, ДМСО/ПГ или ДМСО/ПВП) в соответствующей концентрации. Термин сухой ДМСО относится к препаратам ДМСО, приготовленным в среде с низким содержанием влажности (т.е. в атмосфере сухого N₂).

До тех пор, пока не указано иначе, содержание лейпролида в виде свободного основания вычисляют по сертификату анализа величины активности, как равное 37% свободного основания. Это составляет 40% лейпролида ацетата за исключением указанных случаев.

2. Приготовление емкостей

Емкости для имплантируемых устройств для доставки лекарственных веществ (как описано в Патентной заявке США Serial 08/595761, введенной, здесь в виде ссылки) наполняют подходящим раствором лейпролида ацетата. Препарат вносят в титановые или полимерные емкости с полимерными пробками, закрывающими каждый конец. Наполненную емкость затем запечатывают в пакет из полимерной фольги и помещают в сушильный шкаф для тестирования на стабильность.

Следует отметить, что препараты в емкостях данных устройств полностью изолированы от внешней среды.

3. Обращенно-фазовая HPLC (ВЭЖХ. высокоэффективная жидкостная хроматография) (RP-HPLC)

Все исследуемые на стабильность образцы анализируют на концентрацию лейпролида и % площади пика с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ в режиме градиента элюции с использованием охлаждаемого автоматического пробоотборника (4^oС) для уменьшения разложения образца. Конкретные условия хроматографии приведены ниже в Таблице II.

Стандарты лейпролида (в воде) различных (от 4 до 6) уровней концентраций, обычно в интервале между 0,1-1,2 мг/мл, пропускают через колонку параллельно с образцами, исследуемыми на стабильность. Образцы, исследуемые на стабильность, проводят между наборами стандартов, не более чем по 40 образцов между наборами стандартов. Все пики, полученные между свободным ("мертвым") объемом и 45 минутами элюированияя, объединяют. Объединенные площади пиков стандартов лейпролида наносят на график как функцию концентрации. Затем вычисляют концентрации лейпролида для образцов, исследуемых на стабильность, используя линейную регрессию. Процент площадей пика для пика лейпролида, сумму всех пиков, элюированных до лейпролида (отмеченных как "другие") и сумму всех пиков, элюируемых после лейпролида (отмеченных как "агрегаты") также записывают и наносят на график как функцию точек времени выхода образца.

4. Хроматография с использованием молекулярных сит (гель-фильтрация) (SEC)

Отобранные образцы, исследуемые на стабильность, анализируют по % площади пика и молекулярным массам, используя SEC-анализ с изократным раствором и с охлаждаемым автоматическим пробоотборником (4^oС). Используемые условия хроматографирования представяют ниже в Таблице III.

Для вычисления молекулярных масс требуется определить свободный объем и общий объем колонки для гель-фильтрации. Для определения свободного объема и общего объема, соответственно, используют высокомолекулярный стандарт BioRad и 0,1% ацетон. Время удерживания первого пика в стандарте BioRad и пика ацетона записывают и переводят в единицы объема, используя приведенные ниже уравнения. Поскольку данные величины являются постоянными для определенной колонки, используемой для SEC и системы ВЭЖХ, то свободный и общий объемы определяют заново в случае внесения изменений в колонку для SEC или системы ВЭЖХ. Затем наносят стандартный образец, после которого проводят образцы, исследуемые на стабильность. Смесь стандартов содержит приблизительно 0,2 мг/мл следующих пептидов: бурсин (мол. масса = 449), пептид WLFR (мол. масса = 619), ангиотензин (мол. масса = 1181), GRF (мол. масса = 5108) и цитохром С (мол. масса = 12394). Данные стандарты выбирают потому, что молекулярная масса лейпролида заключена между их значениями и все они имеют основную рl (изоэлектрическую точку) (9,8-11,0), близкую pl лейпролида.

Процент (%) площадей пиков записывают для всех пиков. Молекулярные массы разделенных образцов вычисляют, используя приведенные ниже уравнения:

V_s = скорость потока (мл/мин) х время удерживания пика образца (мин);

V_o = скорость потока (мл/мин) х время удерживания пика свободного объема (мин);

V_t = скорость потока (мл/мин) х время удерживания пика общего объема (мин);



где V_s - объем стандарта или образца;

V_o - свободный объем;

V_t - общий объем.

V_s вычисляют для пика каждого стандартного пептида. Затем вычисляют Kd для каждого стандартного пептида, используя определенные ранее значения V_t и V_о. Линию линейной регрессии из графика logMW Vs. относительно Kd^-1 используют для определения молекулярной массы для каждого пика в образце, исследуемом на стабильность. Записывают также % площадей пиков для образцов, исследуемых на стабильность.

5. Оборудование и материалы

Для RP-HPLC и SEC используют следующее оборудование и материалы:

Систему ВЭЖХ Waters Millennium, состоящую из автоматического пробоотборника 717, насоса 626, контроллера 6000S, детектора с фотодиодной матрицей 900 и рефрактометрического детектора 414 (Waters Chromatography, Milford, MA)

Флаконы для ВЭЖХ; кассеты с 48 положениями и 96 положениями (Waters Chromatography, Milford, MA)

Колонку для ВЭЖХ HaiSil С18, 120 А, 5 мкм 4,6250 мм (Higgins Analytical, Mountain View, CA)

Колонку для SEC Pharmacia Peptide, HR 10/30 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Следующие примеры предложены для иллюстрации данного изобретения и никоим образом не должны быть истолкованы, как ограничивающие объем изобретения.

Пример 1

Ускоренные исследования стабильности препаратов лейпролида ацетата

Препараты 40% (маc./маc.) лейпролида ацетата (эквивалент приблизительно 37% лейпролида в виде свободного основания) в растворителе готовят, как описано выше, и используют для наполнения емкостей имплантируемых устройств для доставки лекарственных веществ, как также описано выше. Все емкости изготовлены из титана.

Наполненные устройства подвергают ускоренному старению путем хранения их при повышенных температурах (80^oС) в течение семи дней в духовом шкафу (Precision Scientific или Thelco). Это эквивалентно приблизительно 1,5 годам при 37^oС или приблизительно четырем годам при комнатной температуре (25^oС).

Образцы анализируют с помощью RP-HPLC или SEC, как описывают выше, с целью определения химической и физической стабильности выдержанных (состаренных) препаратов.

Результаты, представленные в Таблице IV, показывают, что данные препараты способны поддерживать стабильность близкого LHRH соединения лейпролида. В каждом из случаев сохраняется, по меньшей мере, 65% лейпролида.

Пример 2

Исследования стабильности облученных препаратов лейпролида ацетата

Препараты 40% (маc./маc.) лейпролида ацетата в ДМСО готовят, как описано выше, и используют для наполнения емкостей устройств для доставки лекарственных веществ, как также описано выше. Все емкости делают из титана.

Наполненные устройства отправляют в Sterigenics (Tustin, California), где их облучают -лучами (2,5 Мрад) в Sterigenics" Tustin Main Cell с 3-уровневым "стальным поддоном" с использованием облучения Кобальтом 60 (⁶⁰Со). В Таблице V образцы, отмеченные "cold" ("на холоду") транспортируют и облучают на сухом льду. Затем образцы подвергают ускоренному старению, как в Примере 1. Образцы отбирают на 0-й день и 7-й день и анализируют, используя RP-HPLC и SEC, как описано выше, с целью определения химической и физической стабильности облученных препаратов.

Результаты, представленные в Таблице V, демонстрируют, что данные препараты лейпролида ацетата стабильны после облучения. В каждом случае сохраняется, по меньшей мере, 65% лейпролида при низких уровнях образования агрегатов.

Пример 3

Ускоренные исследования длительной стабильности препаратов лейпролида ацетата

Готовят растворы 40% (маc. /маc.) лейпролида ацетата в ДМСО, вносят в емкости, хранят в течение двух месяцев при 80^oС и анализируют, как описано выше. Результаты, представленные на фиг. 1 (RP-HPLC) и 2 (SEC), показывают, что выделено 81,1% лейпролида при только 14,6% химического разложения и 5,1% физической агрегации.

Растворы лейпролида ацетата (маc./маc.) готовят, вносят в емкости, хранят при 80^oС в течение шести месяцев и анализируют, как описано выше. Фиг. 4 представляет собой график количества лейпролида и продуктов его химического и физического разложения, выделенных через шесть месяцев. Она показывает, что учитан весь пептидный материал, который исходно использован, и что данные препараты проявляют высокую стабильность при 80^oС. Сумму данных трех элементов представляют также как массовый баланс. На фиг. 5 представлен график натурального логарифма полученных данных, показывающий, что эти препараты демонстрируют линейную кинетику на протяжении всего исследованного интервала температур.

Химическая стабильность растворов 40% лейпролида ацетата, приготовленных и проанализированных, как описано выше, представлена на фиг. 6. Через девять месяцев хранения при 37^oС присутствует более чем 90% (93,5%) лейпролида с образованием менее чем 5% (2,9%) продуктов химической деградации (показаны как "ранние") и менее чем 5% (2,3%) продуктов физической агрегации (показаны как "поздние"), что представлено на основе данных RP-HPLC, но при хорошей корреляции с данными SEC.

Растворы 40% лейпролида ацетата (маc./маc.) в ДМСО готовят, вносят в емкости, хранят при 37, 50, 65 или 80^oС и анализируют с использованием RP-HPLC, как описано выше. Результаты вычисляют, как указано в монографии Physical Pharmacy: Physical Chemical Principles in the Pharmaceutical Sciences, 3-е изд., Martin et al., Глава 14 (1983). Показано, что потеря лейпролида в препаратах ДМСО носит нелинейный характер. Данные приведены ниже в Таблице VI и график Аррениуса представлен на фиг. 3.

Поскольку графики Аррениуса препаратов в ДМСО, хранящихся при 80^oС, показывают, что потеря лейпролида имеет нелинейный характер, используют полученные при 37^oС данные по стабильности для вычисления t₉₀ для данных препаратов при хранении 14,4 месяца при 37^oС.

Пример 4

Исследования стабильности препаратов лейпролида ацетата в ДМСО/воде

Препараты 40% лейпролида ацетата (мас./мас.) в ДМСО, ДМСО/воде (95:5, 90: 10, 70:30, 50:50 и 30:70) и воде готовят, как описано выше, и инкубируют в течение семи дней при 80^oС. Анализ с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) проводят на 0-й день и 7-й день.

Результаты показывают, что структурная конформация лейпролида очень незначительно изменяется после такого ускоренного старения во всех исследованных препаратах. В общем случае в препаратах с ДМСО пептидная структура является в основном случайно закрученной или -спиральной, тогда как в водных препаратах пептидная структура представлена в основном -складчатой конформацией.

Модификация вышеописанных способов выполнения различных вариантов осуществления данного изобретения будет очевидной для специалистов, которые следуют указаниям данного изобретения, как представлено в контексте заявки. Вышеописанные примеры не являются ограничивающими, но только представляют данное изобретение, объем которого определен следующей формулой изобретения.