иммуногенные пептиды вируса ящура

Формула изобретения

1. Вакцина против вируса ящура, содержащая одно активное вещество и целевые добавки, отличающаяся тем, что она содержит в качестве активного вещества по меньшей мере один пептид с последовательностью аминокислот, соответствующей части последовательности из области неструктурированного белка вируса ящура, которая была отобрана благодаря иммунореактивности со специфичными к вирусу ящура антителами или благодаря иммунореактивности со специфичными к вирусу ящура Т-лимфоцитами, в эффективном количестве, причем указанная последовательность выбрана из группы, включающей SEQ-ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 и 48.

2. Вакцина против вируса ящура по п.1, отличающаяся тем, что пептиды соответствуют частям областей на геноме вируса ящура, которые кодируют белки L/L", 2B, 2C, 3A, 3B, 3D.

3. Вакцина против вируса ящура по п.2, отличающаяся тем, что пептиды соответствуют частям областей на геноме вируса ящура, которые кодируют белки 2В, 2С, 3А, 3В.

4. Пептид с последовательностью аминокислот, соответствующей части последовательности из области неструктурированного белка вируса ящура, которая была отобрана благодаря иммунореактивности со специфичными к вирусу ящура антителами или благодаря иммунореактивности со специфичными к вирусу ящура Т-лимфоцитами, причем указанная последовательность выбрана из группы, включающей SEQ-ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 и 48.

5. Пептид по п.4, отличающийся тем, что соответствует частям областей на геноме вируса ящура, которые кодируют белки L/L", 2B, 2C, 3A, 3B, 3D.

6. Пептид по п.5, отличающийся тем, что соответствует частям областей на геноме вируса ящура, которые кодируют белки 2В, 2С, 3А, 3В.

7. Последовательность ДНК, кодирующая пептиды с последовательностью аминокислот, соответствующей части последовательности из области неструктурированного белка вируса ящура, которая была отобрана благодаря иммунореактивности со специфичными к вирусу ящура антителами или благодаря иммунореактивности со специфичными к вирусу ящура Т-лимфоцитами, причем указанная последовательность аминокислот выбрана из группы, включающей SEQ-ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 и 48.

8. Последовательность ДНК по п.7, отличающаяся тем, что кодирует пептиды с последовательностью аминокислот, соответствующей части областей на геноме вируса ящура, которые кодируют белки L/L", 2B, 2C, 3A, 3B, 3D.

9. Последовательность ДНК по п.8, отличающаяся тем, что кодирует пептиды с последовательностью аминокислот, соответствующей части областей на геноме вируса ящура, которые кодируют белки 2В, 2С, 3А, 3В.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к иммуногенным пептидам из, как минимум, 8 аминокислот, которые встречаются в неструктурированных областях вируса ящура.

Ящур является острым инфекционным заболеванием, которое поражает важнейших животных, дающих молоко и мясо, - крупный рогатый скот, свиней, коз и овец.

Болезнь вызывается пикорнавирусом, вирусом ящура. При этом имеется в виду РНК вируса с одноцепочечной РНК длиной 8,5 Т. н. с полярностью плюс-нити, которая может встречаться в различных серотипах с большим количеством подтипов. Животные, которые оправились от инфекции одного серотипа, остаются полностью восприимчивы к инфекции другого серотипа.

Первичная репликация вируса после заражения через дыхательные пути происходит в глотке. Затем инфицируются соседние лимфотические узлы и вирус ящура переходит в кровь. Через кровь вирус распространяется в различные органы и ткани. Клинические симптомы наступают через 2-14 дней после инфицирования независимо от дозы вируса, штамма вируса и пути заражения. В немногих тяжелых случаях инфекция преодолевается через 14 дней. Заражение вирусом ящура протекает у старых животных лишь в редких случаях со смертельным исходом, но оказывает существенное влияние на их продуктивность, рост и хорошее самочувствие. Кроме этого, выздоровевшие животные могут выделять вирус ящура несмотря на высокий титр антител и тем самым заражать других животных. Проблемой являются также вакцинированные животные, которые были подвержены действию инфекционного вируса. Эти животные могут тоже оставаться постоянно инфицированными, не проявляя клинических симптомов. Этих животных, которые хотя и здоровы, но несмотря на это являются носителями вируса ящура, называют "носителями", и они представляют серьезную опасность при дальнейшем распространении вируса ящура. Выделение вируса у свиней возможно до одного месяца после заражения (Van Bekkum, 1973) [10] в случае крупного рогатого скота возможно даже в течение нескольких лет (Hedger, 1970) [6].

Оболочка вирусной частицы состоит всегда из 60 реплик 4 структурных белков 1A-1D (Rueckert, 1990) [7], которые включают одноцепочечные РНК. Капсид ничем не покрыт и имеет икосаэдрическую форму. Белки 1В-1D расположены частично на поверхности, в то время как белок 1А (Р1А) находится в середине капсида.

Кодируемые в N-концевой части генома белки 1A-1D являются структурированными белками и образуют икосаэдрический капсид. Неструктурированные белки 2А-2С и 3А кодируются С-концом и являются ответственными за репликацию вируса.

Борьба с ящуром затрудняется вследствие простой контагиозности вируса, его способности инфицировать многие виды животных и вследствие его множественных антигенных форм.

Вакцинирование против ящура осуществляли в Германии до 1992 года с помощью тривалентной убитой вакцины для подтипов О, А и С. Эти вакцины, состоящие из инактивированных вирусов, являются, однако, термически нестабильными и не гарантируют продолжительный стойкий иммунитет (Terpstra и др., 1989) [9]. Опасность, которая исходит от вакцин, заключается прежде всего в присутствии неинактивированных вирусов в убитой вакцине и высвобождении вирусов из соответствующих источников продуцирования вакцины (Beck и др., 1987) [1].

В Европейском Союзе (ЕС) действуют ограничения на торговлю животными, у которых могут обнаруживаться антитела против вируса ящура. Это относится не только к животным, которые возможно перенесли инфекцию, но и к животным, иммунизированным обычной убитой вакциной.

По этой причине с тех пор проводятся усиленные исследования по разработке лучших вакцин против вируса ящура. Желательно бы было иметь в распоряжении вакцины, которые отличаются длительной устойчивостью, эффективным действием и высокой безопасностью. Были бы полезны, кроме того, вакцины или способы, которые дают возможность отличить вакцинированных животных от инфицированных.

Три обстоятельства должны быть, в частности, приняты во внимание при разработке вакцин со специфическими эпитопами:

1. Полиморфизм белков патогена появляется прежде всего в отрезках белков, участвующих в иммунном ответе. В частности, РНК вирусов ("квазивиды") содержат участки с предельно высокой изменчивостью последовательностей.

2. Именно при иммунном ответе Т-лимфоцитов существует высокая изменчивость отдельных индивидуумов вида организма-хозяина. Клетка Т-хелпера узнает, как правило, один определенный антигенный пептид только в связи с определенной молекулой класса II главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) (Schwartz, 1985) [8]. Каждый индивидуум выражает собственный состав молекул ГКГ, которые кодируются генами с высокой аллельной изменчивостью (ГКГ-полиморфизм). Поэтому каждый ответ Т-лимфоцитов в отношении пептидов может быть индивидуально различным.

3. Фракции Т-лимфоцитов показывают очень гетерогенные эффекторные механизмы, которые, конечно, как правило, кореллируют с ГКГ-рестрикцией (Mosmann и др. , 1989). Для вируса ящура у крупного рогатого скота до сих пор могли обнаружить только ограниченные ГКГ-II функции Т-хелперов (Glass и др., 1989) [3] ; (Glass и др., 1990) [4]; (Glass и др., 1992) [5]; (Соllen и др., 1991) [2].

Для получения пептидных вакцин должны быть прежде всего известны иммуногенные участки патогена, так называемые положения патогена, которые узнаются иммунной системой естественных видов организма-хозяина, а также В- или Т-лимфоцитами крупного рогатого скота и свиней. Об этом до сих пор не имеется никаких данных.

Наконец было найдено, что можно получать вакцины против вируса ящура на основе пептидов с последовательностью из, как минимум, 8 аминокислот, соответствующей части последовательности из области неструктурированного белка вируса ящура, которые были отобраны благодаря иммунореактивности со специфичными к вирусу ящура антителами или благодаря иммунореактивности со специфичными к вирусу ящура Т-лимфоцитами.

Подобные пептиды состоят предпочтительно из 8-35 аминокислот, особенно предпочтительно из 8-25 аминокислот, в высшей степени предпочтительно из 8-15 аминокислот.

Для получения вакцины против вируса ящура для свиней должны такие пептиды соответствовать частям областей на геноме вируса ящура, которые кодируют белки L/L", 1А, 1В, 1С, 2В, 2С, 3А, 3В, 3С, 3D.

Для получения вакцины против вируса ящура для крупного рогатого скота должны такие пептиды соответствовать частям областей на геноме вируса ящура, которые кодируют белки 1D, 2В, 2С, 3А, 3В.

Поэтому особенно предпочтительны пептиды, соответствующие частям областей на геноме вируса ящура, которые кодируют белки 2А, 2В, 2С, 3А, 3В, 3С, 3D.

В частности, здесь следует упомянуть указанные в протоколе последовательностей пептиды.

Особо следует указать представленные в протоколе последовательностей пептиды, обозначенные номерами 6, 8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 44, 45, 48.

Особо следует упомянуть, кроме этого, пептиды, обозначенные номерами 12, 13, 14, 22, 33, 37, 40, 41, 42, 45, 46, 47.

В высшей степени важно отметить пептиды, обозначенные номерами 12, 37, 40, 42, 45, 47, 48.

Продукты, которые содержат эти пептиды, могут применяться как для иммунизации с целью защиты от вируса ящура, так и для обнаружения заражения вирусом ящура, то есть для диагностических целей.

Как уже упоминалось, пептиды по изобретению соответствуют в участках областей неструктурированным белкам вируса ящура. Эти области определяют благодаря иммунореактивности со специфичными к вирусу ящура антителами или благодаря иммунореактивности со специфичными к вирусу ящура Т-лимфоцитами.

Под иммунореактивностью в этой связи понимают способность реагировать со специфичными к вирусу ящура антителами. Подтверждение реакции осуществляют в данном случае по взаимодействию специфичных к вирусу ящура антител со связанными на твердой фазе пептидами с помощью иммуноферментного анализа, в котором используют цветную реакцию.

Другая возможность подтвердить реактивность состоит в доказательстве конкуренции связывания специфичных к вирусу ящура антител с рекомбинантными вирусными белками с помощью соответствующих пептидов.

Под иммунореактивностью имеют в виду также способность пептидов взаимодействовать с лимфоцитами, которые были получены от инфицированных вирусом ящура животных/вакцинированных животных. Эти лимфоциты в состоянии после соинкубации с соответствующими пептидами проявлять специфические реакции: а) дополнительный, зависящий от концентрации пептида рост (специфичная к антигену пептида пролиферация); б) специфичное к пептидам дополнительное продуцирование специфических веществ (питокинов, например интерлейкина-2); в) а также дифференцировка к специфичным к вирусу цитолитическим Т-лимфоцитам, которые в состоянии узнавать соответствующие пептиды в ассоциации с молекулами, которые кодируются ГКГ, и лизировать клетки, которые несут соответствующие пептиды на поверхности.

Специфичные к ящуру антитела являются антителами, которые образуются у животного после вакцинации или заражения вирусом ящура и которые в состоянии узнать определенные структуры вируса ящура и связаться с этими структурами. Они могут быть обнаружены ex vivo, in vitro с помощью специфичного к вирусу иммуноферментного анализа. Специфичные к вирусу ящура антитела узнают при этом либо целый вирус, определенные вирусные белки, либо фрагменты белков в виде пептидов, которые кодируются специфичными к вирусу последовательностями.

Специфичные к ящуру Т-лимфоциты могут быть получены, когда мононуклеарные клетки выделяют из крови инфицированных вирусом ящура или вакцинированных животных.

Ниже приводится обзор возможных способов получения пептидов по изобретению. Эти способы должны только пояснить изобретение, но не ограничивать его каким-либо образом.

Для получения мононуклеарных клеток из крови свиней (мононуклеарные клетки периферической крови, МКПК) гепаринизированную кровь (0,1 мг гепарина в 1 мл крови) разбавляли в соотношении 1:2 забуференным фосфатом физиологическим раствором (ЗФР). Оттуда при комнатной температуре порциями по 30 мл переносят в 15 мл фиколла-гипака(1,077 г/мл в трубочке объемом 50 мл). После центрифугирования в течение 25 мин при 1100 g мононуклеарные лейкоциты могут быть осторожно отобраны пипеткой из интерфазы между сывороткой и фиколлом. Выделенные таким образом клетки промывают один раз ЗФР и дважды 20 мл культуральной среды для лимфоцитов/ 10% околоплодной сыворотки теленка в трубочке объемом 50 мл и осаждают при центрифугировании (каждый раз 10 мин, 750 g).

Обогащение Т-лимфоцитов с использованием колонок с найлоновой ватой

Этот способ обогащения Т-лимфоцитов основывается на физической адгезии В-лимфоцитов и части моноцитов с найлоновой ватой. Для этой цели найлоновую вату трижды нагревают до кипения в дистилированной воде до отметки 5 мл в неплотно закупоренных шприцах объемом 10 мл и автоклавируют (120^oС, 20 мин). Перед применением колонки дважды промывают 20 мл ЗФР. Для регулирования скорости слива насаживают канюлю диаметром 0,8 мм. При последующем промывании 10 мл культуральной среды для лимфоцитов промывную жидкость спускают до начала колонны и затем канюлю укупоривают резиновой пробкой. На каждую колонку наносят до 110⁸ МКПК в 1 мл среды, для чего резиновую пробку ненадолго оттягивают, чтобы позволить пройти содержащей клетки жидкости. Затем осторожно насаживают препятствующую разбрызгиванию пробку, чтобы предотвратить высушивание колонки и избежать заражения при последующей инкубации в течение 45 мин в шкафу для инкубации (37^oС, 5% двуокиси углерода). Т-лимфоциты или очищенные на найлоновой вате МКПК могут быть элюированы путем промывания колонки посредством насаженной канюли 20 мл культуральной питательной среды для лимфоцитов.

Определение иммунореактивности осуществляют известным образом согласно способам, описанным в следующих литературных источниках:

A. , Jonjic, S., H.-J., Reddehase, M. J. & Koszinowski, U. H. (1987). Моноклональные антитела, реактивные к лимфоцитам свиньи. II. Детектирование антигена на спящих Т-лимфоцитах с пониженной регуляцией после активации. J. Immunol. 138, 1852-1857.

A. & Maurer, S. (1994). Экспрессирующие свиные Т-лимфоциты антигена класса II главной гистосовместимости являются активными антиген-презентирующими клетками в смешанной культуре лейкоцитов. Immunobiol., 190, 23-34.

A., Hirt, W., Maurer, S. & Weiland, E. (1994). Отличие между двумя субпопуляциями свиных цитолитических Т-лимфоцитов CD8⁺ посредством экспрессии антигена CD5. Immunology, 81, 578-583.

Pauly, Т., Elbers, К., M., Lengsfeld, Т., A. & Thiel, H. -J. (1995). Классические специфичные к вирусу свиной лихорадки цитолитические Т-лимфоциты и идентификация эпитопа Т-лимфоцитов. J. Gen. Virol., 76, 3039-3049.

Summerfleld, A. , Rziha, H.-J. & A. (1996). Функциональная характеристика свиных экстратимусных Т-лимфоцитов CD4⁺ CD8⁺. Cell. Immunol., 168, 291-296.

Pauly, Т. , Weiland, E., Hirt, W., Dreyer-Bux, С., Maurer. S., Summerfield, A. & A. (1996). Дифференциация между ограниченными главным комплексом гистосовместимости и не ограниченными главным комплексом гистосовместимости свиными цитолитическими Т-лимфоцитами. Immunology, 88, 238-246.

В виде примера описывается следующее измерение специфичной к антигену вируса пролиферации (анализ пролиферации).

МКПК или выделенные оттуда клеточные популяции высевали в планшеты для титрования с круглым дном при числе клеток от 10⁵ клеток на микрокультуру (200 мкл/ячейка) при концентрации клеток в 110⁶/мл в минимально поддерживающей -среде. Стимуляцию осуществляли при добавлении вируса или пептидов из кодирующих областей генома вируса ящура (специфическое активирование). Данные о добавленных количествах вируса приводили в величинах, характеризующих множественность заражения (МЗ), которая соответствовала числу инфекционных частиц. Затем клетки культивировали в шкафу для инкубирования. Через 5 дней добавляли в каждую ячейку помещенный в 20 мкл среды ³H-тимидин, 37 кБк (1 мкКи), и культуру инкубировали еще 18 ч. Затем прекращали встраивание ³H-тимидина путем замораживания всего планшета для титрования и клетки лизировали. С помощью приспособления для сбора клеток содержимое планшетов для титрования отсасывали на фильтрационных матах. Их высушивали в микроволновой печи (160 Вт, около 5 мин). Затем наплавляли твердый сцинтилляторный планшет на фильтрационный мат в микроволновой печи (160 Вт, около 2 мин). После охлаждения сцинтиллятора фильтрационный мат приваривали в прозрачный чехол для проб и измеряли в сцинтилляционном счетчике радиоактивность отдельных культур по числу распадов в минуту (число отсчетов в минуту).

Определение содержания интерлейкина-2 из надосадочной жидкости клеточной культуры специфично к антигену вируса активированных Т-лимфоцитов (анализ интерлейкина-2)

Для полуколичественного определения содержания интерлейкина-2 (ИЛ-2) в культурах лейкоцитов свиньи применяют линию клеток НТ-2 мыши, зависящую от ИЛ-2. Эта линия клеток растет только в присутствии ИЛ-2, источником которого могут быть человек, мыши, а также свиньи. Пролиферация линии клеток НТ-2 является, таким образом, мерой содержания ИЛ-2 в надосадочной жидкости клеточной культуры, которая в свою очередь коррелирует с продуцированием ИЛ-2 соответствующей клеточной популяции.

После активации МКПК или выделенных оттуда клеточных популяций отбирали через 5 дней из соответствующих ячеек планшета для титрования 100 мкл не содержащей клеток надосадочной жидкости. Три параллельные пробы объединяли и титровали в планшетах для титрования с круглым дном ступенчато /log2/ (супернатант 1:1, 1:2, 1:4 и 1:8 в среде; в каждом случае 100 мкл/микрокультура). Наконец, прибавляют 100 мкл клеточной суспензии с 410³ клетками НТ-2 в ячейке так, чтобы конечный объем составлял 200 мкл/в ячейке. Для измерения пролиферации клеток НТ-2 в каждом случае помещали тройное количество культур. В качестве вещества сравнения использовали человеческий рекомбинантный ИЛ-2 с определенным числом международных единиц (ME) и титровали в несколько ступеней. Рост клеток НТ-2 количественно оценивали путем определения синтеза ДНК. Для этого прибавляли после 24 ч инкубации ³H-тимидин (37 кБк/микрокультура) и затем клетки инкубировали еще 18 ч в шкафу для инкубации. Дальнейший способ соответствовал таковому для измерения пролиферации лимфоцитов.

Измерение цитолитической активности специфичных к антигену вируса цитолитических Т-лимфоцитов

Специфичные к антигену вируса цитолитические Т-лимфоциты образуются посредством, как минимум, однонедельного сокультивирования МКПК инфицированного животного или выделенных оттуда клеточных популяций (210⁵ клеток/в ячейке) с аутологическими инфицированными вирусом ящура (1-10 МЗ) клетками эпителия почки. Специфичную к антигену вируса активность генерируемых при этом цитолитических Т-лимфоцитов (цТл) определяли с помощью анализа высвобождения ⁵¹Сr. В этих анализах цТл сокультивировали от 4 до 8 ч либо с аутологическими мечеными ⁵¹Сr, инфицированными вирусом ящура клетками эпителия почки, либо с нагруженными пептидами клетками эпителия почки и затем в надосадочной жидкости соответствующих клеточных культур определяли высвободившийся в результате активности цТл хром. В "холостом" опыте для данного исследования использовали неинфицированные клетки эпителия почки. Удельную активность цТл рассчитывают по следующей формуле:

% удельного лизиса = х - спонтанный лизис/общее встраивание - спонтанный лизис.

Для дальнейшего анализа эпитопов цТл использовали также рекомбинантные вирусы коровьей оспы - ящура, причем вирусы коровьей оспы несут частичные последовательности вируса ящура и выражают при инфицировании.

Получение пептидов осуществляли известным образом. Например, проводили множественные пептидные синтезы на модифицированном робототехническом устройстве фирмы Текан.

При этом для получения гексапептида в реакционные сосуды загружают в каждом случае 30 мг смолы, содержащей 5-(4-аминометил-3",5"-диметоксифенокси)валериановую кислоту (загрузка 0,4 ммоля/г). Для микросинтеза других пептидов к исходной смеси добавляют по 5 мг смолы, содержащей ринк-амид и 4-метилбензгидриламин (0,47 ммоля/г).

Затем последовательности получаемых пептидов могли задаваться управляющему вычислительному устройство синтезатора и необходимые аминокислоты с 9-флуоренилметилоксикарбонильной (Fmoc) защитой загружали в сборник. Аминокислоты растворяли в 0,5 М N-гидроксибензотриазоле (ГБТ) в диметилформамиде (ДМФА) до концентрации 0,5 М. Труднорастворимые аминокислоты обрабатывали 5-10 мин в ультразвуковой ванне до получения прозрачного раствора. Необходимый для активирования 2 М раствор дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) получали с использованием дихлорметана (ДХМ)/ДМФА (8:2). Пиперидин для отщепления Fmoc-защитной группы разводят до 40% в ДМФА и вместе с раствором ДЦГК подготавливают в синтезаторе. Синтез пептидов осуществляли посредством простого сочетания и проводили согласно следующему протоколу синтеза:

1. Отщепление Fmoc-защиты с помощью 40% пиперидина в течение 15 мин.

2. Шесть циклов промывки по 150 мкл ДМФА и по 0,3 мин.

3. Прибавление в реакционные сосуды 30 мл реагента для сочетания (2 М ДЦГК в ДМФА).

4. Прибавление 60 мкл активированной Fmoc-аминокислоты (кислота с Fmoc-защитой, растворенная в 0,5 М ГБТ/ДМФА).

5. Выдерживание этого раствора 60 мин для сочетания аминокислот.

6. Три цикла промывки по 150 мл ДМФА, 0,6 мин.

По окончании синтеза смолы дважды промывали серным эфиром (200 мкл) и сушили.

Для отщепления полученных при микросинтезе пептидов использовали модифицированный реагент К (0,75 г кристаллического фенола, 0,25 мл этандитиола, 0,5 мл тиоанизола). Все другие пептиды отщепляются с помощью тиоанизола/тиокрезола (1:1) в трифторуксусной кислоте (ТФУК). При этом синтезированные наращенные звенья отделялись от синтетического блока и отверстия для слива заполнялись жидким воском. Концентрированная ТФУК при этом медленно растворяла воск в сливном отверстии, и использующийся для отщепления раствор с уже отщепленным от смолы пептидом мог скапывать только в расположенные под синтезированными звеньями трубочки для очищенных пептидов. В трубочках для очищенных пептидов могут далее отщепляться защитные группы боковых цепей. При этом добавляли к каждому звену 150 мкл акцептора/раствора ТФУК и инкубировали 3 ч при комнатной температуре. В трубочки с очищенными пептидами затем прибавляли с помощью 8-канального разбрызгивателя примерно 1 мл серного эфира/гептана (1:1) и выдерживали 2 ч при -20^oС. Образовавшийся осадок центрифугированию (2000 об/мин, 5 мин), эфир декантировали и осадок дважды ресуспендировали с серным эфиром (1-2 мл) с помощью ультразвука и заново центрифугировали. В конце осадок растворяли в 1-1,5 мл трет-бутилового спирта/воды (4:1) и подвергали лиофилизации.

Выделение сывороток и определение содержания специфичных антител

Получение сывороток крупного рогатого скота и свиней

Неразведенную кровь инкубировали при комнатной температуре до свертывания и осаждения фибрина вместе с кровяными клетками. Находящуюся в надосадочной жидкости сыворотку делили на одинаковые порции и хранили при -20^oС.

Стандарт-пептид-ELISA

Стандарт-пептид-ELISA (ELISA=ферментный иммуносорбентный анализ) для обнаружения специфичных к вирусу антител в сыворотках инфицированных или вакцинированных животных проводили, как описано далее.

Планшеты для ELISA-теста (Nunc-Immuno Plate, фирма Максисорб) покрывали пептидами в концентрациях 0,5, 1 и 3 мкг в ячейке. Пептиды сначала растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 10 мг/мл. Из этого раствора затем готовили основной раствор в дистиллированной воде с концентрацией 1 мг/мл. Разведенный в дистиллированной воде основной раствор пептида в количестве 100 мкл затем высушивали в течение ночи при 37^oС. После этого планшеты предварительно инкубировали 2 ч при 37^oС с 3% сывороточного альбумина крупного рогатого скота (бычий сывороточный альбумин, БСА) в ЗФР, чтобы предотвратить неспецифичные связывания на последующих ступенях инкубирования. Планшеты после каждой ступени инкубации трижды промывали ЗФР-твином, перед прибавлением субстрата пять раз. И использованные сыворотки, и конъюгаты разбавляли 5% БСА в ЗФР.

Сыворотки инфицированного или вакцинированного крупного рогатого скота или свиней применяли в концентрации 1:100. В каждую ячейку добавляли по 80 мкл разведенной сыворотки и инкубировали 1 ч при 37^oС. После промывки туда прибавляли связанный с пероксидазой хрена конъюгат, либо козий против крупного рогатого скота (разведение 1: 2.500), либо козий противосвиной (разведение 1:5.000). Затем еще раз инкубировали 1 ч при 37^oС. После нескольких ступеней промывки для обнаружения позитивных проб добавляли 60 мкл субстрата/в ячейку. Субстратом служил растворенный в нитратном буфере ортофенилендиамин. Реакцию субстрата с пероксидазой хрена как цветную реакцию осуществляли при комнатной температуре в темноте. Реакцию останавливали примерно через 20 мин с помощью 2 М серной кислоты, если окрашивание использованного позитивного контроля было достаточным. Интенсивность окраски измеряли в измерительном устройстве для ELISA при 492 нм.

Биотин-стрептавидин-ELISA

Поскольку свиные сыворотки обнаруживают исключительно высокую неспецифическую реакцию, исследовали возможность повышения чувствительности системы измерения посредством модифицированного ELISA-теста. Для этого применяли биотинилированные пептиды.

Эти биотинилированные пептиды использовали в таких же концентрациях, как пептиды в стандарт-пептид-ELISA. Вместо дистиллированной воды их разводили с помощью ЗФР/0,5% БСА. Этот раствор вносили в количестве 100 мкл/в ячейку на покрытые стрептавидином планшеты для титрования и добавляли 50 мкл сьвворотки в соответствии с концентрациями для стандарт-пептид-ELISA.

После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре, трехкратной промывки буфером для промывки и добавления 150 мкл меченой пероксидазой хрена козьей против крупного рогатого скота антисыворотки или козьей противосвиной антисыворотки в ячейку (разведение см. для стандарт-пептид-ELISA) инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Вновь трижды промывали и добавляли 150 мкл в ячейку азино-ди-3-этилбензтиазолинсульфонат - субстратного раствора. Измерение экстинкции (оптической плотности) осуществляли каждый раз через 15 мин и через 1 ч при 405 нм в измерительном устройстве для ELISA.

ELISA для изучения конкуренции

Ранее проводимые ELISA-тесты, стандарт-пептид-ELISA и биотинстрептавидин-ELISA служат, как правило, для детектирования линейных эпитопов В-лимфоцитов. Часто, однако, соответствующие молекулы иммуноглобулинов узнают не линейные, а конформационные эпитопы. Этот вид эпитопов обнаруживается при определенных обстоятельствах в ELISA-тестах при изучении конкуренции. Для этого планшеты для ELISA-теста (Nunc-Immuno Plate, Максисорб) сначала покрывают в течение ночи 100 мкл белкового раствора в подходящей концентрации, который как раз обнаруживает еще положительную реакцию в стандарт-пептид-ELISA. Планшеты затем прединкубировали в соответствии с стандарт-пептид-ELISA в течение 2 ч с ЗФР/3% БСА. Перед добавлением сыворотки (концентрация 1: 1000) ее предварительно инкубировали в планшете для титрования в течение, как минимум, 1 ч с 100 мкг/мл предназначенных для исследования пептидов. Затем анализ проводили в соответствии с стандарт-пептид-ELISA.

Результаты

Идентификация линейных эпитопов В-лимфоцитов

Для идентификации линейных эпитопов В-лимфоцитов вируса ящура у крупного рогатого скота и свиньи пептиды (14-мер и 15-мер), которые были синтезированы в соответствии с открытым читаемым звездообразным расположением хромосом генома вируса ящура, исследовались на предмет того, узнаваемы ли они антителами сывороток инфицированных или вакцинированных животных.

Исследование синтетических пептидов вируса ящура на линейные эпитопы В-лимфоцитов у свиней

Пептиды, обозначенные номерами 6, 8, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 44, 45 в протоколе последовательностей, идентифицировались как эпитопы В-лимфоцитов свиньи.

Идентификация линейных эпитопов В-лимфоцитов вируса ящура у крупного рогатого скота

Пептиды, обозначенные номерами 12, 13, 14, 22, 33, 37, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48 в протоколе последовательностей, идентифицировались как линейные эпитопы В-лимфоцитов вируса ящура у крупного рогатого скота.

Отождествление конформационных эпитопов В-лимфоцитов с белком 3D вируса ящура

При проведении ELISA-теста для изучения конкуренции с рекомбинантным белком 3D были синтезированы 8 пептидов, которые в состоянии связывать из сыворотки специфичные к вирусу ящура антитела против белка 3D. Речь идет о пептидах, обозначенных номерами 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11 в протоколе последовательностей.

Использование линейных эпитопов В-лимфоцитов для распознавания отличия между инфицированными вирусом ящура и вакцинированными животными

В этом тесте исследовали сыворотки инфицированных различными серотипами вируса ящура и вакцинированных животных. Контролем служили сыворотки неинфицированных животных и сыворотки животных, которые были инфицированы вирусом бычьего лейкоза (БЛВ).

Было показано, что обозначенный номером 37 пептид из области 2В и номером 48 из области 3В вируса ящура позитивно реагировал с многими сыворотками инфицированных вирусом ящура или вакцинированных животных. С сыворотками инфицированных БЛВ животных или с негативными сыворотками, как правило, реакция не наблюдалась.

Далее можно обнаружить, что сыворотки животных, инфицированных штаммом O₁K вируса ящура, реагировали с наибольшим числом пептидов по сравнению с другими исследуемыми группами. Также может быть определено различие между инфицированными типом О и вакцинированными животными. В противоположность вакцинированным животным, которые прежде всего реагировали с пептидами, обозначенными номерами 37, 48, и с контрольным пептидом G1-32, сыворотки инфицированных животных проявили дополнительно четкую реактивность к пептидам, обозначенным номерами 12, 13, 40, 42, 45, 47, 48.