способ получения низкомолекулярного хитозана для противолучевых препаратов

Формула изобретения

Способ получения низкомолекулярного хитозана для противолучевых препаратов ферментативным расщеплением раствора хитозана, отличающийся тем, что ферментативное расщепление проводят растворимым комплексом микробных хитинолитических ферментов при рН 4,5-5,5, температуре 40-50^oС в течение 30-60 мин при соотношении хитиназная активность-хитозан от 0,5 до 2,0 ед. активности на 1 г хитозана, затем реакционную массу выдерживают 3-7 мин на кипящей водяной бане, охлаждают, концентрируют, фильтруют, фракционируют и полученный раствор диализуют против воды.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано для создания на основе природных полисахаридов новых радиопротекторов.

Известен способ получения низкомолекулярного хитозана кислотным гидролизом хитозана с помощью азотистой кислоты [1]. Однако в этом случае трудно получить продукт со средневязкостной молекулярной массой ниже 20000 Да, к тому же происходит химическое дезаминирование концевого остатка сахара с изменением строения полисахарида.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана ферментативным гидролизом хитозана с помощью иммобилизованного хитиназного комплекса [2]. Главным достоинством этого способа является возможность получения с высоким выходом низкомолекулярного водорастворимого хитозана с высокой степенью чистоты. Однако процесс проводится в две стадии, сначала при рН 4,5-5,0, а потом при рН 6,0-6,5. Суммарное время проведения процесса составляет от 24 до 28 часов, и при этом получается хитозан с широким разбросом по средневязкостной молекулярной массе от 5 до 20 кДа.

С целью преодоления указанных недостатков предлагается упрощенный способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана ферментативным гидролизом раствора хитозана с последующим выделением фракции, характеризующейся радиопротекторными свойствами.

Выбор оптимальной средневязкостной молекулярной массы низкомолекулярного хитозана, получаемого предложенным способом, был осуществлен на основе сравнительной оценки показателей острой токсичности и противолучевой эффективности хитозанов с ММ 30, 10 и 5 кДа. Острую токсичность образцов хитозана определяли по показателю летальности в опытах на нелинейных мышах-альбиносах. Наблюдение за животными проводили в течение 5 суток после внутривенного введения образцов в разных дозах. Результаты обработаны пробит-методом и установлены значения полулетальных доз (СД 50), а также СД 84 и СД 16. Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что по мере уменьшения молекулярной массы хитозана уменьшается и его токсичность.

Противолучевая (защитная) эффективность хитозана исследована на нелинейных белых мышах и гибридах F1(CBAC57B1). Образцы с ММ 30, 10 и 5 кДа вводили внутривенно перед облучением (за 10-20 минут). Мышей облучали гамма-лучами Cs137 в дозах 8,0 и 8,25 Гр с мощностью 1,25 Гр/мин. Установлено, что хитозан с ММ 30 и 10 кДа, вводимый соответственно в дозе 20 и 50 мг/кг, способствует выживаемости 89-100% животных при почти полной гибели контрольных. Увеличение или уменьшение доз этих образцов приводит к уменьшению или отсутствию защитного действия. При использовании хитозана с ММ 5 кДа защитное действие либо заметно уменьшается, либо не проявляется совсем.

Таким образом, по совокупности свойств, т.е. проявлению наименьшей токсичности при максимальной противолучевой защите, оптимальными оказались образцы хитозана с ММ 102 кДа.

Сущность предложенного способа заключается в том, что 1-2% раствор хитозана при рН 4,5-5,5 инкубировали при 40-50^oС в присутствии комплекса хитинолитических ферментов в течение 20-60 минут. Затем реакционную массу выдерживали 3-7 минут на кипящей водяной бане, охлаждали, фильтровали и фракционировали либо с помощью хроматографии, либо с помощью мембранных технологий, выделяя при этом фракцию с ММ от 8 до 12 кДа. Продукт диализовали против воды и высушивали. Полученное вещество водорастворимо (до 50 мг в 1 мл) и легко стерилизуется кипячением, нетоксично.

Пример 1.

Растворяют 1 г крабового хитозана со степенью деацетилирования (СД) 85% и молекулярной массой около 400 кДа в 100 мл 0,2 М ацетата натрия при рН 5,0. Раствор нагревают до 45^oС, добавляют фильтрат культуральной жидкости Streptomyces kurssanovii (1 единицу активности) и инкубируют 30 минут при той же температуре. Затем гидролизат выдерживают 5 минут на кипящей водяной бане, охлаждают, концентрируют на роторном испарителе, фильтруют и наносят на хроматографическую колонку с сорбентом Био-Гель П-4, уравновешенную 0,1 М ацетатом натрия при рН 6,0. Проводят элюцию тем же раствором, выделяя фракции с ММ 8-12 кДа, которые объединяют, диализуют против воды и лиофильно высушивают.

Получают 0,7 г низкомолекулярного хитозана в виде белого порошка, растворимого в воде.

Эффективность низкомолекулярною хитозана с ММ 8-12 кДа устанавливалась в опытах на облученных мышах. Хитозан вводили мышам F₁(CBAC57B1) внутривенно в дозе 50 мг/кг за 10-30 мин до облучения в дозе 8,25 Гр: из 7 защищенных мышей через 30 суток после облучения выжило 7 при гибели всех контрольных животных.

Пример 2.

Растворяют 1 г хитозана антарктической креветки (криля) со СД 90% и молекулярной массой 150 кДа в 100 мл 0,1 М ацетата натрия при рН 5,5. Раствор нагревают до 50^oС, добавляют фильтрат культуральной жидкости (0,5 единиц активности) и инкубируют 60 минут при той же температуре. Затем гидролизат выдерживают 3 минуты на кипящей водяной бане, охлаждают, концентрируют методом ультрафильтрации до объема 10 мл, фильтруют и наносят на колонку с сорбентом Сефадекс Г-25, уравновешенную 0,15 М ацетатом натрия при рН 5,0. Проводят элюцию тем же раствором, выделяя фракции с молекулярной массой 8-12 кДа, которые объединяют, диализуют против воды и высушивают на распылительной сушилке. Получают 0,6 г низкомолекулярного хитозана в виде белого водорастворимого порошка.

Изучение эффективности проведено аналогично примеру 1 на нелинейных мышах альбиносах, облученных в дозе 8,0 Гр: к концу срока наблюдения (30 суток) из 11 защищенных хитозаном мышей выжило 10, в контроле из десяти - одна.

Пример 3.

Растворяют 1 г хитозана креветки со СД 75% и ММ 250 кДа в 100 мл 0,3 М ацетата натрия при рН 4,5. Раствор нагревают до температуры 40^oС, добавляют фильтрат культуральной жидкости Streptomyces kurssanovii (2 единицы активности) и инкубируют 45 минут при той же температуре. Затем гидролизат выдерживают 7 минут на кипящей бане, охлаждают, концентрируют на роторном испарителе до объема 10 мл, фильтруют и наносят на хроматографическую колонку с сорбентом Фрактогель HW-50, уравновешенную 0,05 М ацетатом натрия при рН 5,5. Проводят элюцию тем же раствором, выделяя фракции с ММ 8-12 кДа, которые объединяют, диализуют против воды и лиофильно высушивают.

Получают 0,5 г низкомолекулярного хитозана в виде белого порошка, растворимого в воде.

Эффективность полученного хитозана изучена аналогично примеру 2. Введение хитозана до облучения способствовало выживанию 8 мышей из 10, при этом в контроле пали все 10 мышей.

Пример 4

Аналогично примеру 1, однако берут хитозан со СД 95% и ММ 200 кДа.

Получают 0,6 г низкомолекулярного хитозана.

Пример 5

Аналогично примеру 1, однако берут фермент в количестве 0,5 единиц и время гидролиза составляет 50 минут.

Получают 0,7 г низкомолекулярного хитозана.

Пример 6

Аналогично примеру 1, только хитозан растворяют при рН 4,5, при этом же значении и проводят гидролиз в течение 40 минут.

Получают 0,6 г низкомолекулярного хитозана.

Пример 7

Аналогично примеру 1, только хитозан берут со СД 70% и процесс гидролиза проводят 45 минут.

Получают 0,5 г низкомолекулярного хитозана.

Противолучевая активность образцов, полученных в примерах 4-7, изучена в четырех последовательных сериях экспериментов на нелинейных мышах аналогично примеру 2. Выживаемость животных, защищенных хитозаном, составила 87%, 75%, 80% и 90% при практически полной гибели в контроле.

Предложенный способ экологически безопасен, менее трудоемок по сравнению с известными способами и позволяет получать продукт высокого качества с выходом 50-70%.

Источники информации

1. Allan G.C., Ryan C.A.// Carbohydr. Res. 1995. V.277. N 2. Р.257-272.

2. Варламов В.П., Стояченко И.А., Буданов М.В. Способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана. Патент РФ N 2073016, Бюлл. 4, 1997.