иммуногенная композиция на основе tlp

Формула изобретения

1. Иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере один белок, полученный из TLP, или по меньшей мере один его иммуногенный фрагмент, который включает в себя по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей в себя последовательности

ArgThrAsnLysGluAlaSerlle

GlySerAlaXPheThrAsn

AsnGlnArgAsnArgAsp

или альтернативно последовательность

GlyProProGluValGlnAsnAlaAsn

в фармацевтически эффективной и приемлемой дозе.

2. Белок TLP или по меньшей мере его иммуногенный фрагмент, который включает в себя по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, указанных в п. 1, для изготовления вакцины в целях профилактики ракового заболевания у млекопитающих.

3. Белок TLP или по меньшей мере его иммуногенный фрагмент, который включает в себя по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, указанных в п. 1, для изготовления иммуногенного лекарственного средства для активной специфической иммунотерапии ракового заболевания у млекопитающих.

4. Белок TLP по п. 2 или 3, где указанное раковое заболевание представляет собой рак легкого.

5. Белок TLP по п. 4, где указанное раковое заболевание представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).

6. Белок TLP по п. 2 или 3, где указанное раковое заболевание представляет собой рак мочеполовой системы.

7. Иммуногенный фрагмент TLP, содержащий по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей в себя последовательности

ArgThrAsnLysGluAlaSerlle

GlySerAlaXPheThrAsn

AsnGlnArgAsnArgAsp

для изготовления вакцины в целях профилактики рака легкого у млекопитающих, эффективной для выработки у указанных млекопитающих иммунного ответа против указанного рака легкого.

8. Иммуногенный фрагмент TLP, содержащий по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей в себя последовательности

ArgThrAsnLysGluAlaSerlle

GlySerAlaXPheThrAsn

AsnGlnArgAsnArgAsp

для изготовления иммуногенного лекарственного средства для активной специфической иммунотерапии рака легкого у млекопитающего, эффективного для выработки у указанного млекопитающего активного специфического иммунного ответа против указанного рака легкого.

9. Иммуногенный фрагмент TLP по п. 7 или 8, где указанный рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).

10. Иммуногенный фрагмент TLP, содержащий следующую аминокислотную последовательность:

GlyProProGluValGlnAsnAlaAsn

для изготовления вакцины в целях профилактики рака мочеполовой системы у млекопитающих.

11. Иммуногенный фрагмент TLP, содержащий следующую аминокислотную последовательность:

GlyProProGluValGlnAsnAlaAsn

для изготовления иммуногенного лекарственного средства для активной специфической иммунотерапии рака мочеполовой системы у млекопитающего, эффективного для выработки у указанного млекопитающего активного специфического иммунного ответа против указанного рака.

12. Способ вакцинации млекопитающего против рака, включающий в себя введение указанному млекопитающему количества белка TLP или по меньшей мере одного его иммуногенного фрагмента, который включает в себя по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, указанных в п. 1, фармацевтически эффективного для выработки у указанного млекопитающего иммунного ответа против указанного рака.

13. Способ лечения ракового заболевания у млекопитающего путем активной специфической терапии, включающий в себя введение млекопитающему, в случае необходимости, количества белка TLP или по меньшей мере одного его иммуногенного фрагмента, который включает в себя по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, указанных в п. 1, фармацевтически эффективного для выработки у указанного млекопитающего активного специфического иммунного ответа против указанного рака.

14. Способ по п. 12 или 13, при котором указанный рак представляет собой рак легкого.

15. Способ по п. 14, при котором указанный рак представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).

16. Способ по п. 12 или 13, при котором указанный рак представляет собой рак мочеполовой системы.

17. Способ вакцинации млекопитающих против рака легкого, включающий в себя введение указанному млекопитающему иммуногенного фрагмента TLP, содержащего по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, выбранную из группы, включающей в себя

ArgThrAsnLysGluAlaSerlle

GlySerAlaXPheThrAsn

AsnGlnArgAsnArgAsp

в количестве, фармацевтически эффективном для выработки у указанного млекопитающего иммунного ответа против указанного рака легкого.

18. Способ лечения рака легкого у млекопитающего путем активной специфической терапии, включающей в себя введение млекопитающему, в случае необходимости, иммуногенного фрагмента TLP, включающего в себя по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, выбранную из группы, включающей в себя

ArgThrAsnLysGluAlaSerlle

GlySerAlaXPheThrAsn

AsnGlnArgAsnArgAsp

в количестве, фармацевтически эффективном для выработки у указанного млекопитающего активного специфического иммунного ответа против указанного рака легкого.

19. Способ по п. 17 или 18, при котором указанный рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).

20. Способ вакцинации млекопитающего против рака мочеполовой системы, включающий в себя введение млекопитающему иммуногенного фрагмента TLP, включающего в себя следующую аминокислотную последовательность:

GlyProProGluValGlnAsnAlaAsn

в количестве, эффективном для выработки у указанного млекопитающего иммунного ответа против рака мочеполовой системы.

21. Способ лечения рака мочеполовой системы у млекопитающего путем активной специфической терапии, включающий в себя введение млекопитающему, в случае необходимости, иммуногенного фрагмента TLP, включающего в себя следующую аминокислотную последовательность:

GlyProProGluValGlnAsnAlaAsn

в количестве, эффективном для выработки у указанного млекопитающего активного специфического иммунного ответа против указанного рака мочеполовой системы.

Описание изобретения к патенту

Предпосылки изобретения

Настоящее изобретение связано с областью иммунотерапии опухолевых заболеваний.

Предшествующий уровень техники

Онкологическая наука неоднократно направляла свои усилия в сторону проблемы иммунотерапии опухолевых заболеваний в поисках терапевтически эффективного раствора, способного к регуляции иммуноонколитической реакции, которую оганизм человека может развивать спонтанно. Первоначальным толчком к научным исследованиям в этом направлении послужили, как можно выяснить из ранних публикаций (I.S. Irlin, Virolody 1967, 32:725; E. Klen et al., Nat. Cancer Inst. 1964, 32:547; G.J. Pasternak J. Nat. Cancer Inst., 1965, 34:71, S. S. Tevethia et al., Immunol, 1968, 100:358; R. Nishioka et al., Monograph 1968, 7: 49), наблюдения, обнаружившие явление стимуляции специфических гуморальных и клеточных антител антигенами неопластических клеток у животных и у человека.

Иммунологические манипуляции, так же как и попытки разработки иммунотерапевтических подходов, отражали уровень знаний, достигнутых в области физиопатологии рака, а также знаний об иммунной системе хозяина; однако эти попытки были весьма затруднены из-за отсутствия подходящих иммуногенных агентов или в связи с многочисленными сложностями, связанными с преобладанием блокады клеточного иммунитета, имеющей место у раковых больных.

Фактически первоначально развивались два направления:

а) неспецифическая активация иммунитета хозяина в отношении усиления онколитических реакций (иммуноадъюванты);

б) специфическая активация иммунитета хозяина в отношении избирательной стимуляции продукции антител, обладающих онколитическим действием.

Преимуществом специфического подхода является возможность более специфически и более эффективно направлять иммунный ответ на борьбу с опухолевыми клетками.

В любом случае лизис опухолевых клеток под действием иммунной системы опосредован как прямыми цитотоксическими механизмами (NK-клетки), так и более сложными, но более специфическими и более эффективными цитотоксическими механизмами, включая узнавание антигенов на поверхности опухолевых клеток и присутствие антител (ADCC-цитотоксичность, преимущественно опосредованная клетками CD8+). Функционирование иммунной системы всегда связано со сложной сетью цитокинов, модулирующих действие эффекторных клеток, участвующих в "каскадном" механизме путем ингибирования или стимуляции.

До сих пор начинания в области иммунотерапии были направлены на общее усиление неспецифического иммунного ответа, опосредованного клетками, либо путем расширения (гормоны тимуса, IL-2 (интерлейкин-2), либо активации (БЦЖ, PPD (очищенный дериват протеина), IFN (интерфероны), IL-2, ТNF (факторы некроза опухоли) и т.д.) популяций лимфоцитов. Поиск решения проводился и на уровне эффектов каждого из таких веществ (IL-2, IFN и т.д.), однако для выявления индивидуального эффекта каждого из них приходилось сильно увеличивать дозу тестируемого вещества, что неминуемо приводило к значительным токсическим эффектам и слишком дорого обходилось (Mule JJ, Shu S., Swarz SL., Rosenberg SA. , Science, 225:1478, 1984; Hadden JW., in "Advances inimmunomodulation", 1988, Ed. B. Bizzini and E. Bonmasser, Pitagora Press Roma).

Предыдущие исследования показали нам, что комбинированная имимунотерапия (гормоны тимуса и цитокины, назначаемые в малых дозах, интерферон-альфа или интерлейкин-2) способны вызывать синергичное действие на цитотоксичную активность лимфоцитов (натуральных киллеров, лимфокинактивированных киллеров, цитотоксических лимфоцитов) в отношении опухолевых клеток определенного типа in vitro (Favalli, С., Mastino, A., Jezzi, Т., Grelli, S., Goldestein, A.L. and Garaci, E. , Int. J. Immunopharmacol., 11, 443-450, 1989; Mastino, A., Favalli, C., Grelli, S., Innocenti, F. and Garaci, E., Cell. Immunol., 133, 196-205, 1991).

Однако возрастание цитотоксической активности не соответствовало ни адекватному противоопухолевому ответу in vivo, ни увеличению степени выживаемости клеток (Favalli, С. , Mastino, A., Grelli, S., Pica, F., Rasi, G., Garaci, E. , Combination Therapits, pp. 275-280 Ed. by A. Goldstein and E. Garaci, Plenum Press, NY, 1992; Mastino, A., Favalli, C., Grelli, S., Rasi, G. , Pica, F., Goldestein, A.L. and Garaci, E., Int. J. Cancer. 50, 493-499, 1992; Garaci, E., Pica, F., Mastino, A., Palamara, А.Т., Belardelli, F., and Favalli, C., J. Immunother., 13, 7-17, 1993).

И наоборот, когда комбинированной иммунотерапии предшествовала химиотерапия (даже при использовании неэффектных доз), наблюдали полное выздоровление от опухоли (Mastino, A., Favalli, С., Grelli, S., Rasi, G., Pica, F., Goldestein, A.L. and Garaci, E., Int. J. Cancer. 50, 493-499, 1992; Garaci, E., Pica, F., Mastino, A., Palamara, А.Т., Belardelli, F., and Favalli, C., J. Immunother., 13, 7-17, 1993; Rasi, G., Sinibaldi-Vallebona P., Favalli, C., Pierimarchi, P., et al., 2nd International Symposium on Combination Therapies, documents, 1-3 May, 1992 - Santa Tecla CT).

Дальнейшие исследования на экспериментальных моделях показали, что иммунотерапия эффективна только в случае иммуногенной неоплазии и что основным назначением химиотерапии (применяемой в неэффективных количествах) является превращение неоплазии в иммуногенную опухоль (Rasi, G., Sinibaldi-Vallebona P., Favalli, C., Pierimarchi, P., et al., 2nd International Symposium on Combination Therapies, documents, 1-3 May, 1992 - Santa Tecla CT; Sinibaldi-Vallebona P., Pierimarchi, P., Ravagnan, G.P., Rasi, G., Third International Symposium on Combination Therapies, documents, 29-31 Oktober, 1993, Houston, Texas; Sinibaldi-Vallebona P., Pierimarchi, P., Lucertini, L., Ravagnan, G. P., Rasi, G., Fourth International Symposium on Combination Therapies, 14-17 June, 1994, documents, p. 105; Rasi, G., Siltcchia, G.F., Sinibaldi-Vallebona P. , Pierimarchi, P., Sivilia, M., Tremiterra, S., Garaci, E., Int. J. Cancer. 57, 701-705, 1994).

В настоящее время эта стратегия оказалась эффективной также и в отношении солидных опухолей человека (Rasi, G., Favalli, С., Terzoli, E., Izzo, F., Sinibaldi-Vallebona P., Pierimarchi, P., P., Sivilia, M., Garaci, E., Biomedicine & pharmacotherapy, 47-292, 1993).

Итак, на экспериментальных моделях нам удалось продемонстрировать отсутствие эффекта либо незначительный эффект каждого из воздействий в отдельности (химиотерапия, гормоны тимуса, цитокины), отсутствие противоопухолевого эффекта даже при существенном возрастании клеточной иммунной активности и лизис опухолевых клеток только в присутствии специфической, модулируемой клетками иммунной системы, цитотоксической активности в отношении неопластических клеток. На основании этих исследований можно сделать заключение, что роль антигена является решающей в плане индукции цитотоксического иммунного ответа со значительным противоопухолевым эффектом.

Следовательно, в попытках усиления противоопухолевого иммунного ответа очень большое значение имеют как способность антигенов индуцировать и модулировать иммунный ответ, так и знания об иммунологических отношениях внутри каждой системы "мишень/эффектор" (неопластические клетки/лимфоциты).

Комплексы TLP являются белковыми комплексами, присутствующими в опухолевых клетках человека. Среди таких TLP-белков описан белок с молекулярной массой 240 килодальтон (Tarro G., Oncology 40, 248-253, 1983). TLP выделен из опухолевых тканей, как описано в европейском патенте 0 283 443. В Европейском патенте 649 433 идентифицирован белок TLP, полученный из раковой опухоли легкого. В Итальянской заявке на патент RM96A 000 496 показано, что TLP, полученный из раковых опухолей урогенитальной системы, содержит пептиды, отличающиеся по последовательности от ранее идентифицированного TLP. Фрагменты белков из TLP могут быть получены также и синтетическим путем с использованием известных методов.

В 1993 году был идентифицирован новый опухолевый антиген с молекулярной массой 240 килодальтон, экстрагированный из неопластической ткани не-мелкоклеточного рака легких (NSCLC), и назван TLP (Tumor Liberated Particles, или частицы, высвобождаемые опухолью). В лабораториях Cold Spring Harbor (Нью-Йорк, США) к настоящему времени уже предпринят структурный анализ антигена рака легких, экстрагирован антиген с молекулярной массой 100 килодальтон, затем идентифицирована главная последовательность эпитопа TLP, синтезирован полипептид (нонапептид, CSH 275) и получено антитело (CSH 419).

Используя методы Вестерн-блоттинга после иммунопреципитации и иммуногистохимии (Р. А.Р.), показали, что это антитело (CSH419) способно узнавать последовательность антигена в гомогенатах, получаемых из всех протеститрованных на сегодняшний день неопластических тканей (NSCLC).

Пептид, заявленный в последовательности Seq. ID N1, a также другие, полученные из антигенной области TLP, были описаны и защищены в Европейском патенте 649 433, в соответствии с Международной заявкой WO-A-001 458.

Резюме по изобретению

Настоящее изобретение связано с фармацевтической композицией, содержащей, по крайней мере, один белок из комплекса TLP (Tumor Liberated Particles, или частицы, высвобождаемые опухолью) для терапевтического и иммуногенного использования.

Автор настоящего изобретения располагает на данный момент полной и точной документацией по клиническому использованию TLP в качестве иммуно-модулирующего агента (способного стимулировать иммунный ответ хозяина), используемая как для борьбы с неопластическими патологиями (иммунотерапия), так и для предотвращения возникновения раковых заболеваний (вакцинация).

На основе опыта, приобретенного в процессе изучения экспериментальных моделей, можно заключить, что для того, чтобы антиген, подобный TLP, можно было бы использовать в терапевтических целях, должны выполняться следующие главные условия:

1) наличие антигена на поверхности опухолевых клеток;

2) возможность фармакологически индуцировать или повышать экспрессию антигена на поверхности клеток;

3) способность антигена стимулировать лимфоциты со специфической противоопухолевой активностью (способность к бластогенезу и активность цитотоксических тимус-зависимых лимфоцитов);

4) присутствие TLP в сыворотке крови (указывает на возможную корреляцию между сывороточными уровнями и экспрессией антигена на клеточной поверхности) и отсутствие систем (почки или другие выделительные системы, такие как кожа или кишечник), обеспечивающих быстрый клиренс из крови.

При выполнении всех этих четырех условий применение (TLP) показано и в качестве терапевтического агента, и в качестве вакцины, в связи с его строго доказанной иммуногенностью.

Объектом настоящего изобретения, следовательно, является иммуногенная композиция и ее использование в качестве вакцины и в качестве лекарственного препарата, соответственно, в случаях профилактики и лечения рака, в частности, рака легких и рака мочеполовой системы, состоящая, по крайней мере, из одного белка, полученного из TLP, или, по крайней мере, его иммуногенного фрагмента.

Иммуногенные фрагменты белка TLP преимущественно содержат, по крайней мере, одну из следующих аминокислотных последовательностей (Seq):

ArgThrAsnLysGluAlaSerIle (Seq ID N1; WO-A-001458).

GlySerAlaXPheThrAsn (Seq ID N2; WO-A-001458).

AsnGlnArgAsnArgAsp (Seq ID N3; WO-A-001458).

Альтернативно, иммуногенная композиция согласно изобретению включает иммуногенный фрагмент, включающий следующую аминокислотную последовательность:

GlyProProGluValGlnAsnAlaAsn (Seq ID N1; Итальянская заявка на патент RM96A000496).

Краткое описание чертежей.

На фиг.1 показан результат эксперимента, выполненного на неопластических клетках, полученных из эксплантатов не-мелкоклеточного рака легких, методом проточной цитофлуориметрии (Facscan-BD).

На гистограмме правый пик указывает на связывание анти-TLP-антител с соответствующим антигеном на клеточной поверхности.

На фиг. 2 показан результат такого же эксперимента, что и на фиг.1, выполненного на тех же клетках из тех же самых эксплантатов, обработанных преиммунной сывороткой в качестве отрицательного контроля.

Пик, показанный на фиг.1, включающий значения флуоресенции между 10³ и 10⁴ и указывающий на связывание антигена с анти-ТLР-антителами, отсутствует.

Описание экспериментов

Присутствие антигена TLP на поверхности опухолевых клеток.

Антиген TLP изучали методом проточной цитофлуориметрии (Facscan-BD) на поверхности свежих неопластических клеток, полученных из мелкоклеточного рака легких (NSCLC).

Маркировку клеток производили с помощью моноклональных анти-ТLР-антител (CSH # 419, Cold Spring Harbor Lab. NY, USA), конъюгированных (на втором этапе) со вторичными козьими антителами против IgG-RPE кролика.

Специфичность связывания TLP с анти-TLP оценивали с помощью неспецифических антисывороток или преиммунной сыворотки. Специфичность клеточного фенотипа оценивали, маркируя клетки стабилизированных опухолевых линий или свежих клеток из неопластических тканей (кроме NSCLC) антителами против TLP.

Возможность лекарственной индукции или увеличения экспрессии антигена на поверхности клеток.

Клетки были процессированы в свежем виде и после приготовления первичных культур (полная культуральная среда RPMI 1640 с добавлением 10%-ной бычьей эмбриональной сыворотки).

Были изучены также, в зависимости от вариаций в TLP, и другие возможные модификации фенотипа (IL-2 rес (интерлейкиновые рецепторы), HLA-Dr (антиген лейкоцитов человека), CD16 (суб-популяции лимфоцитов) и т.д.), индуцированные обработкой одним или несколькими агентами (химиотерапия, цитокины).

В случае TLP свежевыделенные опухолевые клетки получали при хирургических операциях больных с не-мелкоклеточным раком легких; через 24 часа после посева удаляли фибробласты, а искомые клетки ресуспендировали для иммуногистохимических и цитофлуориметрических исследований; вкратце: CSH419-антисыворотку, меченную РЕ-конъюгированными антителами против IgG кролика, инкубировали с клетками. Для получения негативных контролей использовали преиммунную сыворотку кролика, а для положительных контролей (для иммуногистохимического анализа) - метод последовательных разведений вплоть до 500-кратного; не наблюдали никаких реакций при окрашивании или конъюгации с К562 и двумя линиями клеток меланомы у женщин. TLP обнаруживали на 75% всех изученных линий клеток NCLC.

Предварительные исследования методом конфокальной микроскопии выявили цитоплазматическую и мембранную локализацию TLP в клетках опухоли. Показали, что экспрессию антигена TLP можно усилить или вызвать in vitro химиотерапевтическим воздействием: первичная культура клеток NSCLC становится TLP-позитивной после воздействия цис-платиной или этопозидом.

Замораживание TLP в культуральных супернатантах контролировали с помощью теста EL ISA.

Одновременно проводили эксперимент, состоящий в назначении цис-платины и этопозида сывороточно негативным больным не-мелкоклеточным раком легких, с целью проверки реакции на продукцию TLP in vivo.

Способность антигена стимулировать лимфоциты со специфической противоопухолевой активностью (бластогенная способность и активность цитотоксических тимус-зависимых лимфоцитов).

Лимфоциты, полученные из периферической крови больных, у которых были эксплантированы опухолевые клетки (аутологичные лимфоциты), анализировали методом проточной цитофлуориметрии (фенотипы CD4/CD25, CD8/CD25, CD56-16-3/CD25) до и после обработки TLP in vitro, индивидуально или совместно с химиотерапией и/или цитокинами.

Цитотоксическую активность аутологических лимфоцитов (обработанных и необработанных) определяли через 4 часа по высвобождению ⁵¹Сr, используя опухолевые клетки, полученные из эксплантатов опухоли того же больного, что и клетки-мишени.

Лимфоциты здоровых доноров и больных, страдающих другими неопластическими патологиями, использовали (в качестве эффекторов) против неопластических клеточных линий (чувствительных и резистентных мишеней натуральных киллеров) в качестве контроля для установления специфической природы опухолевого лизиса.

Присутствие TLP в сыворотке

Для установления наличия TLP и в сыворотке больных не-мелкоклеточным раком легких, и в сыворотке больных, страдающих другими заболеваниями (неопластические заболевания, отличные от не-мелкоклеточного рака легких; не неопластические патологии легких), и в контрольных сыворотках, использовали тест ELISA с аналитической схемой "сэндвич".

РЕЗУЛЬТАТЫ

Наличие антигена TLP на поверхности опухолевых клеток.

Наличие антигена TLP на поверхности клеток не-мелкоклеточного рака легких было показано с использованием описанного метода. Данные, приведенные на фиг. 1, служат примером позитивной опухоли. Можно заметить, что обработка преиммунной сывороткой не приводит к образованию сигнала, в то время как метка анти-ТLР#419 выявляет TLP-позитивную популяцию клеток.

Способность к лекарственной индукции или к повышению экспрессии антигена на поверхности клеток.

Две TLP-позитивные опухолевые популяции клеток обрабатывали в течение 48 часов цис-платиной и этопозидом (10 мкг/мл):

2 TLP-негативные клеточные популяции стали TLP-позитивными после обработки этопозидом;

1 TLP-негативная клеточная популяция стали TLP-позитивной после обработки цис-платиной;

TLP-позитивная клеточная популяция осталась TLP-позитивной после обработки цис-платиной и этопозидом.

Результаты теста EL ISA, используемого для проверки (возможности) замораживания TLP в клеточных супернатантах клеточных культур, сопоставимы с данными, представленными в таблицах II-IV о наличии TLP в сыворотке больных не-мелкоклеточным раком легких.

Назначение одного и того же химиотерапевтического препарата TLP-негативным больным вызывает после всего лишь двух циклов приема интенсивный положительный ответ в отношении TLP в тесте EL ISA.

Способность антигена стимулировать лимфоциты со специфической противоопухолевой активностью (способность к бластогенезу и активность цитотоксических тимус-зависимых лимфоцитов).

Обработка in vitro лимфоцитов больных не-мелкоклеточным раком легких с помощью TLP вызывает бластную активность, в частности, против определенных фенотипов: активированных клеток, которые экспрессируют высокоаффинный рецептор к интерлейкину-2 (CD3+/CD25+); натуральных киллеров (NK-клеток, CD56+/CD16+/CD3); активированных цитотоксических клеток CD25+/CD8+ (таблица 1).

Обработка лифмоцитов с помощью TLP также способна индуцировать литическую активность как NK-клеток (натуральных киллеров, клеток-мишеней К562), так и цитотоксических тимус-зависимых лимфоцитов (по отношению к клеткам их собственной опухоли). Активность натуральных киллеров так же зависит от дозы, как и наблюдаемая для (CD8+CD25+)-клеток, и так же тесно коррелирует с числом указанных клеток. Это наблюдение, вместе с отсутствием литической активности (либо спонтанной, либо индуцированной TLP) LAK-типа (активированные лимфокином киллерные клетки, таргетированные NK-клетки, клетки Daudi), указывает на специфическую природу активации.

Показано также, что гомологичные лимфоциты, обработанные TLP, сами по себе активны на поверхности метастазирующих в мозг клеток, происходящих из не-мелкоклеточного рака легких.

Наличие TLP в сыворотке

Результаты, полученные с помощью метода EL ISA с аналитической схемой "сэндвич", приведены в таблицах 2-5.

Более того, измерение уровней TLP у больных с не-мелкоклеточным раком легких дает в результате 56% (см. таблицу II); этот результат нужно сравнивать с 35-40%, полученными при применении "cyfra", другого маркера, предложенного для рака легких. Более того, данные по специфичности связывания дают около 100% для TLP против 60-70% для "cyfra".

Аналогичным образом синтетический полипептид (Seq. ID N1; W-A-001458) демонстрирует исключительные иммуногенные возможности, при изучении выявлена специфическая стимуляция цитотоксических лимфоцитов CD8 только у больных, страдающих не-мелкоклеточным раком легких.

Эксперименты, проведенные на мышах "skid", показали, что вакцинация последовательностью Seq. ID N1, W-A-001 458 защищает животных от роста от 1.800.000 до 6.000.000 опухолевых клеток.

Аналогичные результаты получены и для других заявленных пептидов.

Окончательное заключение

Результаты исследований, проведенных на TLP, производных пептидов и пептиде GlyProProGluValGlnAsnAlaAsn, полученном из аналогичного белка, экстрагированного из раковых тканей мочеполовой системы, обнаружили иммунологическое противоопухолевое действие, направленное против них.

Фактически присутствие TLP на поверхности клеток не-мелкоклеточного рака легких и его способность стимулировать специфическую противоопухолевую активность лимфоцитов (способность к бластогенезу и активность цитотоксических тимус-зависимых лимфоцитов) со всей очевидностью доказывают иммуногенность этого белка. Аналогичные результаты получены и для пептидов с последовательностями Seq. ID N1 (W-A-001 458) и двух других пептидов Seq. ID N2 и Seq. ID N3, также полученных из антигенной области белка TLP.

Ценность и значимость этого подхода подтверждается также и фактом обнаружения TLP в сыворотке больных не-мелкоклеточным раком легкого, указывая на прямую связь между наличием опухоли и уровнем TLP в крови. Следовательно, терапевтическое применение TLP или его пептидов может оказаться весьма полезным и перспективным, поскольку, как выяснилось, их иммуногенетически активная последовательность не имеет гомологий среди других белков человека.

Назначение TLP или производных пептидов, следовательно, должно оказаться более специфичным и эффективным, чем неспецифическая активация иммунной системы хозяина, и менее деструктивной, чем назначение одних только химиотерапевтических препаратов.

Однако назначение химиотерапии может также усиливать действие TLP в связи с обнаруженной способностью химиотерапевтических препаратов индуцировать продукцию антигена как в клеточных культурах, так и у больных не-мелкоклеточным раком легких, у которых исходно наблюдается отсутствие TLP в сыворотке крови.

Это прямое следствие из результатов экспериментов, полученных при применении индивидуальных или комбинированных химиотерапевтических агентов. Как было показано ранее, фактически применение этопозида и цис-платины на культурах опухолевых клеток вызывает стимуляцию продукции TLP, сравнимую по уровню с той, которая регистрируется у больных с не-мелкоклеточным раком легкого с положительной сывороточной реакцией на антиген, и назначение тех же самых химиотерапевтических препаратов больным с первоначальной TLP-отрицательной сывороточной реакцией (EL ISA) делает этих больных интенсивно TLP-положительными уже после двух циклов химиотерапии.

J пептида GlyProProGluValGlnAsnAlaAsn, полученного из белка, аналогичного TLP, экстрагированного из пораженных тканей при раке мочеполовой системы, в результате проведенных исследований обнаружили аналогичный иммунотерапевтический эффект для всех форм рака мочеполовой системы.

Все эти данные указывают как на терапевтическую, так и на профилактическую (вакцинацию) возможности использования этих пептидных молекул, благодаря их строго адресной иммуногенной активности. Вообще использование белков, полученных из TLP и его аналогов, пригодно как для человека, так и для животных. То же самое относится и к пептидам, приведенным в экспериментальной части.

Фактически иммунный ответ может быть вызван как для борьбы с ростом и экспансией опухоли (применение эффективно также и в случае метастазирования, как было предварительно показано), так и для защиты здорового человека от возможного развития заболевания. Это, в частности, подтверждают данные, предварительно полученные на мышах "skid".