способ модификации связывания p53 или его мутантной формы с геном-мишенью

Формула изобретения

1. Способ модификации связывания р53 или его мутантной формы с геном-мишенью, включающий (б) выдержку р53 или его мутантной формы и гена-мишени с модулятором конформации, который относится к гену-мишени; (в) выявление связывания р53 или его мутантной формы с геном-мишенью.

2. Способ по п. 1, в котором модулятор конформации представляет собой интеркалирующее вещество.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором р53 и ген-мишень дополнительно выдерживаются с модулятором конформации, который относится к р53.

4. Способ по п. 3, в котором модулятор конформации воздействует на С-концевую регуляторную область р53.

5. Способ по п. 4, в котором модулятор конформации представляет собой антитело РАb 421.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором р53 представляет собой мутантную форму р53.

7. Способ по п. 6, где мутация р53 воздействует на способность связывания мутантного р53 с ДНК.

8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором ген-мишень представляет собой р21 или bax.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способу воздействия на связывание р53 с геном-мишенью. р53 представляет собой присутствующий в клетках животных и людей протеин, который называют "сторожем (контролирующим элементом) генома". р53 является специфичным в отношении последовательности трансактиватором, который активируется при повреждениях ДНК. В этой форме р53 связывается с промоторами генов-мишеней и активирует их транскрипцию. Вследствие этого либо происходит остановка роста клеток с последующей репарацией повреждений ДНК, либо наступает гибель клеток.

Было установлено, что во многих опухолях р53 теряет свою трансактивирующую активность. Это часто зависит от того, что нарушается связывание р53 с промоторами генов-мишеней или происходит регуляция нежелательных генов-мишеней.

В основу настоящего изобретения была положена задача разработать способ, который позволял бы воздействовать на связывание р53 с геном-мишенью.

Указанная задача согласно изобретению решается с помощью способа, представленного в формуле изобретения.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ воздействия на связывание р53 с геном-мишенью, в котором обеспечивают взаимное соответствие конформаций р53 и гена-мишени, прежде всего с использованием модуляторов конформаций, и непосредственно или косвенным образом выявляют связывание р53.

Настоящее изобретение основано на установлении того факта, что связывающиеся с р53 последовательности промоторов генов-мишеней могут иметь не только "нормальное" В-конформационное строение двухцепочечной ДНК (В-ДНК-конформацию), но и конформацию, отличную от В-ДНК-конформации (например, иметь крестообразную форму). Далее при создании изобретения было установлено, что р53 распознает связывающиеся с ним последовательности, имеющие как В-конформацию двухцепочечной ДНК, так и конформацию, отличную от В-ДНК-конформации. Однако распознавание происходит по-разному и зависит от конформации р53.

Согласно изобретению эти данные используют для воздействия на связывание р53 с генами-мишенями, при этом обеспечивают взаимное соответствие конформаций р53 и генов-мишеней прежде всего с помощью модуляторов конформаций и выявляют непосредственно или косвенным образом связывание р53.

Понятие "р53" относится к р53 любого вида и происхождения. Этот протеин может иметь последовательность дикого типа или может представлять собой подвергнутый мутации р53. В последнем случае он предпочтительно представляет собой такой р53, у которого в результате мутации изменена способность к связыванию с ДНК. р53 может также быть представлен в виде фрагмента р53, ответственного за связывание с ДНК. Кроме того, р53 может быть представлен в виде слитого полипептида. Он так же, как и любой другой р53, может быть представлен в виде кодирующего вектора.

Понятие "гены-мишени" относится к генам любого вида и происхождения, экспрессия которых регулируется р53. Примерами таких генов являются RGC, МСК, mdm2, циклин G, синтетический репортерный ген р53, р21 и bах, при этом предпочтительными являются р21 и прежде всего bах. р21 отвечает за опосредуемую р53 остановку роста клеток, а bах - за опосредуемую р53 гибель клеток. Понятие "гены-мишени" относится прежде всего к их промоторным последовательностям и главным образом к последовательностям, связывающимся с р53. Гены-мишени могут иметь любую ДНК-конформацию. Они могут присутствовать в клетках, прежде всего в клетках опухоли, или находиться в изолированном виде. Гены-мишени также могут могут быть связаны с другими последовательностями, прежде всего с такими, которые кодируют репортерный протеин.

Понятие "модуляторы конформации" относится к веществам любого типа, которые могут вызывать конформационные изменения нуклеиновой кислоты. Прежде всего оно относится к веществам, которые могут переводить ДНК из В-конформации двухцепочечной ДНК в конформацию, отличную от В-ДНК-конформации, или наоборот. Примерами таких веществ являются интеркалирующие вещества. Кроме того, понятие "модуляторы конформации" также относится к веществам любого типа, которые могут вызывать конформационное изменение р53. Примерами таких веществ являются вещества, которые позволяют модифицировать С-концевую регуляторную область р53, например антитело РАb 421.

Понятие "прямое или косвенное выявление связывания р53" относится к любому методу выявления такого связывания. Примерами таких методов прямого выявления являются методы, с помощью которых может быть определено связывание р53 с ДНК. К методам косвенного выявления относятся методы, которыми могут быть определены последствия связывания р53 с ДНК, например, такие как регуляция экспрессии репортерных генов, или биологические последствия, такие как остановка роста клеток или их гибель.

Предлагаемый способ можно осуществлять общепринятым путем. Так, например, связывающиеся с р53 последовательности, имеющие В-конформацию двухцепочечной ДНК или конформацию, отличную от В-ДНК-конформации, можно инкубировать вместе с р53 и при необходимости в присутствии модуляторов конформации и прямым образом выявлять связывание ДНК с р53. Кроме того, клетки, прежде всего клетки опухоли, у которых нарушена способность к связыванию ДНК с р53, можно также инкубировать вместе с модуляторами конформации и после облучения клеток выявлять связывание ДНК с р53 косвенным путем по остановке роста клеток или по гибели клеток.

Согласно настоящему изобретению оказывается возможным воздействовать на связывание р53 с генами-мишенями. Это обстоятельство можно использовать для исправления нарушенной способности к связыванию р53 с ДНК. Такое нарушение часто встречается в клетках опухоли. Кроме того, можно воздействовать на специфичность связывания р53 с ДНК таким образом, чтобы обеспечить регуляцию определенных требуемых генов-мишеней. Благодаря этому предлагаемое в настоящем изобретении решение может использоваться по крайней мере в качестве сопутствующей терапии при лечении опухолевых заболеваний.

Кроме того, настоящее изобретение предоставляет возможность поиска веществ, которые могут использоваться в качестве модуляторов конформации р53 и/или его генов-мишеней. В этом отношении предлагаемый способ осуществляют таким образом, что вместо известных модуляторов конформации применяют неизвестные, а известные модуляторы конформации при необходимости используют в качестве контроля.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показаны конформации ДНК олигонуклеотидов, которые содержат связывающиеся с р53 последовательности из RGC.

На фиг. 2 показано связывание р53 с олигонуклеотидами, которые содержат связывающиеся с р53 последовательности из RGC, при этом олигонуклеотиды имеют различные конформации ДНК. Следы 1 и 2 относятся к контролю.

На фиг.3 показаны ДНК-конформации олигонуклеотидов, содержащие связывающиеся с р53 последовательности из открытой Хуппом последовательности.

На фиг.4 показано связывание р53 с олигонуклеотидами, имеющими связывающиеся с р53 последовательности из последовательности Хуппа, при этом олигонуклеотиды представлены в различных ДНК-конформациях.

Ниже изобретение более подробно поясняется на примере.

Пример. Связывание р53 с геном-мишенью

(а) Связывание р53 с последовательностями из RGC. которые обладают способностью связываться с р53

Из линии клеток Sf9 насекомого, инфицированных рекомбинантными бакуловирусами, экспрессирующими р53 дикого типа, стандартным методом выделяли р53. По данным анализа в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) р53 имел чистоту более 80%. р53 использовали в реакции связывания с олигонуклеотидами. Эти олигонуклеотиды создавали в основе следующих олигонуклеотидов:



Эти олигонуклеотиды имели 1-2 "полусайта" связывающихся с р53 последовательностей из RGC и каждый из них имел идентичные концевые последовательности на своих 5"- и 3"-концах. Олигонуклеотиды применяли в реакции "отжига" с представленным ниже олигонуклеотидом, имеющим последовательности, комплементарные концевым последовательностям.

Таким путем получали олигонуклеотиды, которые представляли собой участки двухцепочечной ДНК, имеющей В-конформацию (структура II), соответственно участки ДНК, имеющей конформацию, отличную от В-конформации (структура I, соответственно III) (ср. фиг. 1). На концы этих олигонуклеотидов наносили радиоактивную метку и использовали в реакции связывания с р53. Реакцию проводили в течение 30 мин при комнатной температуре. Продукты реакции подвергали гель-электрофорезу в полиакриламидном геле.

Было установлено, что р53 связывается с олигонуклеотидами, имеющими любую из трех ДНК-конформаций, однако в различной степени. Наиболее сильное связывание имело место в случае одной из отличных от В-ДНК-конформаций (структура I), тогда как связывание с В-конформацией двухцепочечной ДНК (структура II), соответственно с другой отличной от В-ДНК-конформацией (структура III) являлось более слабым (ср. фиг.2). Эти результаты явно свидетельствуют о том, что на связывание р53 с геном-мишенью можно воздействовать путем изменения конформации гена-мишени.

(б) Связывание р53 с последовательностью Хуппа, которая обладает способностью связываться с р53

р53 применяли в реакции связывания с олигонуклеотидами аналогично методу, описанному в разделе (а). Их конструировали на основе приведенных ниже олигонуклеотидов:



Эти олигонуклеотиды содержали 1-2 "полусайта" открытых Хуппом последовательностей, связывающихся с р53. Эти связывающиеся с р53 последовательности отличаются тем, что р53 способен связываться с ними только после активации антителом РАb 421. Олигонуклеотиды применяли в реакции "отжига" с олигонуклеотидом, обозначенным в разделе (а) как "замок". В результате получали олигонуклеотиды, которые представляли собой участки ДНК, имеющие В-конформацию двухцепочечной ДНК (Hu/La-du/ds), соответственно конформацию, отличную от В-ДНК-конформации (Hu/La-2, соответственно Hu/La-1) (ср. фиг.3).

Было установлено, что р53 связывается с олигонуклеотидами, имеющими любую из трех конформаций ДНК, однако в различной степени. р53 связывается с олигонуклеотидом, имеющим В-конформацию двухцепочечной ДНК, только после активирования антителом РАb 421, тогда как его связывание с отличной от В-ДНК-конформацией осуществляется без модификации р53 (ср. фиг.4). С другой стороны, связывание РАb 421 с р53 вызывает ингибирование связывания р53 с этим олигонуклеотидом, имеющим отличную от В-ДНК-конформацию. Эти результаты явно свидетельствуют о том, что на связывание р53 с геном-мишенью можно воздействовать путем изменения конформации гена-мишени и р53.